Przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy
3 listopada 2013
Model przecięcia nerwu piszczelowego jest dobrze tolerowanym, sprawdzonym i powtarzalnym modelem zaniku mięśni szkieletowych. Modelowy protokół chirurgiczny został opisany i zademonstrowany na myszach C57Black6.
Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie modelu przecięcia nerwu piszczelowego w atrofii mięśni szkieletowych u myszy. Osiąga się to poprzez odizolowanie nerwu kulszowego i jego trzech gałęzi, nerwu piszczelowego, syl i nerwu strzałkowego. Po wyizolowaniu nerw piszczelowy zostaje przecięty.
Po denerwacji rana jest uszczelniana, a stan zwierzęcia jest ściśle monitorowany. Ostatecznie uzyskuje się próbki, które wykazują postępujący spadek masy mięśniowej po odnerwieniu. Model przecięcia nerwu piszczelowego zaniku mięśni szkieletowych wywołanego odnerwieniem jest powszechnie stosowany w dobrze zweryfikowanym modelu u szczurów i ma znacznie mniejszą zachorowalność niż ta związana z przecięciem nerwu kulszowego.
Dostosowaliśmy ten model do stosowania u myszy, co tutaj zademonstrujemy. Dzięki temu badacz może wykorzystać istnienie genetycznie zmodyfikowanych myszy i zbadać proces zaniku mięśni przy braku białek, które są kluczowe dla regulacji masy mięśni szkieletowych przy jednoczesnym wywołaniu minimalnej zachorowalności u zwierzęcia. Najpierw zapisz wagę myszy po potwierdzeniu odpowiedniego znieczulenia przez uszczypnięcie palca, zidentyfikuj wcięcie kulszowe za pomocą badania palpacyjnego i ogol boczną część uda i pośladek stamtąd do kolana.
Następnie oczyść obszar wielokrotnymi aplikacjami alkoholu i pro jodu. Umieść mysz na boku pod mikroskopem operacyjnym lub preparacyjnym w sterylnych rękawiczkach. Zidentyfikuj wcięcie kulszowe za pomocą badania palpacyjnego.
Naciąć skórę bocznej części uda od wcięcia kulszowego do kolana. Delikatnie rozprowadź skórę na otwartej przestrzeni. Zidentyfikuj mięsień dwugłowy uda, który jest płaskim powierzchownym mięśniem bocznego uda bezpośrednio pod skórą za pomocą cienkich nożyczek.
Rozbij mięsień dwugłowy uda wzdłuż włókien mięśniowych i włóż retraktor sprężynowy. Aby odsłonić nerw kulszowy i jego gałęzie, zidentyfikuj nerw kulszowy bezpośrednio pod mięśniem dwugłowym uda. Można go rozpoznać po charakterystycznym błyszczącym białym kolorze i średnicy około 0,8 milimetra.
Biegnie od wcięcia kulszowego do kolana, rozgałęziając się do nerwu piszczelowego, strzałkowego i salowego na poziomie dołu podkolanowego. Delikatnie oddziel gałąź piszczelową od nerwu strzałkowego i salowego za pomocą ultra cienkich kleszczy i sprężynowych nożyczek do mikropreparowania. Nerw piszczelowy jest największą gałęzią i zwykle znajduje się centralnie.
Delikatne obchodzenie się z nerwem kulszowym i jego gałęziami ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tej procedury. Uważaj, aby gałęzie nerwu salowego i kroczowego nie były uszkodzone ani rozciągnięte. Jeśli te gałęzie zostaną uszkodzone lub rozciągnięte, spowoduje to również dendenowanie ich celów.
Trzymanie nerwu tuż na zewnętrznej warstwie przybyszowej za pomocą ultra cienkich kleszczy i utrzymywanie luźnego nerwu pozwoli uniknąć zmiażdżenia nerwu i uszkodzenia trakcyjnego w celu tymczasowego odnerwienia Przy oczekiwanej całkowitej reacji w ciągu dwóch do czterech tygodni, zmiażdż nerw piszczelowy ultra cienkimi kleszczami przez 15 sekund, aby uzyskać całkowite i trwałe odnerwienie. Przetnij nerw piszczelowy nożyczkami do mikros preparujących tak dystalnie, jak to możliwe. Ostrożnie omijaj naczynia podkolanowe, jeśli wymagane jest całkowite odnerwienie.
Zszyj koniec przeciętego nerwu piszczelowego do przedniej powierzchni mięśnia dwugłowego uda nylonem 10 T i ponownie przybliż mięsień dwugłowy uda za pomocą pięciu T Vicryl, aby zapobiec aberracji mięśni brzucha i płaszczkowatego. Po zakończeniu denerwacji zamknij skórę za pomocą pięciopunktowego szwu Vicryl. Gdy będziesz gotowy, wyłącz wziewny środek znieczulający, ale utrzymuj przepływ tlenu.
Po pojedynczym podaniu środka przeciwbólowego umieść mysz w ciepłej, czystej klatce bez ściółki. Trzymaj mysz pod bezpośrednią obserwacją do momentu poruszania się. Po całkowitym wyzdrowieniu przenieś mysz do czystej, solidnej dolnej klatki z dużą ilością miękkiego ściółki.
Codziennie sprawdzaj kończynę operacyjną i stopę pod kątem rozwoju odleżyn pięty lub śladów żucia, drobnych problemów można opanować za pomocą miejscowych antybiotyków lub środków antyseptycznych, takich jak odine. Wskaźnikami końcowymi wymagającymi eutanazji zwierzęcia są utrata masy ciała, dowody złej samoopieki i zgarbiona postawa. Ponadto należy również złożyć w ofierze zwierzęta z przerwanymi ranami lub wrzodami, których nie goją się po jednym do dwóch tygodni leczenia ran
.Ponadto wszystkie zwierzęta, które odczuwają nadmierny ból W okresie pooperacyjnym pobiera się pożądane tkanki do analizy. Po eutanazji ogolić przyśrodkową stronę zarówno operacyjnej, jak i przeciwległej nogi kontrolnej i oczyścić alkoholem, pracując pod mikroskopem preparacyjnym, naciąć przyśrodkową skórę łydki skalpelem od kostki do kolana i obwodowo wokół kostki na kończynie operacyjnej. Następnie delikatnie ściągnij skórę z mięśnia i proksymalnie w kierunku uda.
Aby odsłonić wszystkie mięśnie nogi, zidentyfikuj mięsień żołądkowy, który jest mięśniem łydki biegnącym od kolana do kostki po tylnej stronie nogi. Następnie zlokalizuj dystalny przyczep mięśnia dwugłowego uda proksymalnie do mięśnia żołądkowego po przyśrodkowej stronie kolana. W dystalnym przyczepie mięsień dwugłowy uda wydaje się cienki i płaski i pokrywa najbardziej proksymalną część żołądka za pomocą nożyczek i rozwarstwienia końca.
Delikatnie oddziel dystalny przyczep mięśnia dwugłowego uda od mięśnia żołądkowego. Dodaj jego dystalny przyczep do kości piętowej, mięsień żołądka zwęża się w ścięgno Achillesa. Zidentyfikuj ścięgno Achillesa, które wydaje się białe i żylaste.
Przytrzymaj ścięgno Achillesa kleszczami. Uważając, aby nie trzymać ani nie zmiażdżyć mięśnia żołądka i nie oddzielić ścięgna Achillesa od przyczepu kości piętowej. Używając nożyczek nadal trzymających ścięgno, delikatnie unieś bladoczerwony mięsień żołądkowy z głębszego czerwonego mięśnia płaszczkowatego od dystalnego przyczepu w kierunku jego początku w kolanie, używając bardzo delikatnej trakcji.
Aby ułatwić ten proces, wypreparuj gastro z nogi, dzieląc pochodzenie żołądka od przyśrodkowych i bocznych kłykci kości udowej. Za pomocą nożyczek. Uważaj, aby nie zmiażdżyć mięśnia.
Płaszczkowaty będzie teraz wyraźnie widoczny natychmiast pod wzrokiem gastrosów. Podnieś sous od jego przyczepu do ścięgna Achillesa do jego początku na tylnej łydce. Po wyjęciu zważ mięśnie osobno na precyzyjnej wadze.
Następnie podziel mięśnie pionowo na pół, aby uzyskać szybkie zamrażanie i ciekły azot, a połowę na histologię. Na koniec powtórz te procedury po stronie kontrolnej bez oceny, aby zebrać kontrolę mięśni żołądka i płaszczkowatego. Mięśnie żołądka zostały pobrane z odnerwionych i przeciwległych kończyn tylnych w ciągu jednego, dwóch lub czterech tygodni i wyrażone w stosunku.
Denerwacja indukowała postępującą utratę masy mięśniowej w czasie. Pole przekroju poprzecznego włókien mięśniowych zmierzono po barwieniu immunologicznym, jak pokazano tutaj. Szybkokurczliwe dwa włókna barwią brązowe i wolnokurczliwe typu jednego włókna, barwią białe dwa szybko.
Włókna drgające wykazywały postępujący spadek pola przekroju poprzecznego w odnerwionym mięśniu. W ciągu czterech tygodni Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wykonać transsekcję nerwu piszczelowego u myszy. W ten sposób uzyskano powtarzalny, solidny i dobrze zweryfikowany model zaniku mięśni szkieletowych wywołanego odnerwieniem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Model przecięcia nerwu piszczelowego jest zwalidowaną i powtarzalną metodą badania zaniku mięśni szkieletowych u myszy. Model ten polega na chirurgicznym wyizolowaniu i przecięciu nerwu piszczelowego, co umożliwia obserwację zmian masy mięśniowej po denerwacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Fizjologia mięśni
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Model przecięcia nerwu piszczelowego jest powszechnie stosowany do badania zaniku mięśni szkieletowych.
- Model ten wiąże się z mniejszą chorobowością w porównaniu z modelem przecięcia nerwu kulszowego.
- Stanowi on niezawodny sposób oceny zmian masy mięśniowej po uszkodzeniu nerwu.
- Do tej procedury zazwyczaj wykorzystuje się myszy C57Black6.
Cel badania
- Zaprezentowanie protokołu chirurgicznego dla przecięcia nerwu piszczelowego.
- Monitorowanie wpływu denerwacji na masę mięśniową.
- Walidacja modelu na potrzeby przyszłych badań nad zanikiem mięśni.
Zastosowane metody
- Izolacja nerwu kulszowego i jego gałęzi.
- Przecięcie nerwu piszczelowego.
- Zamknięcie rany po operacji.
- Monitorowanie stanu zwierzęcia i pobieranie próbek mięśni.
Główne wyniki
- Obserwowany postępujący spadek masy mięśniowej po denerwacji.
- Model wykazuje niską śmiertelność w porównaniu z innymi metodami przecięcia nerwu.
- Wyniki potwierdzają zasadność stosowania modelu w badaniach nad atrofią mięśni.
- Zapewnia podstawy do przyszłych badań nad uszkodzeniami nerwów i utratą masy mięśniowej.
Wnioski
- Model przezcięcia nerwu piszczelowego jest skuteczny w badaniu zaniku mięśni.
- Oferuje on powtarzalną metodę z minimalną liczbą powikłań.
- Model ten może być wykorzystywany w różnych kontekstach badawczych związanych ze zdrowiem nerwowo-mięśniowym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model przecięcia nerwu piszczelowego stanowi powtarzalny system o niskiej śmiertelności do badania zaniku mięśni szkieletowych indukowanego denerwacją u myszy, umożliwiając analizę mechanistyczną szlaków prowadzących do marnienia mięśni. Model ten wspiera walidację celów terapeutycznych oraz przedkliniczne ograniczanie ryzyka, pozwalając na ocenę zaniku w modelach genetycznie zmodyfikowanych, co ułatwia ewaluację interwencji terapeutycznych wpływających na regulację masy mięśniowej. Jego kompatybilność z odczytami histomorfometrycznymi i molekularnymi zwiększa pewność prognostyczną w programach odkrywania leków neuromięśniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych związanych ze ścieżkami zaniku mięśni poprzez indukcję fenotypu wywołanego denerwacją u myszy typu dzikiego oraz myszy modyfikowanych genetycznie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane podejście chirurgiczne przy minimalnym upośledzeniu zdolności poruszania się, co wspiera spójną indukcję fenotypu w kohortach badawczych.
Przesiewy i rozwój testów analitycznych
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych punktów końcowych, takich jak masa mięśni oraz powierzchnia przekroju poprzecznego specyficzna dla typu włókien, co służy standaryzacji analiz i przesiewowi związków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną ocenę w 1., 2. i 4. tygodniu po denerwacji, co pozwala na profilowanie skuteczności w zależności od czasu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie fizjologicznych, komórkowych i molekularnych mechanizmów zaniku w systemach istotnych dla chorób, w tym odpowiedzi włókien szybkokurczliwych i wolnokurczliwych.
- Wartość operacyjna: Pozwala zachować przeciwległą kończynę jako kontrolę wewnętrzną, co zmniejsza zmienność i zwiększa moc statystyczną w badaniach przedklinicznych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu badawczego – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – wspierając weryfikację hipotez oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad atrofią mięśni.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych i walidację celów poprzez indukowanie powtarzalnego fenotypu zaniku za pomocą przecięcia nerwu piszczelowego.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów histomorfometrycznych (masa mięśni, CSA), odpowiednich do analizy wysokotreściowej i oceny działania związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary specyficzne dla typów włókien (typ I i II), co pozwala na stratyfikację mechanistyczną odpowiedzi na zanik.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość od odkrywania celu genetycznego po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem istotnych dla choroby fenotypów mięśni szkieletowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi powtarzalną platformę chirurgiczną, którą można zastosować w odniesieniu do wielu celów i tła genetycznego w programach neuromięśniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację denerwacji jako kontrolowanej zmiennej w badaniach nad utratą masy mięśniowej.
- Wartość operacyjna: Oferuje dobrze tolerowany, powtarzalny model o niższej chorobowości niż w przypadku przecięcia nerwu kulszowego, co poprawia dobrostan zwierząt i spójność danych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go, dostarczając wczesnych, prognostycznych odczytów zaangażowania celu w szlakach regulacji masy mięśniowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów terapeutycznych w atrofii w oparciu o korektę ryzyka i ratowanie fenotypu w zwalidowanych modelach denerwacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w mikrochirurgicznej izolacji i manipulacji nerwami, aby uniknąć uszkodzenia gałęzi strzałkowej i skórnej łydki.
- Niezbędne są sterylne instrumenty chirurgiczne, narzędzia do mikrodysekcji oraz materiały szewskie (nylon, Vicryl) do przecięcia nerwu i zamknięcia rany.
- Wymagane są ustandaryzowane protokoły monitorowania pooperacyjnego i analizji przeciwbólowej, aby zapewnić regenerację zwierząt i zminimalizować wpływ stresu jako czynnika zakłócającego.
- Wymagana jest infrastruktura histologiczna do zatapiania w parafinie, immunobarwienia (izoformy miozyny) oraz analizy morfometrycznej pola przekroju poprzecznego włókien.
- Metoda ogranicza się do dystalnych mięśni kończyn dolnych (mięsień brzuchaty łydki, mięsień płatkowaty, mięsień podeszwowy); nie nadaje się do badania zaniku mięśni proksymalnych lub osiowych.
