Name: Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę hodowli embrionalnych komórek C. elegans in vitro, umożliwiającą badanie ekspresji genów w sposób komórkowo-specyficzny. Technika ta wspiera rozwój neurobiologii i biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gwiazdki (*) wskazują nowe lub zmodyfikowane kroki w porównaniu do Christensena i wsp.1
1. Ustawienia materiału
<ol>
	<li>Procedura hodowli komórkowej wymaga dużych ilości jaj wyizolowanych od grawitacyjnych osobników dorosłych. Uprawiaj C. elegans na 8P płytki agarowe obsiane bakteriami NA22 (dostępnymi za pośrednictwem C. elegans Genetic Consortium - CGC) w celu wyizolowania dużych ilości jaj. W tych płytkach ilość użytego peptonu jest 8 razy większa niż zwykle używana w płytkach NGM. Wyższe stężenie peptonów efektywniej podtrzymuje wzrost bakterii NA22, które w przeciwieństwie do OP50-, rosną w grubych warstwach.</li>
</ol>
8P przepis na talerze:
Rozpuść 3 g NaCl, 20 g Bacto-Pepton, 25 g agaru w 1 L sterylnej wody destylowanej i autoklaw przez 30 min. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia w temperaturze 55 °C, a następnie dodać sterylnie przefiltrowany 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w EtOH), 1 ml 1 MgCl2, 1 mlMgSO4 i 25 ml buforu KP (zapas 500 ml: 5 g K2HPO4, 30 g KH2PO4, pH 6,00). Wlej płynną pożywkę agarową do 10 cm szalek Petriego (25 ml/talerz).
<ol start="2">
	<li>Następnego dnia rozprowadź całą powierzchnię każdej wzbogaconej płytki agaru peptonowego 1 ml NA22 E. coli hodowanej przez noc w pożywce 2XYT (16 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl w 1 l sterylnej wody, pH 7,0) w temperaturze 37 °C. Bakterie te stanowią obfite źródło pożywienia, które tworzy grubą warstwę wspierającą wzrost dużych ilości grawitacyjnych osobników. Pozostaw talerze z nasionami na noc w temperaturze pokojowej, aby umożliwić rozwój bakterii. Proces ten można przyspieszyć poprzez inkubację w temperaturze 37 °C przez 4-5 godzin.</li>
	<li>Przenieś wygłodzone zwierzęta do zasiewu 8P Płyty. Zmyć zwierzęta z wygłodzonej płytki NGM za pomocą 5-6 ml buforu M9 lub wody i dodać 1-2 ml tej zawiesiny do każdego 8P talerz.</li>
	<li>Pozwól zwierzętom na wzrost i rozmnażanie się, aż płytki zostaną wypełnione w momencie zbiegu przez grawitujące dorosłe osobniki.</li>
	<li>Wyizolować jaja potrzebne do przygotowania komórek zarodkowych C. elegans od grawitacyjnych osobników dorosłych, używając 5-6 ml roztworu do lizy.</li>
</ol>
Przepis na roztwór do lizy
5 ml Fresh Bleach, 1,25 ml 10 N NaOH i 18,5 ml sterylnegoH2O. Mieszanina ta musi być przygotowana na świeżo przed każdym użyciem.
<ol start="6">
	<li>Umyj jaja odizolowane od grawitych dorosłych osobników za pomocą bufora do jaj:</li>
</ol>
Przepis na bufor jaj
118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolarność 340 mOsm.
<ol start="7">
	<li>Usuń skorupkę jajka, która otacza jaja, podając je chitynazie. Chitynaza jest enzymem o najwyższej aktywności przy kwaśnym pH 25. Rozpuścić chitynazę (Sigma, nr katalogowy C6137) w buforze jajowym o pH 6,5 w końcowym stężeniu 2 mg/ml. Przechowywać roztwór podstawowy chitynazy w temperaturze -20 °C w 1 ml podwielokrotności w sterylnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.</li>
	<li>Hodować komórki C. elegans na autoklawowanych szkiełkach nakrywkowych (o średnicy 12 mm) pokrytych lektyną z orzeszków ziemnych. Lektynę z orzeszków ziemnych rozpuścić w sterylnej wodzie (0,5 mg/ml). Roztworu lektyny z orzeszków ziemnych nie należy filtrować ani sterylizować w autoklawie. Nie trzeba go również traktować światłem UV. Przechowywać 2 ml porcji w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Kompletna pożywka do hodowli komórkowych (500 ml) zawiera 500 ml pożywki L-15 firmy Gibco, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (inaktywowanej termicznie), 7,7 g sacharozy (45 mOsm), 5 ml 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (2%). Całe podłoże jest następnie filtrowane za pomocą filtra porowego 0,20 μm.</li>
</ol>
Zauważ, że bufor jaj i pożywka hodowlana mają osmolarność odpowiednio 340 i 345 mOsm. Rzeczywiście, w przeciwieństwie do komórek ssaków, komórki C. elegans mają stosunkowo wysoką osmolarność, którą należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania roztworów, które będą miały bezpośredni kontakt z błoną plazmatyczną komórek. Receptury tych odczynników dostosowano tak, aby osiągnąć pożądaną osmolarność, którą zmierzono za pomocą osmometru 1. Nie jest konieczne używanie osmometru, jeśli te przepisy są dokładnie przestrzegane i należy zachować ostrożność przy przygotowywaniu tych odczynników. Należy jednak użyć osmotera, jeśli konieczne jest przygotowanie innych roztworów, których receptury nie są podane tutaj ani w żadnej z publikacji, w których wykorzystuje się hodowane komórki C. elegans.
2. Izolacja jaj
<ol>
	<li>Zaleca się rozpoczęcie od co najmniej czterech 8P płytki do zebrania wystarczającej ilości jaj do 12 dołków hodowanych komórek (na płytkach 24-dołkowych).</li>
	<li>Przed rozpoczęciem zabiegu rozmrozić jedną tubkę roztworu podstawowego lektyny z orzeszków ziemnych. Umieścić autoklawowane szkiełka nakrywkowe na dnie studzienek na 24-dołkowej płytce i dodać do nich 200 μl lektyny z orzeszków ziemnych. Inkubować przez 1 godzinę lub do momentu, gdy komórki będą gotowe do posiewu. Całkowicie usuń lektynę z orzeszków ziemnych i umyj studzienki raz 1 ml sterylnej wody sterylizowanej w autoklawie. Całkowite usunięcie lektyny z orzeszków ziemnych ze szkiełek nakrywkowych jest niezbędne do uniknięcia zbrylania się komórek.</li>
	<li>Zmyj ciężarne dorosłe osobniki z płytek agarowych sterylną wodą w autoklawie. Zebrać zawiesinę do dwóch sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Pozostaw probówki na lodzie na maksymalnie 5 minut, aby umożliwić wytrącenie się robaków na dnie probówek (*). Usuń wodę za pomocą plastikowej pipety transferowej i zastąp ją świeżą, sterylną, autoklawowaną wodą. Robaki granulowane przez wirowanie na stole przy 200 x g (~1,200 obr./min) przez 10 min (*). Powtórz ten ostatni krok co najmniej 3.</li>
	<li>Przenieś robaki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i granuluj je w ilości 200 x g (~1,200 obr./min) przez 10 minut (*). Nie używaj większej prędkości wirowania, aby uniknąć gromadzenia się bakterii również na dnie probówki. Czasami po odwirowaniu robaki nie są całkowicie granulowane. Po każdym przemyciu, a przed usunięciem supernatantu, umieść probówki na 5 minut na lodzie. W schłodzonej wodzie robaki wytrącają się na dno rurki.</li>
	<li>Usuń wodę i dodaj 5-6 ml roztworu do lizy (patrz Przygotowanie materiału). Delikatnie kołysz zawiesiną przez 5-10 minut, a następnie rozpocznij monitorowanie lizy robaków pod mikroskopem stereoskopowym co 2-3 minuty. Kroplę zawiesiny można również umieścić na szkiełku nakrywkowym w celu łatwiejszej kontroli. Czas inkubacji różni się w zależności od świeżości wybielacza; Kupuj małe butelki wybielacza i co miesiąc otwieraj nową butelkę.</li>
	<li>Gdy ~70-80% robaków zostanie poddanych lizie (10 minut od początku inkubacji), zatrzymaj reakcję lizy, dodając 9 ml buforu jajowego o pH 7,3 (patrz Przygotowanie materiału). Odwirować zawiesinę przy 200 x g (~1 200 obr./min) przez 10 min. Od tego momentu należy mieć włączony palnik Bunsena na stole, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu jaj (*).</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą sterylnej plastikowej pipety transferowej i przemyć osad 3-4x buforem do jaj, aż roztwór będzie klarowny. Upewnij się, że dobrze wymieszałeś granulki w buforze do jaj podczas każdego mycia.</li>
	<li>Jaja oddziela się od tusz zwierzęcych za pomocą 30% roztworu sacharozy. Zawiesić osad w 2 ml sterylnego buforu do jaj i dodać 2 ml 60% roztworu sacharozy (zapas w sterylnym buforze do jaj). Dobrze wymieszać i odwirować przez 20 minut przy 200 x g (~1,200 obr./min) (*).</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki. Jaja unoszą się na górze roztworu. Za pomocą pipety P1000 i sterylnych końcówek przenieś wszystkie jaja do świeżej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 10 ml sterylnego buforu do jaj do probówki i wirować przy 200 x g (~1,200 obr./min) przez 10 min. Powtórzyć mycie 3 razy. Upewnij się, że jaja są całkowicie zawieszone w buforze jaj podczas każdego mycia.</li>
</ol>
3. Dysocjacja komórek embrionalnych
Przeprowadź następne kroki procedury w sterylnych warunkach, używając okapu z przepływem laminarnym. Podczas gdy zwierzęta są ubrane na talerzach bakteryjnych, mycie i leczenie roztworem do lizy zawierającym wybielacz powinno wyeliminować większość, jeśli nie wszystkie bakterie. W ten sposób użycie kaptura laminarnego na tym etapie procedury zapobiega ponownemu zanieczyszczeniu zawiesiny jaj.
<ol>
	<li>Zawiesić jaja granulowane w 1 ml chitynazy o stężeniu 2 mg/ml (zapas w buforze jaj o pH 6,5 (*)) i przenieść je do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Kołysz rurką przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej. Dokładny czas inkubacji zmienia się w zależności od świeżości enzymu i temperatury w pomieszczeniu i dlatego powinien być określony dla każdego preparatu. Zaleca się rozpoczęcie monitorowania jaj pod mikroskopem odwróconej hodowli komórkowej po 10 minutach inkubacji. Uwaga: z naszego doświadczenia wynika, że niskie pH zwiększa aktywność enzymatyczną chitynazy. Z tego powodu używamy buforu jaj o pH 6,5 do rozpuszczenia chitynazy (przepis opisany powyżej, gdzie pH dostosowuje się do 6,5 za pomocą NaOH).</li>
	<li>Gdy ~ 80% skorupek jaj zostanie strawionych przez obróbkę chitynazą (rysunki 1 A-B), jaja osadzać przez odwirowanie przy 900 x g (~2,500 obr./min) przez 3 minuty (*). Używając pipetora P1000 i sterylnych końcówek, ostrożnie usunąć supernatant i dodać 3 ml pożywki L-15 (*).</li>
	<li>Przenieś jaja na płytkę o średnicy 6 cm i delikatnie rozdziel komórki za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 18 G. Monitorować stopień dysocjacji, umieszczając kroplę zawiesiny na świeżej plastikowej szalce Petriego i oglądając pod mikroskopem. Nie należy zasysać powietrza do strzykawki podczas tej procedury, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Kontynuuj dysocjację, aż ~ 80% komórek zostanie zdysocjowanych.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę za pomocą sterylnego filtra miliporowego 5 μm. Zawiesiny komórkowe muszą być filtrowane w celu usunięcia grudek komórek, niestrawionych jaj i wyklutych larw. Przefiltruj dodatkowe 4-5 ml świeżej pożywki L-15 przez filtr, aby odzyskać wszystkie komórki. Nie używaj nadmiernej siły na etapie filtracji, aby uniknąć uszkodzenia filtra i/lub komórek.</li>
</ol>
4. Hodowla komórek
<ol>
	<li>Zdeocjowane komórki osadzać przez odwirowanie przy 900 x g (~2,500 obr./min) przez 3 minuty (*). Za pomocą pipetora P1000 i sterylnych końcówek ostrożnie usuń cały supernatant. Zawiesić granulowane komórki w kompletnym podłożu L-15 i płytce 1 ml/dołek. Ilość dodanego podłoża zależy od liczby 8P użytych płytek, zbieganie się robaków na płytkach oraz rodzaj eksperymentów, które zostaną przeprowadzone na komórkach. Gęstość komórek można określić za pomocą hemocytometru. W przypadku nagrań typu patch-clamp optymalna jest gęstość powlekania ~ 230 000 komórek/cm2.</li>
	<li>Przechowywać 24-dołkową płytkę w plastikowym pojemniku Tupperware zawierającym mokre ręczniki papierowe, aby uniknąć odparowania pożywki hodowlanej. Przechowywać pojemnik w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 20 °C i przy obecności powietrza atmosferycznego.</li>
	<li>Komórki są zwykle gotowe do eksperymentów w ciągu 24 godzin, kiedy różnicowanie morfologiczne i ekspresja markerów GFP są zakończone. Komórki można przechowywać w hodowli do 2 tygodni, ale zwykle są one najzdrowsze do 7-9 dni po posiewie. Pożywkę należy wymieniać raz dziennie, aby utrzymać zdrowe komórki.</li>
</ol>

C. elegans jest potężnym organizmem modelowym do rozszyfrowywania szlaków genetycznych zaangażowanych w rozwój, zachowanie i starzenie się. Jego wygoda wynika przede wszystkim z łatwości, z jaką można go genetycznie zmanipulować, oraz z jego krótkiego cyklu życia. Pomimo swojej wygody, C. elegans ma swoje ograniczenia. Komórki C. elegans są maleńkie i zamknięte w naskórku pod ciśnieniem, co ogranicza stosowanie metod wymagających bezpośredniego dostępu do komórek, takich jak techniki elektrofiz...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) to potężny organizm modelowy do badania molekularnych podstaw funkcji, różnicowania i zachowania komórek. Chociaż jego genom, szlaki metaboliczne i biosyntezy są podobne do kręgowców, jego podatność genetyczna i molekularna jest znacznie większa2. Do jego zalet należą wielkość i prosta anatomia, szybki cykl życia (3 dni w temperaturze 25 °C), krótka długość życia (2 tygodnie) i duża liczba potomstwa (200 >). Ze względu na jego hermafrodytyczny charakter i krótki cykl życiowy, manipulacje molekularne i genetyczne są proste w przypadku C. elegans, w tym tworzenie zwierząt transgenicznych 3,4 i stosowanie technik knock-downu genów, takich jak interferencja RNA5. Ciało i skorupka jaja C. elegans są przezroczyste. Dlatego komórki można łatwo uwidocznić zarówno u osoby dorosłej, jak i w zarodku za pomocą standardowej mikroskopii. W ciągu ostatnich 40 lat społeczność C. elegans stworzyła nieocenione zasoby do badań nad C. elegans, w tym dużą kolekcję mutantów, nokautów i transgeników, szczegółowy opis anatomii i rozwoju 6,7, w tym pełną rekonstrukcję układu nerwowego 8 oraz całkowicie zsekwencjonowany genom, który jest dobrze opisany i dostępny dla całej społeczności (<a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a>).
Pomimo licznych zalet, niektóre eksperymentalne podejścia były wyzwaniem dla C. elegans. Należą do nich te, które wymagają dostępu do błony komórkowej komórek i izolacji tkanek lub typów komórek. Rzeczywiście, tkanki C. elegans są zamknięte w szkielecie hydrostatycznym pod ciśnieniem, który nie jest łatwo trawiony przez obróbkę enzymatyczną lub detergenty. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych Miriam Goodman i Janet Richmond opracowały pionierskie metody elektrofizjologicznych zapisów neuronów i komórek mięśniowych C. elegans in situ. Chociaż metody te dostarczyły nam ważnych informacji na temat funkcji neuronów i mięśni in vivo, są one trudne i mają niską przepustowość. Opracowano alternatywne metody badania funkcji komórek in vivo, w szczególności obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu genetycznie kodowanych czujników wapnia, takich jak GCamP i cameleon 11-13. Metody te nie pozwalają jednak na stosowanie narzędzi farmakologicznych, ponieważ są one stosowane na nienaruszonych żywych zwierzętach.
Pierwsza próba hodowli komórek C. elegans in vitro na dużą skalę została podjęta przez Lairda Blooma podczas przygotowywania jego pracy doktorskiej 14. Niestety, trudności napotkane ze słabą przyczepnością komórek do podłoża, słabym różnicowaniem komórek i przeżywalnością uniemożliwiły ustanowienie tego wczesnego protokołu jako solidnej metody hodowli komórek. W 1995 roku Edgar i współpracownicy opublikowali procedurę badania podziału i morfogenezy komórek poprzez izolację i hodowlę pojedynczych zarodków C. elegans 15. Komórki embrionalne uzyskane przez trawienie skorupek jaj z kombinacją leczenia enzymatycznego i ręcznej dysocjacji kontynuowały proliferację, wytwarzając do ~500 komórek 15. Następnie Leung i współpracownicy wyhodowali niewielką liczbę blastomerów, aby zbadać morfogenezę jelit. Wykazali, że jeden z wyizolowanych in vitro E blastomerów wytwarza spolaryzowane komórki jelitowe, które tworzą strukturę analogiczną do światła jelita poprzez interakcję ze sobą poprzez wierzchołkowe połączenia adherensowe 16. Buechner i współpracownicy opisali również podobną metodę hodowli komórek embrionalnych C. elegans in vitro 17.
Na podstawie tej wczesnej pracy, Christensen i współpracownicy opracowali solidny protokół hodowli embrionalnych komórek C. elegans in vitro 1. Wykazali, że wyizolowane komórki C. elegans mogą różnicować się w różne typy komórek i zachowywać cechy, które posiadają in vivo, w tym ekspresję markerów specyficznych dla komórki. Kilka technik, które stanowią wyzwanie in vivo, można zastosować do izolowanych komórek embrionalnych C. elegans. Należą do nich techniki elektrofizjologiczne 1,18 19, obrazowanie i immunochemiczne 20,21, a także izolacja określonych typów komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) w celu budowy specyficznych dla komórki bibliotek cDNA 22,23. Techniki knockdownu genów, takie jak interferencja RNA (RNAi), mogą być stosowane na hodowanych komórkach C. elegans 1, a nowa metoda znakowania metabolicznego wykorzystująca cukier azydologiczny jako narzędzie do odkrywania glikoprotein została niedawno opracowana dla komórek C. elegans hodowanych in vitro 24.
Podsumowując, metoda hodowli komórkowej rozszerza wachlarz technik, które mogą być zastosowane do modelu C. elegans w celu rozszyfrowania funkcji genu w kontekście żywego organizmu. Opisujemy tutaj protokół hodowli komórek embrionalnych C. elegans in vitro, który jest w dużej mierze oparty na protokole opisanym po raz pierwszy przez Christiansena i współpracowników 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-382</td><td></td></tr><tr><td>Agar Difco Granulowany</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-784</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-284</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży baktonowych</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-724</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Płyn</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Invitrogen</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Chitynaza ze Streptomyces Griseus</td><td>Sigma</td><td>C6137-25UN</td><td></td></tr><tr><td>NA22 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Centrum</td><td></td><td></td>Genetyki</tr><tr><td>Lektyna z orzeszków ziemnych</td><td>Sigma</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>57903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)Glukoza</td><td>Sigma</td><td>67528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis (2-amina&#8211; kwas tetrakwasowy (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>57653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643-500 g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowany etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>destylowany H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>101-1000 &mu; l Niebieskie końcówki do pipet z podziałką</td><td>USA Scentific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Sterylizowana pipeta pakowana pojedynczo</td><td>USA Scentific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Ergonomiczna zmienna objętość (100-1000 &mu; l) Pipetor z wyrzutnikiem końcówek</td><td>VWR International Inc.</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny przyrząd do pipetowania, Drummond</td><td>VWR International Inc.</td><td>53498-103</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna pipeta transferowa z tworzywa sztucznego</td><td>VWR International Inc.</td><td>14670-114</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Rurka stożkowa </td><td>USA Scentific</td><td>1475-1611</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa</td><td>USA Scentific</td><td>1500-1811</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne igły o rozmiarze 18</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td></td><td></td>305196</tr><tr><td>Sterylne strzykawki 10 ml</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td></td><td></td>305482</tr><tr><td>Plastikowe filtry strzykawkowe Corning 0,20 &mu; m wielkość porów </td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>Acrodic 25 mm Filtr strzykawkowy z 5 &mu; m versapor Membrana</td><td>VWR International Inc.</td><td>28144-095</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm szalka Petriego sterylna</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-548</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100x15 mm Sterylna</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-912</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane o średnicy 12 mm</td><td>VWR International Inc.</td><td>48300-560</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste płytki do hodowli komórkowych 24-dołkowe płaskie dno z pokrywką </td><td>Thomas scientific</td><td>6902A09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5- Drobne kleszcze </td><td>Narzędzia do nauki</td> o wysokiej jakości <td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5702</td><td>Eppendorf</td><td>022629883</td><td></td></tr><tr>Odwrócony mikroskop <td></td><td></td><td></td>z<td>przepływem laminarnym</td></tr> z <tr><td>obiektywem</td><td></td><td></td><td></td> x10</tr><tr>Inkubator <td></td><td></td><td></td><td>z nawilżanym powietrzem otoczenia</td></tr></tbody></table>

metoda hodowli embrionalnych komórek c. elegans

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans to potężny system modelowy, w którym techniki genetyczne i molekularne są łatwo stosowane. Do niedawna jednak techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek i izolacji określonych typów komórek, nie mogły być stosowane u C. elegans. Ograniczenie to wynikało z faktu, że tkanki są zamknięte w naskórku pod ciśnieniem, który nie jest łatwo trawiony przez leczenie enzymami i/lub detergentami. Opierając się na wczesnych, pionierskich pracach Lairda Blooma, Christensen i współpracownicy opracowali solidną metodę hodowli komórek embrionalnych C. elegans na dużą skalę. Jaja są izolowane od ciężarnych dorosłych osobników poprzez traktowanie wybielaczem/NaOH, a następnie traktowane chitynazą w celu usunięcia skorupek jaj. Komórki embrionalne są następnie dysocjowane przez ręczne pipetowanie i umieszczane na szkle pokrytym substratem w pożywce wzbogaconej surowicą. W ciągu 24 godzin od izolacji komórki zaczynają się różnicować poprzez zmianę morfologii i ekspresję markerów specyficznych dla komórki. Komórki C. elegans hodowane tą metodą przeżywają do 2 tygodni in vitro i zostały wykorzystane do analiz elektrofizjologicznych, immunochemicznych i obrazowych, a także zostały posortowane i wykorzystane do profilowania mikromacierzy.

C. elegans hodowane komórki różnicują się i wykazują ekspresję markerów specyficznych dla komórek
Christensen i współpracownicy, stosując barwienie błęknitem trypanowym, wykazali, że &gt;99% embrionalnych komórek C. elegans przeżywa procedurę izolacji. W 9. i 22. dniu po wysiewaniu, odpowiednio 85% i 65% komórek nadal pozostaje żywych 1. Izolowane embrionalne komórki C. elegans muszą przywrzeć do podłoża, aby mogły ulec różnicowaniu. Komórki, które nie przywi...

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dysocjacja i hodowla in vitro komórek embrionalnych zwierzęcia sea elegant. Osiąga się to poprzez uprzednie wyhodowanie znacznej liczby dorosłych osobników. Następnie z osobników dorosłych izoluje się jaja.Następnie jaja traktuje się chitynazą w celu rozpuszczenia otoczki jajowej. Na koniec komórki są dysocjowane manualnie i wysiewane do hodowli. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące ekspresję markerów specyficznych dla danych komórek za pomocą immunofluorescencji, mikroskopii, elektrofizjologii oraz technik obrazowania wapnia.Procedura zostanie zademonstrowana przez rel ti, pracownika postdoc w laboratorium mal. Po wyhodowaniu co najmniej czterech płytek sea elegance do dorosłego stadium GR oraz przygotowaniu mediów i roztworów zgodnie z protokołem tekstowym, należy rozpocząć izolację jaj, przygotowując najpierw probówkę z wcześniej sporządzonym roztworem stokowym lektyny fistaszkowej.Umieść zakrywkowe szkiełka w autoklawie w dołkach płytki 24-dołkowej i dodaj 200 µL lektyny arachydowej do każdego szkiełka, następnie inkubuj przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie odessij roztwór i przemyj dołki sterylną wodą, usuwając wszelkie pozostałości lektyny arachydowej, aby zapobiec agregacji komórek.Następnie, używając sterylnej wody z autoklawu, zmyć dorosłe osobniki GR z płytek agarowych i zebrać zawiesinę do dwóch sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Umieścić probówki w lodzie do pięciu minut, aby umożliwić osiadanie nicieni na dnie. Za pomocą pipety transferowej usunąć wodę i zastąpić ją świeżą, sterylną wodą z autoklawu. Wirować nicienie przy 200 G przez 10 minut.Po ostatnim płukaniu zawiesić nicienie w świeżej sterylnej wodzie i przenieść je do sterylnej probówki stożkowej o objętości 15 ml przed ponownym wirowaniem przy 200 G przez 10 minut. Jeśli nicienie nie utworzyły całkowitego osadu, umieścić probówkę na lodzie na pięć minut. Gdy nicienie całkowicie osiądą na dnie, usunąć wodę i dodać od pięciu do sześciu ml roztworu lizującego.Następnie delikatnie kołysz zawiesinę przez 5 do 10 minut i co dwie do trzech minut nanieś kroplę zawiesiny na szkiełko nakrywkowe, aby sprawdzić stopień lizy pod mikroskopem stereoskopowym. Gdy ulegnie lizie od 72 do 80% nicieni, zatrzymaj reakcję lizy, dodając 9 ml buforu do jaj. Przed przystąpieniem do wirowania od tego momentu zapal palnik Bunsena i pozostaw go włączonego, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu jaj; ostrożnie usuń nadsącz i użyj buforu do jaj, aby dokładnie wyprać osad trzy do czterech razy, aż roztwór stanie się przejrzysty. Następnie, po usunięciu ostatniego nadsączu w celu oddzielenia jaj od resztek ciał zwierząt, resuspenduj osad w 2 ml sterylnego buforu do jaj i dodaj 2 ml 60% sacharozy w buforze do jaj.Przed wirowaniem przez 20 minut należy dokładnie wymieszać jaja w roztworze. Przy 200 G ostrożnie wyjmij probówki z wirówki. Jaja będą unosić się na powierzchni roztworu.Należy zatem użyć pipety i sterylnych końcówek o pojemności 1 ml, aby przenieść jaja do nowej, sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Używając sterylnego buforu do jaj, należy przemyć jaja trzykrotnie, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Aby uniknąć kontaminacji bakteryjnej, należy zawiesić osad z jaj w 1 ml kinazy o stężeniu 2 mg/ml i przenieść je do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Kołysz probówką przez 10 do 30 minut w temperaturze pokojowej, zależnie od świeżości enzymu, aż do momentu, gdy zostanie strawione około 80% skorup jaj. Wirować jaja przy 900 G przez trzy minuty. Po ostrożnym usunięciu supernatantu dodać trzy mililitry pożywki L 15, przenieść jaja na płytkę o średnicy sześciu centymetrów i rozpocząć manualną dysocjację za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 mililitrów z igłą o rozmiarze 18 G.Aby monitorować stopień dysocjacji, nanieś kroplę zawiesiny na świeżoną płytkę Petriego i obejrzyj pod mikroskopem. Kontynuuj proces do momentu, aż około 80% komórek ulegnie dysocjacji. W celu usunięcia grudek komórkowych, niestrawionych jaj i wyklutych larw, delikatnie przefiltruj zawiesinę przez filtr o wielkości oczek 5 µm, a następnie przepuść dodatkowe 4–5 ml pożywki L 15 przez filtr, aby odzyskać komórki do dalszej hodowli.Po odwirowaniu filtratu przy 900 G przez trzy minuty, komórki należy zawiesić ponownie w pełnej pożywce L 15, wlewając 1 ml na dołek, a następnie przechowywać płytki w wilgotnej, szczelnej komorze w temperaturze 20 °C w powietrzu otoczenia. Aby zróżnicować wyizolowane komórki embrionalne, muszą one przylegać do podłoża. Proces różnicowania rozpoczyna się około dwóch do trzech godzin po wysianiu i trwa przez około 24 godziny.Cechy morfologiczne in vitro są niezwykle podobne do tych obserwowanych in vivo. Na przykład, jak tu pokazano, neurony dotykowe LM i PLM wykształcają tylko dwa wypustki neuronalne, z których jedna jest dłuższa od drugiej, tak jak dzieje się to in vivo. Sugeruje to, że co najmniej niektóre mechanizmy molekularne sterujące różnicowaniem w komórkach elegan są autonomiczne komórkowo, a zatem mogą zostać odtworzone.W warunkach in vitro można również zaobserwować białkowe markery oraz modyfikacje potranslacyjne specyficzne dla konkretnych komórek. Na przykład alfa-tubulina jest acetylowana wyłącznie w neuronach dotykowych u nicieni morskich, co pokazano tutaj: procesy neuronów dotykowych in vitro wybarwiają się za pomocą przeciwciała skierowanego przeciwko acetylowanej alfa-tubulinie. Ponadto, jak widać na tym panelu, hodowane neurony dotykowe wykazują ekspresję toksycznego mutantu kanału MEC-4 D, który w warunkach in vivo powoduje śmierć neuronów dotykowych.Neurony wykazujące ekspresję GFP, przygotowane z MEC szczepu four DPE 4G FP, są początkowo obecne w hodowli, lecz następnie ulegają degeneracji. Jednakże, podobnie jak in vivo, komórki te mogą zostać uratowane przed śmiercią poprzez zastosowanie IDE i dantrolenu, co pokazano w niniejszym materiale. Techniki patch-clamp są wykorzystywane do badania kanałów potasowych, nieaselektywnych oraz kanałów zależnych od transportera dopaminy w hodowlach komórkowych sea elgan.Ze względu na niewielki rozmiar komórki, pipety szklane muszą mieć wąską końcówkę oraz szeroki stożek, aby zrównoważyć zwiększoną rezystancję wejściową. Ponadto większy sukces osiąga się poprzez przykładanie impulsu wysokiego napięcia do fragmentu błony pod końcówką pipety, zamiast uzyskiwania dostępu do całej komórki poprzez ssanie, które może uszkodzić komórkę. Na tym rysunku, w celu zbadania roli napięciowo zależnych kanałów wapniowych, zastosowano ION 4 do perforacji błony i kalibracji neuronów dotykowych wykazujących ekspresję chameleon YC 2.12 do obrazowania wapnia w obecności lub przy braku wapnia.Dodatkowo ustalono, że średnie stężenie wolnego wapnia w neuronach dotykowych wynosi 200 nanomoli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób izolacji i hodowli in vitro komórek embrionalnych C. elegans.

a-method-for-culturing-embryonic-c-elegans-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda hodowli zarodkowych komórek C. elegans

Technika hodowli całego zarodka pozwala na hodowlę zarodków myszy i szczura w warunkach ex vivo przez ograniczony czas, odpowiadający etapom środkowej okresu ciężywności. W niniejszym protokole wideo prezentujemy standardowe procedury hodowli całego zarodka szczura po E12.5 przy użyciu systemu hodowli w butelkach typu rotacyjnego.

Metoda hodowli całych embrionów gryzoni z wykorzystaniem systemu hodowli w butelkach typu rotacyjnego

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Ten film przedstawia metodę izolacji i sterylnego hodowania embrionalnych komórek C. elegans  in vitro.

Trawienie enzymatyczne i dysocjacja ręczna: metoda przygotowania zarodków C. elegans do hodowli komórkowej

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Poznaj metodę hodowli embrionalnych komórek C. elegans in vitro, umożliwiającą badanie ekspresji genów w sposób komórkowo-specyficzny. Technika ta wspiera rozwój neurobiologii i biologii komórki.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Przeglądaj więcej filmów