Name: Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę hybrydyzacji in situ w zarodkach Danio rerio, która zwiększa wykrywalność słabo ekspresowanych transkryptów i redukuje sygnały niespecyficzne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opracowaliśmy ulepszone metody wizualizacji RNA z wysoką rozdzielczością. Procedury hybrydyzacji in situ przeprowadza się przy użyciu prostych, wykonanych na zamówienie koszy z porowatym dnem (ryc. 1). Zarodki są przetwarzane przy użyciu roztworów wolnych od RNaz na płytkach 6-dołkowych w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach.
Do segregacji zarodków wykonuje się kosze z różnokolorowych probówek Eppendorfa. Koszyczki z obrzeżem lub bez niego służą do łatwej ori...

Danio rerio (danio rerio) stał się potężnym modelem zwierzęcym do badań nad rozwojem kręgowców, chorobami, zachowaniem i badaniami przesiewowymi w lekach1-3. Zarodki danio pręgowanego można uzyskać w dużych ilościach z jednego krzyżowania. Zapłodnienie i rozwój następuje ex utero, a optycznie czyste zarodki szybko się rozwijają. Krytyczne zdarzenia rozwojowe występują w ciągu pierwszych 48 godzin po zapłodnieniu (hpf). Obejmuje to pojawienie się zawiązków narządów i inicjację cytoróżnicowania. Knockdown lub nadekspresję białek można osiągnąć poprzez mikroiniekcję zarodków z oligonukleotydami antysensownego morfolinukleotydu (MO) lub mRNA odpowiednio w stadium jednej lub dwóch komórek (0,75 hpf).
ŻYCZENIE embrionów danio pręgowanego ułatwia badanie czasoprzestrzennej ekspresji konkretnych genów będących przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie techniki WISH po mikroiniekcji zarodków z mRNA lub MO w celu nadekspresji lub obniżenia określonych poziomów białka ujawnia zróżnicowaną regulację innych genów.
Zmiany we wzorcach ekspresji genów mogą być skorelowane ze zmianami fenotypowymi i ujawnić funkcję docelowych genów podczas wczesnej organogenezy. Ponieważ sondy mogą być przygotowywane i przechowywane z wyprzedzeniem, technika ISH może być stosowana do ujawniania wzorców ekspresji genów dla co najmniej 20 genów jednocześnie przy użyciu sześciodołkowych płytek i specjalnie wykonanych koszy.

<table><tbody><tr><td>Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania TopoTA - Podwójny promotor pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ Mini zestaw do oczyszczania plazmidu</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 i enzymy restrykcyjne HindIII</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>Nasycony buforem fenol, ultraczysty</td><td>Invitrogen</td><td>15513039</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C. Działa drażniąco na oczy, skórę i drogi oddechowe i podejrzewa się działanie rakotwórcze. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z produktem.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>Toksyczny i podejrzany czynnik rakotwórczy. Praca pod wyciągiem.</td></tr><tr><td>DNA wolne od RNaz I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Przygotuj małe porcje i przechowuj w temperaturze -20&C.</td></tr><tr><td>Znakowanie DIG-RNA Mieszaj z polimerazą RNA Sp6, T7 i T3</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3,0 M octan sodu (pH 5,5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Alkohole</td><td></td><td></td>handlowe</tr><tr><td>Pirowęglan dietylu (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>DEPC działa drażniąco na oczy, skórę i drogi oddechowe. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Używaj okularów ochronnych, rękawic i maski.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M (pH 8,0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr>Błyskawiczne <td>systemy akwariowe</td><td>z solą oceaniczną</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Przygotuj i przechowuj w temperaturze -20&deg; C jako 40 ml podwielokrotności do późniejszego wykorzystania. PFA jest toksyczny. Używaj okularów ochronnych, rękawic i maski przeciwpyłowej.</td></tr><tr><td>Fenylotiokarbomid (PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC jest wysoce toksyczny. Używaj okularów ochronnych, rękawic i maski przeciwpyłowej.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (Zegarmistrz' s) Kleszcze wzór nr 5</td><td>Narzędzia</td><td></td><td></td>do nauki</tr> o napięciu <tr><td>Sześciodołkowy klaster do hodowli komórkowych</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Kosze wykonane są z siatki nylonowej i probówek Eppendorfa</td><td>Przygotowanie</td><td></td> we własnym zakresie <td>Aby zrobić kosze, należy wyciąć probówki Eppendorfa (1,5 ml) z brzegami lub bez, aby usunąć stożkowy koniec. Pokrój nylonową siatkę na małe kawałki odpowiadające rozmiarowi&nbsp; odcięte końce rurek Eppendorf. Umieść rurki z nylonową siatką zakrywającą odcięty koniec na elektrycznym&nbsp; płyta grzejna, aż zarówno rurka, jak i siatka nylonowa skleją się ze sobą (przeprowadzić w dygestorium). Odetnij nadmiar siatki od koszy i przechowuj je w 100% metanolu do momentu użycia.</td></tr><tr><td>Monolaurynian polioksyetylenosorbitanu (Tween 20)</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamid o wysokiej czystości</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 Żywica</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy jednowodny</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Bufor solno-sodowy cytrynianu sodu (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>tRNA z drożdży piekarskich typ X</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek lewamizolu</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid bezwodny (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>Drażniący, toksyczny, palny i podejrzewany teratogen. Trzymaj się w odpowiednim stroju ochronnym, w tym rękawicach i okularach.</td></tr><tr><td>Fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolylowy (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>Chronić ten roztwór przed światłem.</td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>Chroń ten roztwór przed światłem.</td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej, oczyszczona frakcja V (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Owcza anty-digoksygenina-AP Fab Fragments</td><td>Roche</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg(mnx1:GFP)ml2</td><td></td></tr><tr><td>Natychmiastowe</td><td>systemy akwariowe</td><td>Ocean N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Ten artykuł skupia się na hybrydyzacji in situ (WISH) zarodków danio pręgowanego. Technologia WISH ułatwia ocenę ekspresji genów zarówno pod kątem rozmieszczenia w tkankach, jak i etapu rozwoju. Opisano protokoły stosowania WISH na zarodkach danio pręgowanego przy użyciu antysensownych sond RNA znakowanych digoksygeniną. Sondy są generowane przez włączenie nukleotydów połączonych z digoksygeniną poprzez transkrypcję in vitro matryc genów, które zostały sklonowane i zlinearyzowane. Kosmówka zarodków pobranych w określonych stadiach rozwojowych jest usuwana przed inkubacją za pomocą specjalnych sond. Po procedurze mycia w celu usunięcia nadmiaru sondy, zarodki są inkubowane z przeciwciałem anty-digoksygeninowym sprzężonym z fosfatazą alkaliczną. Stosując chromogenny substrat dla fosfatazy alkalicznej, można ocenić specyficzną ekspresję genów. W zależności od poziomu ekspresji genów cała procedura może zostać zakończona w ciągu 2-3 dni.

Stosując protokół z 50 embrionami w koszyku (na gen/na warunek eksperymentalny), wzór ekspresji danego genu można uzyskać w ramach jednego eksperymentu. Prawie wszystkie embriony wykazują podobne wzory ekspresji dla konkretnego genu. Reprezentatywne przykłady barwienia w hybrydyzacji in situ przedstawiono na Rysunkach 3-6.
Zarówno sondy sensowne, jak i antysensowne zostały zsyntetyzowane z cDNA odpowiadających PC5.1, PC5.26, SCL/tal-17, gata-1<su...

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena przestrzennej czasowej ekspresji określonych genów będących przedmiotem zainteresowania w zarodkach danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez pierwsze wygenerowanie sond CD NA poprzez włączenie tlenu digo do połączonych nukleotydów za pomocą transkrypcji in vitro. Następnie zarodki są pobierane w określonych stadiach rozwoju.Corium jest usuwane, a zarodki są przechowywane w metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie, po trawieniu i po utrwaleniu, zarodki są hybrydyzowane za pomocą odpowiednich sond. Na koniec zarodki są barwione genem antydy i przeciwciałami, a sygnał rozwijany jest za pomocą substratów fosfatazy alkalicznej.Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują tkankowy rozkład ekspresji genów na danym etapie rozwoju poprzez hybrydyzację in situ całego montażu i obrazowanie. Chociaż metoda ta może dostarczyć znacznie lepszego wglądu w normalną ekspresję genu docelowego, może być również stosowana do innych warunków, takich jak ekspresja genu docelowego w modelu choroby oraz gdy inne geny są nadmiernie lub niedostatecznie wyrażone. Korzystając z technologii mikroiniekcji Używając CDNA dla interesującego genu, ustaw reakcję znakowania RNA w celu syntezy tlenu digo W znakowanych sondach RNA w fiolce reakcyjnej wolnej od RNA, dodając od jednego do pięciu mikrogramów oczyszczonego matrycowego DNA do sterylnego RNA wolnego od podwójnie destylowanej wody destylowanej o objętości do 13 mikrolitrów.Schłodzić reakcję na lodzie i dodać następujące odczynniki po delikatnym wymieszaniu, odwirować 2000 obr./min przez 30 sekund w temperaturze pokojowej przed inkubacją reakcji przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, po inkubacji usunąć matrycę DNA, dodając dwa mikrolitry wolnego RNA. DNA jeden inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zatrzymać reakcję przez dodanie dwóch mikrolitrów 0,2 molowego EDTA, wytrącić produkty reakcji przez dodanie 2,5 mikrolitra czterech molowych chlorków litu i 75 mikrolitrów 100% etanolu. Wymieszaj roztwór i inkubuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 45 minut lub przez noc.Wirować zawiesinę przez 30 minut przy 13 000 obr./min i czterech stopniach Celsjusza. Następnie umyj granulat lodowatym 70% etanolem po wirowaniu przez 10 minut. Suszyć osad przez dwie minuty przed resusem, zawieszając go w 50 mikrolitrach nukleazy, wolnej podwójnie destylowanej wody.Następnie inkubuj go przez 30 minut. W temperaturze 37 stopni Celsjusza uruchom jeden do dwóch mikrolitrów sondy na 1% żelu aros przez około 30 minut, aby sprawdzić jego jakość i integralność. Następnie użyj spektrofotometru, aby określić ilościowo sondę, aby nawodnić wcześniej utrwalone i zamrożone zarodki.Zacznij od zrobienia koszy, odcinając stożkowe końce mikrorurek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie zdejmij górne felgi z połowy z nich. Wytnij małe kawałki nylonowej siatki, aby zakryć końce, a następnie w kilku kapturach podgrzej końce rurki na elektrycznej płycie grzejnej i wciśnij je w siatkę po ostygnięciu.Usuń nadmiar nylonowej siatki i przechowuj kosze w 100% metanolu w temperaturze pokojowej. Po przygotowaniu kolejnych rozcieńczeń metanolu w PBS, zgodnie z protokołem tekstowym i dodaniu czterech mililitrów każdego z nich do studzienek na sześciostudziennej szalce, umieścić zarodki w oddzielnych koszach dla każdej sondy i inkubować je w serii PBS metanolu przez pięć minut na studzienkę, kończąc trzema płukaniami w PBST. Opatruj zarodki proteinazą K w temperaturze pokojowej, stosując następujące czasy inkubacji dla każdego etapu rozwoju.Następnie utrwal zarodki w 4% aldehydzie paraform w PBS przez 20 minut i umyj je w PBST trzy razy przez pięć minut każdy. Następnie przygotuj mieszaninę acetylacyjną zgodnie z protokołem tekstowym i inkubuj zarodki dwa razy po 10 minut każdy. Następnie umyj zarodki i PBST dwa razy przez 10 minut każdy.Przenieś zarodki do sterylnych mikroprobówek i inkubuj z 200 mikrolitrami mieszaniny hybrydyzacyjnej lub HM w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin. Dodać od 100 do 200 nanogramów sondy do roztworu i inkubować przez noc w temperaturze 70 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Zastąp roztwór sondy wstępnie podgrzanym HM i inkubuj próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut.Po przepuszczeniu próbek przez serię H-M-S-S-C i zablokowaniu zarodków zgodnie z protokołem tekstowym, inkubować zarodki w rozcieńczeniu od 1 do 5 000 przeciwciał anty-D AP w buforze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem następnego dnia. Umyj zarodki sześć razy po 15 minut każdy. Po wstępnym wybarwieniu zarodków należy je inkubować w BCIP i NBT.Dodaj temperaturę pokojową w ciemności przez 30 minut. Użyj mikroskopu stereoskopowego do monitorowania reakcji barwienia co 30 minut, aby zatrzymać reakcję. Przenieść kosze z zarodkami do studzienek zawierających roztwór zatrzymujący dwa razy po 10 minut, z delikatnym mieszaniem.Po utrwaleniu zarodków za pomocą 4% para formaldehydu w PBS przez 20 minut. Zamontuj zarodki, przenosząc je w jak najmniejszej ilości PBS do sześciodołkowych płytek zawierających 100% glicerolu. Delikatnie kołysz zarodkami w ciemności w temperaturze pokojowej, przez noc obraz w 100% glicerolu pod mikroskopem stereoskopowym.Reprezentatywne przykłady barwienia situ do hybrydyzacji przedstawiono tutaj. Fioletowe zabarwienie obserwowane po hybrydyzacji z sondą rybo, która jest przedmiotem zainteresowania, reprezentuje zarówno obfitość, jak i miejsca ekspresji określonego genu. Na przykład PC 5.1 wykazuje bardzo dyskretną ekspresję w przedniej i tylnej części pęcherzyka usznego i pierwotnej linii bocznej po 24 godzinach od zapłodnienia i jest silnie zlokalizowany w przednich i tylnych bocznych mastach neurologicznych po 72 godzinach od zapłodnienia.W przeciwieństwie do tego, PC 5.2 wykazuje wszechobecną ekspresję w OUN z wyraźną regionalizacją w obrębie pęcherzyka somitowego i podatnego przewodu frytkowego i jest wysoce eksprymowany w wątrobie i jelicie po 96 godzinach od zapłodnienia. Brak ekspresji genów podczas korzystania z odpowiednich sond Ribo służy jako kontrola negatywna, jak widać tutaj. Analizy ekspresji markerów krwi wykazały barwienie SCL T one w obustronnych komórkach czaszki oraz w pośredniej masie komórkowej lub ICM.Chociaż barwienie gata one jest również widoczne w ICM, wzorzec ekspresji jest inny. Ekspresję F-L-K-K-D-R-L zaobserwowano w obrębie tylnego mózgu głównego i naczyń międzysegmentowych, a w ICM barwienie dla jeża sonicznego zaobserwowano w obrębie bez pępowiny. W tych przykładach ekspresja DLX dwa po 34 godzinach od zapłodnienia jest zlokalizowana w łukach mezenchymalnych Talon Cephalon, podwzgórzu i czaszki oraz w FK D seven Fox, jedna ekspresja po 24 godzinach po zapłodnieniu jest widoczna głównie w płytce podłogowej i ekspresji HypoChlor.Wzorce markerów trzustkowych wykazały barwienie insuliną w endokrynnej trzustce i trypsyną w zewnątrzwydzielniczej trzustce. Wyniki pokazujące wzorce ekspresji z wysoką rozdzielczością potwierdzają sukces przedstawionego protokołu wykrywania ekspresji zarówno genów o wysokiej, jak i niskiej liczebności. Oto kilka przykładów z eksperymentów przeprowadzonych w optymalnych warunkach.Na przykład, wysoki sygnał tła ze słabą ekspresją dźwięku jeża wynikał z nieodpowiedniej, przepuszczalnej i hybrydyzacji między 55 a 60 stopniami Celsjusza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać całe mocowanie w dwóch hybrydyzacjach zarodków zebry zebry za pomocą sond RNA oznaczonych rowem, barwienia po hybrydyzacji i obrazowania.

high-resolution-whole-mount-situ-hybridization-within-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysoka Rozdzielczość Całkowite Montowanie In Situ Hybrydyzacji w Zarodkach Rybki Zebrowanej w Celu Badania Ekspresji i Funkcji Genów

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.

Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia rozwoju nerek. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania ekspresji genów u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros.

In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Poznaj ulepszoną metodę hybrydyzacji in situ w zarodkach Danio rerio, która zwiększa wykrywalność słabo ekspresowanych transkryptów i redukuje sygnały niespecyficzne.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Przeglądaj więcej filmów