Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Ogólnym celem tej procedury jest ocena przestrzennej czasowej ekspresji określonych genów będących przedmiotem zainteresowania w zarodkach danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez pierwsze wygenerowanie sond CD NA poprzez włączenie tlenu digo do połączonych nukleotydów za pomocą transkrypcji in vitro. Następnie zarodki są pobierane w określonych stadiach rozwoju.

Corium jest usuwane, a zarodki są przechowywane w metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie, po trawieniu i po utrwaleniu, zarodki są hybrydyzowane za pomocą odpowiednich sond. Na koniec zarodki są barwione genem antydy i przeciwciałami, a sygnał rozwijany jest za pomocą substratów fosfatazy alkalicznej.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują tkankowy rozkład ekspresji genów na danym etapie rozwoju poprzez hybrydyzację in situ całego montażu i obrazowanie. Chociaż metoda ta może dostarczyć znacznie lepszego wglądu w normalną ekspresję genu docelowego, może być również stosowana do innych warunków, takich jak ekspresja genu docelowego w modelu choroby oraz gdy inne geny są nadmiernie lub niedostatecznie wyrażone. Korzystając z technologii mikroiniekcji Używając CDNA dla interesującego genu, ustaw reakcję znakowania RNA w celu syntezy tlenu digo W znakowanych sondach RNA w fiolce reakcyjnej wolnej od RNA, dodając od jednego do pięciu mikrogramów oczyszczonego matrycowego DNA do sterylnego RNA wolnego od podwójnie destylowanej wody destylowanej o objętości do 13 mikrolitrów.

Schłodzić reakcję na lodzie i dodać następujące odczynniki po delikatnym wymieszaniu, odwirować 2000 obr./min przez 30 sekund w temperaturze pokojowej przed inkubacją reakcji przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, po inkubacji usunąć matrycę DNA, dodając dwa mikrolitry wolnego RNA. DNA jeden inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zatrzymać reakcję przez dodanie dwóch mikrolitrów 0,2 molowego EDTA, wytrącić produkty reakcji przez dodanie 2,5 mikrolitra czterech molowych chlorków litu i 75 mikrolitrów 100% etanolu. Wymieszaj roztwór i inkubuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 45 minut lub przez noc.

Wirować zawiesinę przez 30 minut przy 13 000 obr./min i czterech stopniach Celsjusza. Następnie umyj granulat lodowatym 70% etanolem po wirowaniu przez 10 minut. Suszyć osad przez dwie minuty przed resusem, zawieszając go w 50 mikrolitrach nukleazy, wolnej podwójnie destylowanej wody.

Następnie inkubuj go przez 30 minut. W temperaturze 37 stopni Celsjusza uruchom jeden do dwóch mikrolitrów sondy na 1% żelu aros przez około 30 minut, aby sprawdzić jego jakość i integralność. Następnie użyj spektrofotometru, aby określić ilościowo sondę, aby nawodnić wcześniej utrwalone i zamrożone zarodki.

Zacznij od zrobienia koszy, odcinając stożkowe końce mikrorurek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie zdejmij górne felgi z połowy z nich. Wytnij małe kawałki nylonowej siatki, aby zakryć końce, a następnie w kilku kapturach podgrzej końce rurki na elektrycznej płycie grzejnej i wciśnij je w siatkę po ostygnięciu.

Usuń nadmiar nylonowej siatki i przechowuj kosze w 100% metanolu w temperaturze pokojowej. Po przygotowaniu kolejnych rozcieńczeń metanolu w PBS, zgodnie z protokołem tekstowym i dodaniu czterech mililitrów każdego z nich do studzienek na sześciostudziennej szalce, umieścić zarodki w oddzielnych koszach dla każdej sondy i inkubować je w serii PBS metanolu przez pięć minut na studzienkę, kończąc trzema płukaniami w PBST. Opatruj zarodki proteinazą K w temperaturze pokojowej, stosując następujące czasy inkubacji dla każdego etapu rozwoju.

Następnie utrwal zarodki w 4% aldehydzie paraform w PBS przez 20 minut i umyj je w PBST trzy razy przez pięć minut każdy. Następnie przygotuj mieszaninę acetylacyjną zgodnie z protokołem tekstowym i inkubuj zarodki dwa razy po 10 minut każdy. Następnie umyj zarodki i PBST dwa razy przez 10 minut każdy.

Przenieś zarodki do sterylnych mikroprobówek i inkubuj z 200 mikrolitrami mieszaniny hybrydyzacyjnej lub HM w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin. Dodać od 100 do 200 nanogramów sondy do roztworu i inkubować przez noc w temperaturze 70 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Zastąp roztwór sondy wstępnie podgrzanym HM i inkubuj próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po przepuszczeniu próbek przez serię H-M-S-S-C i zablokowaniu zarodków zgodnie z protokołem tekstowym, inkubować zarodki w rozcieńczeniu od 1 do 5 000 przeciwciał anty-D AP w buforze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem następnego dnia. Umyj zarodki sześć razy po 15 minut każdy. Po wstępnym wybarwieniu zarodków należy je inkubować w BCIP i NBT.

Dodaj temperaturę pokojową w ciemności przez 30 minut. Użyj mikroskopu stereoskopowego do monitorowania reakcji barwienia co 30 minut, aby zatrzymać reakcję. Przenieść kosze z zarodkami do studzienek zawierających roztwór zatrzymujący dwa razy po 10 minut, z delikatnym mieszaniem.

Po utrwaleniu zarodków za pomocą 4% para formaldehydu w PBS przez 20 minut. Zamontuj zarodki, przenosząc je w jak najmniejszej ilości PBS do sześciodołkowych płytek zawierających 100% glicerolu. Delikatnie kołysz zarodkami w ciemności w temperaturze pokojowej, przez noc obraz w 100% glicerolu pod mikroskopem stereoskopowym.

Reprezentatywne przykłady barwienia situ do hybrydyzacji przedstawiono tutaj. Fioletowe zabarwienie obserwowane po hybrydyzacji z sondą rybo, która jest przedmiotem zainteresowania, reprezentuje zarówno obfitość, jak i miejsca ekspresji określonego genu. Na przykład PC 5.1 wykazuje bardzo dyskretną ekspresję w przedniej i tylnej części pęcherzyka usznego i pierwotnej linii bocznej po 24 godzinach od zapłodnienia i jest silnie zlokalizowany w przednich i tylnych bocznych mastach neurologicznych po 72 godzinach od zapłodnienia.

W przeciwieństwie do tego, PC 5.2 wykazuje wszechobecną ekspresję w OUN z wyraźną regionalizacją w obrębie pęcherzyka somitowego i podatnego przewodu frytkowego i jest wysoce eksprymowany w wątrobie i jelicie po 96 godzinach od zapłodnienia. Brak ekspresji genów podczas korzystania z odpowiednich sond Ribo służy jako kontrola negatywna, jak widać tutaj. Analizy ekspresji markerów krwi wykazały barwienie SCL T one w obustronnych komórkach czaszki oraz w pośredniej masie komórkowej lub ICM.

Chociaż barwienie gata one jest również widoczne w ICM, wzorzec ekspresji jest inny. Ekspresję F-L-K-K-D-R-L zaobserwowano w obrębie tylnego mózgu głównego i naczyń międzysegmentowych, a w ICM barwienie dla jeża sonicznego zaobserwowano w obrębie bez pępowiny. W tych przykładach ekspresja DLX dwa po 34 godzinach od zapłodnienia jest zlokalizowana w łukach mezenchymalnych Talon Cephalon, podwzgórzu i czaszki oraz w FK D seven Fox, jedna ekspresja po 24 godzinach po zapłodnieniu jest widoczna głównie w płytce podłogowej i ekspresji HypoChlor.

Wzorce markerów trzustkowych wykazały barwienie insuliną w endokrynnej trzustce i trypsyną w zewnątrzwydzielniczej trzustce. Wyniki pokazujące wzorce ekspresji z wysoką rozdzielczością potwierdzają sukces przedstawionego protokołu wykrywania ekspresji zarówno genów o wysokiej, jak i niskiej liczebności. Oto kilka przykładów z eksperymentów przeprowadzonych w optymalnych warunkach.

Na przykład, wysoki sygnał tła ze słabą ekspresją dźwięku jeża wynikał z nieodpowiedniej, przepuszczalnej i hybrydyzacji między 55 a 60 stopniami Celsjusza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać całe mocowanie w dwóch hybrydyzacjach zarodków zebry zebry za pomocą sond RNA oznaczonych rowem, barwienia po hybrydyzacji i obrazowania.