Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Ogólnym celem tej procedury jest dysocjacja i hodowla in vitro, embrionalnych, eleganckich komórek morskich. Osiąga się to poprzez wczesną hodowlę dużych ilości zwierząt cmentarnych. Następnie jaja są izolowane od dorosłych.

Następnie jaja traktuje się chitynazą, aby rozpuścić skorupkę jajka. Na koniec komórki są ręcznie dysocjowane i platerowane do hodowli. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ekspresję markerów specyficznych dla komórek za pomocą immunofluorescencji, mikroskopii, elektrofizjologii i technik obrazowania wapnia.

Demonstracją procedury będzie laboratorium podoktor ckie. Po wyhodowaniu co najmniej czterech talerzy morskiej elegancji do etapu dorosłego GR i przygotowaniu pożywek i roztworów zgodnie z protokołem tekstowym. Izolację jaj należy rozpocząć od uprzedniego włożenia rurki wcześniej przygotowanego roztworu podstawowego lektyny z orzeszków ziemnych.

Umieścić szkiełka nakrywkowe autoklawu w dołkach 24-dołkowej płytki i dodać 200 mikrolitrów lektyny z orzeszków ziemnych do każdego szkiełka nakrywkowego, inkubować przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie odessać roztwór i użyć sterylnej wody do umycia studzienek. Raz usuń wszystkie ślady lektyny z orzeszków ziemnych, aby zapobiec zbrylaniu się komórek.

Następnie, używając sterylnej wody z autoklawu, zmyj dorosłe GR z płytek agarowych i zbierz zawiesinę do dwóch sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów. Umieść probówki na lodzie na maksymalnie pięć minut, aby robaki opadły na dno Za pomocą pipety transferowej usuń wodę i zastąp ją świeżą, sterylną wirówką do autoklawu wodnego. Robaki w 200 G przez 10 minut.

Po ostatnim umyciu ponownie zawiesić robaki w świeżej sterylnej wodzie i przenieść je do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, a następnie ponownie wirować przy 200 G przez 10 minut. Jeśli robaki nie są całkowicie granulowane, umieść probówkę na lodzie na pięć minut. Gdy robaki całkowicie się uspokoją, usuń wodę i dodaj pięć do sześciu mililitrów roztworu do lizy.

Następnie delikatnie kołysz zawiesiną przez pięć do 10 minut, a następnie co dwie do trzech minut umieszczaj kroplę zawiesiny na szkiełku nakrywkowym i sprawdzaj, czy nie ma lizy pod mikroskopem stereoskopowym. Gdy 72 80% robaków zostanie poddanych lizie, zatrzymaj reakcję lizy, dodając dziewięć mililitrów buforu jaj przed wirowaniem od tego punktu do przodu, zapal palnik Bunsena i trzymaj go włączony, aby zapobiec ponownemu zanieczyszczeniu jaj, ostrożnie usuń supernatant i użyj bufora do jaj, aby dokładnie umyć osad trzy do czterech razy, aż roztwór będzie klarowny. Następnie, po usunięciu końcowego supernatantu w celu oddzielenia jaj od resusu tusz zwierzęcych, zawiesić osad w dwóch mililitrach sterylnego buforu jaj i dodać dwa mililitry 60% sacharozy do bufora jaj.

Dobrze wymieszaj jajka w roztworze przed odwirowaniem przez 20 minut. Przy 200 G ostrożnie wyjmij probówki z wirówki. Jaja będą unosić się na górze roztworu.

Dlatego użyj pipetara i sterylnych końcówek o pojemności jednego mililitra, aby przenieść jaja do świeżej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Użyj sterylnego bufora do jaj, aby umyć jaja trzy razy podczas pracy pod kapturem z przepływem laminarnym. Aby uniknąć wprowadzenia zanieczyszczenia bakteryjnego, należy zawiesić granulowane jaja w jednym mililitrze dwóch miligramów na mililitr kinazy i przenieść je do świeżej 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Kołysz probówką przez 10 do 30 minut w temperaturze pokojowej, w zależności od świeżości enzymu, gdy około 80% skorupek jaj jest trawionych. Odwirować jaja w temperaturze 900 G przez trzy minuty. Po ostrożnym usunięciu supernatantu dodać trzy mililitry pożywki L 15, przenieść jaja na płytkę o średnicy sześciu centymetrów i rozpocząć ręczną dysocjację za pomocą 10-mililitrowej sterylnej strzykawki z igłą o rozmiarze 18.

Aby monitorować stopień dysocjacji, umieść kroplę zawiesiny na świeżej szalce Petriego i obejrzyj pod mikroskopem. Kontynuuj, aż około 80% komórek zostanie zdysocjowanych. Aby usunąć grudki komórek, niestrawione jaja i wyklute larwy, delikatnie przefiltruj zawiesinę przez filtr o grubości pięciu mikronów i przepuść przez filtr dodatkowe cztery do pięciu mililitrów pożywki L 15, aby odzyskać komórki do hodowli komórek.

Po odwirowaniu filtratu o sile 900 G przez trzy minuty, resus zawiesić komórki w kompletnym podłożu L 15 odtwarzanym na jeden mililitr na studzienkę i przechowywać płytki w wilgotnej, szczelnej komorze w temperaturze 20 stopni Celsjusza w otaczającym powietrzu. Aby zróżnicować izolowane embrionalne komórki eleganu muszą przylegać do podłoża. Proces różnicowania rozpoczyna się około dwóch do trzech godzin po posiewie i trwa przez około 24 godziny.

Cechy morfologiczne in vitro są niezwykle podobne do tych in vivo. Na przykład, jak pokazano tutaj, neurony dotykowe LM i PLM rozwijają tylko dwa procesy neuronalne, z których jeden jest dłuższy od drugiego, tak jak ma to miejsce in vivo. Sugeruje to, że przynajmniej niektóre mechanizmy molekularne, które napędzają różnicowanie w komórkach elegan, są autonomiczne i dlatego można je podsumować.

Markery białkowe in vitro i modyfikacje potranslacyjne, które są specyficzne dla komórki, można również zaobserwować in vitro. Na przykład alfa tubulina jest nasyconymi neuronami tylko w dotyku w Sea Elgan, jak pokazano tutaj in vitro procesy neuronów dotykowych barwiących się przeciwciałem podniesionym przeciwko nasyconej alfa tubulinie. Ponadto, jak widać w tym panelu, hodowane neurony dotykowe wyrażają toksyczny zmutowany kanał MEC four D, który powoduje śmierć neuronów dotykowych in vivo.

Neurony wykazujące ekspresję GFP przygotowane ze szczepu MEC four DPE 4G FP są początkowo obecne w hodowli, ale następnie ulegają degeneracji. Jednak, podobnie jak in vivo, komórki można uratować przed śmiercią poprzez leczenie IDE i dantrolenem, jak pokazano tutaj. Techniki patch clamp są stosowane do badania kanałów onowych, onowych, nieselektywnych i zależnych od transportera dopaminy w komórkach hodowlanych Sea Elgan

Ze względu na mały rozmiar celi, szklane pipety muszą mieć małą końcówkę, a następnie szeroki stożek, aby zrównoważyć zwiększoną rezystancję wejściową. Ponadto większy sukces osiąga się poprzez przyłożenie impulsu o wysokim napięciu do łaty membrany pod końcówką pipety, w porównaniu z uzyskaniem dostępu do całej komórki poprzez ssanie, które może uszkodzić ogniwo. Na tym rysunku, aby zbadać rolę kanałów wapniowych bramkowanych napięciem, ION 4 jest używany do przenikania błony i kalibracji neuronów dotykowych wyrażających kameleona YC dwa punkt 12 do obrazowania wapnia przy braku lub obecności wapnia.

Ponadto stwierdzono, że średnie stężenie wolnego wapnia w neuronach dotykowych wynosi 200 nanomolowych zębów trzonowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i hodować in vitro. Patrz elegancja, komórki embrionalne.