Name: Przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-03T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj model przecięcia nerwu piszczelowego u myszy do badania atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją. Ta metoda oferuje niską śmiertelność i pozwala monitorować postępujący spadek masy mięśniowej po zabiegu chirurgicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z CIHR Neuromuscular Research Partnership (JNM – 90959; do J.A.E.B.).

Przed użyciem tego modelu, badacze musieli otrzymać zgodę na protokół chirurgiczny od organu zarządzającego użytkowaniem zwierząt w ich instytucji. Model został zatwierdzony przez Radę ds. Etyki Badań, Hamilton Health Sciences Corporation, McMaster University (AUP # 10-04-24) i jest przeprowadzany w ścisłej zgodności z zaleceniami Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Zważ mysz. Wywołaj znieczulenie 5% izofluranem lub 2% halotanem. Zastosowany obwód powinien zapewniać odpowiednie oczyszczanie środka znieczulającego, aby chronić chirurga. Po 2-3 minutach oddech zwierzęcia zwolni. Upewnij się, że odruch mrugania jest nieobecny i ściśnij przestrzenie międzypalcowe w łapie, aby potwierdzić znieczulenie chirurgiczne (tj. brak reakcji myszy). Nałóż lubrykant okulistyczny na oko, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas operacji.</li>
	<li>Ogolić boczną część uda i pośladek od wcięcia kulszowego do kolana i zdezynfekować prowizyną. Golenie sprawi, że miejsce nacięcia pozostanie wolne od włosów, aby zapewnić odpowiednią wizualizację pola operacyjnego i zminimalizować zakłócenia związane z rozwarstwieniem i przecięciem nerwu. Wcięcie kulszowe, które jest górne i tylne w stosunku do kości udowej, można zidentyfikować za pomocą badania palpacyjnego.</li>
</ol>
2. Procedura operacyjna
<ol>
	<li>Zmniejsz wziewny izofluran do 2% (halotan 1%) i umieść mysz na boku (strona przeznaczona do zabiegu skierowanego do góry), pod mikroskopem operacyjnym lub preparacyjnym. Alternatywnie operację można wykonać za pomocą lup chirurgicznych, ponieważ 3,5-krotne powiększenie jest zadowalające dla dorosłej myszy (20-25 g).</li>
	<li>Załóż sterylne rękawiczki. Zidentyfikuj wcięcie kulszowe za pomocą badania palpacyjnego. Za pomocą skalpela naciąć skórę bocznej części uda od wcięcia kulszowego do kolana (około 1 cm).</li>
	<li>Delikatnie rozprowadź skórę. Zidentyfikuj mięsień dwugłowy uda, który jest płaskim mięśniem powierzchownym bocznego uda bezpośrednio pod skórą. Za pomocą cienkich nożyczek rozłup mięsień dwugłowy uda wzdłuż włókien mięśniowych i przytrzymaj otwarty za pomocą retraktora sprężynowego, aby odsłonić nerw kulszowy i jego gałęzie.</li>
	<li>Zidentyfikuj nerw kulszowy bezpośrednio głęboko w mięśniu dwugłowym uda. Można go rozpoznać po charakterystycznym błyszczącym białym kolorze i średnicy około 0,8 mm. Biegnie od wcięcia kulszowego do kolana, rozgałęziając się do nerwu piszczelowego, strzałkowego i łydkowego na poziomie dołu podkolanowego.</li>
	<li>Delikatnie oddziel kość piszczelową od nerwu strzałkowego i łydkowego za pomocą ultracienkich kleszczy i sprężynowych nożyczek do mikropreparacji. Nerw piszczelowy jest największą gałęzią i zwykle znajduje się centralnie. Ważne jest, aby nie zmiażdżyć nerwu podczas oddzielania gałęzi. Trzymanie nerwu tylko na zewnętrznej warstwie przybyszowej za pomocą ultracienkich kleszczy i utrzymywanie luźnego nerwu (nie nauczonego) pozwoli uniknąć zmiażdżenia nerwu i uszkodzenia trakcji.</li>
	<li>Aby uzyskać całkowite i trwałe odnerwienie, przeciąć nerw piszczelowy nożyczkami do mikrodystalnego wypreparowania tak dystalnie, jak to możliwe, ostrożnie omijając naczynia podkolanowe. Alternatywnie, w przypadku tymczasowego odnerwienia z oczekiwanym całkowitym unerwieniem w ciągu 2-4 tygodni, nerw piszczelowy można po prostu zmiażdżyć ultracienkimi kleszczami przez 15 sekund zamiast transektować. (Nerwy obwodowe odrastają po urazie i unerwiają mięsień docelowy).</li>
	<li>Jeśli wymagane jest całkowite odnerwienie, zszyj koniec przeciętego nerwu piszczelowego do przedniej powierzchni mięśnia dwugłowego uda nylonem 10-0 i ponownie aproksymuj mięsień dwugłowy uda za pomocą 5-0 Vicryl, aby zapobiec nieprawidłowemu unerwieniu mięśni brzuchatego łydki i płaszczkowatego.</li>
	<li>Zamknij skórę za pomocą biegnącego szwu 5-0 Vicryl.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Wyłącz wziewny środek znieczulający, ale utrzymuj przepływ tlenu. Buprinorfinę (lub substytut) środek przeciwbólowy należy podawać podskórnie.</li>
	<li>Przenieś mysz do czystej klatki bez ściółki podczas budzenia się ze znieczulenia. Trzymaj na kocu rozgrzewającym w klatce i pod bezpośrednią obserwacją do czasu rozpoczęcia ruchu.</li>
	<li>Przenieś i umieść w klatce z miękkim dnem (nie drutu) z dużą ilością miękkiej ściółki.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj kończynę operacyjną pod kątem stanu rany operacyjnej i stopy pod kątem rozwoju odleżyn pięty lub śladów żucia. Drobne problemy można opanować za pomocą miejscowych antybiotyków lub środków antyseptycznych, takich jak prowizyna. Wskaźnikami końcowymi wymagającymi eutanazji zwierząt są utrata masy ciała, dowody złej samoopieki (potargane futro) i zgarbiona postawa. Ponadto należy złożyć w ofierze zwierzęta z poważnymi przerwanymi ranami lub wrzodami, które nie goją się w ciągu 1-2 tygodni po zastosowaniu miejscowych antybiotyków lub wydają się odczuwać ból.</li>
</ol>
4. Odnerwione żniwo mięśni brzuchatych łydki i płaszczkowatego
<ol>
	<li>W pożądanym momencie pooperacyjnym zważyć mysz i poświęcić się przedawkowaniu CO2.</li>
	<li>Ogolić przyśrodkową stronę zarówno nóg kontrolnych, jak i przeciwległych i oczyścić alkoholem. Umieść mysz pod mikroskopem operacyjnym lub preparacyjnym lub alternatywnie użyj lup chirurgicznych do powiększenia.</li>
	<li>Na kończynie operacyjnej naciąć skalpelem przyśrodkową skórę łydki od kostki do kolana i obwodowo wokół kostki. Delikatnie ściągnij skórę kleszczami z mięśnia i proksymalnie w kierunku uda. To odsłania wszystkie mięśnie nogi. Zidentyfikuj mięsień brzuchaty łydki, który jest mięśniem łydki, który biegnie od kolana do kostki po tylnej stronie nogi i leży bezpośrednio pod skórą. Zidentyfikuj dystalny przyczep mięśnia dwugłowego uda, proksymalnie do mięśnia brzuchatego łydki po przyśrodkowej stronie kolana. W dystalnym przyczepie mięsień dwugłowy uda wydaje się cienki i pokryty najbardziej proksymalną częścią mięśnia brzuchatego łydki. Za pomocą nożyczek i wycięcia końca delikatnie oddziel dystalny przyczep mięśnia dwugłowego uda od mięśnia brzuchatego łydki.</li>
	<li>Przy dystalnym przyczepie do kości piętowej mięsień brzuchaty łydki zwęża się w ścięgno Achillesa. Zidentyfikuj ścięgno Achillesa, które wydaje się białe i żylaste. Przytrzymaj ścięgno Achillesa kleszczami, uważając, aby nie trzymać ani nie zmiażdżyć mięśnia brzuchatego łydki i oddzielić ścięgno Achillesa od przyczepu kości piętowej za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Nadal trzymając ścięgno, delikatnie unieś mięsień brzuchaty łydki (bladoczerwony) z głębokiego płaszczkowatego (głębszy czerwony), od dystalnego przyczepu w kierunku jego początku w kolanie (płaszczkowaty może być pobrany osobno).</li>
	<li>Wytnij brzuchaty łydki z nogi, dzieląc pochodzenie mięśnia brzuchatego łydki od przyśrodkowych i bocznych kości udowej za pomocą nożyczek. Bardzo delikatna trakcja na mięśniu ułatwia ten proces. Uważaj, aby nie zmiażdżyć mięśnia.</li>
	<li>Płaszczkowaty będzie teraz wyraźnie widoczny, bezpośrednio pod miejscem mięśnia brzuchatego łydki. Podnieś płaszczkowaty od jego przyczepu do ścięgna Achillesa do jego początku na tylnej łydce. Jeśli płaszczkowaty zostanie przypadkowo podniesiony wraz z mięśniem brzuchatym łydki, delikatnie oddziel go od pobranego okazu. Mięsień brzuchaty łydki (jasnoczerwony) i płaszczkowaty (ciemnoczerwony) pozostają łatwe do zidentyfikowania w zebranym okazie ze względu na różnice w kolorze.</li>
	<li>Zważ mięśnie osobno na precyzyjnej wadze.</li>
	<li>Podziel mięśnie pionowo, połowę do natychmiastowego zamrażania w ciekłym azocie (w celu późniejszej ekstrakcji białka i/lub RNA), a połowę do histologii (tj. oceny morfometrycznej, immunohistologii) utrwalając w 10% formalinie lub zamrożonym utrwaleniu w izopentanie schłodzonym ciekłym azotem, zgodnie z życzeniem.</li>
	<li>Powtórz od kroku 4.3 powyżej po stronie kontrolnej, nieobsługiwanej, aby kontrolować mięsień brzuchaty łydki i płaszczkowaty.</li>
</ol>

<ol><li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributing+factors+to+poor+functional+recovery+after+delayed+nerve+repair%3A+prolonged+denervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contributing factors to poor functional recovery after delayed nerve repair: prolonged denervation.</a> J. Neurosci. 15, 3886-3895 (1995).</li>
<li>Kobayashi, J., Mackinnon, S. E., Watanabe, O., Ball, D. J., Gu, X. M., Hunter, D. A., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+duration+of+muscle+denervation+on+functional+recovery+in+the+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model.</a> Muscle Nerve. 20, 858-866 (1997).</li>
<li>Bain, J. R., Veltri, K. L., Chamberlain, D., Fahnestock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+functional+recovery+of+denervated+skeletal+muscle+after+temporary+sensory+nerve+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Improved functional recovery of denervated skeletal muscle after temporary sensory nerve innervation.</a> Neuroscience. , 103-503 (2001).</li>
<li>Batt, J., Bain, J., Goncalves, J., Michalski, B., Plant, P., Fahnestock, M., Woodgett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+profiling+of+short+and+long+term+denervated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression profiling of short and long term denervated muscle.</a> FASEB J. 20, 115-117 (2006).</li>
<li>Sher, J., Cardasis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber+types+in+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber types in the adult mouse.</a> Acta Neurol. Scand. 54, 45-56 (1976).</li>
<li>Agbulut, O., Noirez, P., Beaumont, F., Butler-Browne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+heavy+chain+isoforms+in+postnatal+muscle+development+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin heavy chain isoforms in postnatal muscle development of mice.</a> Biol. Cell. 95, 399-406 (2003).</li>
<li>Nagpal, P., Plant, P. J., Correa, J., Bain, A., Takeda, M., Kawabe, H., Rotin, D., Bain, J. R., Batt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+nedd4-1+participates+in+denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase nedd4-1 participates in denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice.</a> PLoS ONE. 7, e46427(2012).</li>
<li>Plant, P. J., Bain, J. R., Correa, J. E., Woo, M., Batt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+caspase-3+protects+against+denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Absence of caspase-3 protects against denervation-induced skeletal muscle atrophy.</a> J. Appl. Physiol. 107, 224-234 (2009).</li>
<li>Varejao, A. S., Meek, M. F., Ferreira, A. J., Patricio, J. A., Cabrita, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+evaluation+of+peripheral+nerve+regeneration+in+the+rat%3A+walking+track+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 1-9 (2001).</li>
<li>Willand, M. P., Holmes, M., Bain, J., Fahnestock, M., de Bruin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+muscle+stimulation+after+immediate+nerve+repair+reduces+muscle+atrophy+without+affecting+reinnervation%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Electrical muscle stimulation after immediate nerve repair reduces muscle atrophy without affecting reinnervation.</a> Muscle Nerve. 48, 219-225 (2013).</li>
<li>Sterne, G. D., Coulton, G. R., Brown, R. A., Green, C. J., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3-enhanced+nerve+regeneration+selectively+improves+recovery+of+muscle+fibers+expressing+myosin+heavy+chains+2b%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3-enhanced nerve regeneration selectively improves recovery of muscle fibers expressing myosin heavy chains 2b.</a> J. Cell Biol. 139, 709-715 (1997).</li>
<li>Plant, P. J., North, M. L., Ward, A., Ward, M., Khanna, N., Correa, J., Scott, J. A., Batt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+airway+smooth+muscle+mass+correlates+with+increased+airway+responsiveness+in+a+murine+model+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic airway smooth muscle mass correlates with increased airway responsiveness in a murine model of asthma.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 46, 532-540 (2012).</li>
<li>Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+evaluation+of+complete+sciatic%2C+peroneal%2C+and+posterior+tibial+nerve+lesions+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Plast.+Reconstr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat.</a> Plast. Reconstr. Surg. 83, 129-138 (1989).</li>
<li>Hare, G. M., Evans, P. J., Mackinnon, S. E., Best, T. J., Midha, R., Szalai, J. P., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Walking+track+analysis%3A+utilization+of+individual+footprint+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters.</a> Ann. Plast. Surg. 30, 147-153 (1993).</li>
<li>McLean, J., Batt, J., Doering, L. C., Rotin, D., Bain, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+rate+of+nerve+regeneration+and+directional+errors+after+sciatic+nerve+injury+in+receptor+protein+tyrosine+phosphatase+sigma+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhanced rate of nerve regeneration and directional errors after sciatic nerve injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma knock-out mice.</a> J. Neurosci. 22, 5481-5491 (2002).</li>
<li>Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spared+nerve+injury+%28SNI%29+model+of+induced+mechanical+allodynia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice.</a> J. Vis. Exp. (54), e3092(2011).</li>
<li>Rogoz, K., Lagerstrom, M. C., Dufour, S., Kullander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VGLUT2-dependent+glutamatergic+transmission+in+primary+afferents+is+required+for+intact+nociception+in+both+acute+and+persistent+pain+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">VGLUT2-dependent glutamatergic transmission in primary afferents is required for intact nociception in both acute and persistent pain modalities.</a> Pain. 153, 1525-1536 (2012).</li>
<li>Thornell, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcopenic+obesity%3A+satellite+cells+in+the+aging+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Clin.+Nutr.+Metab.+Care%22%5BJournal%5D)">Sarcopenic obesity: satellite cells in the aging muscle.</a> Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 14, 22-27 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Model przecięcia nerwu piszczelowego zaniku mięśni szkieletowych wywołanego odnerwieniem jest powszechnie stosowanym i dobrze zweryfikowanym modelem u szczurów. Dostosowaliśmy ten model do stosowania u myszy, co pozwala badaczowi wykorzystać istnienie genetycznie modyfikowanych myszy i zbadać proces zaniku mięśni in vivo przy braku białek kluczowych dla regulacji masy mięśniowej7,8. Mięśnie brzuchaty łydki i płaszczkowaty, oba odnerwione w tym modelu, można łatwo i szybko wypreparować przy minimalnej ...

Odnerwienie mięśni szkieletowych, spowodowane urazowym uszkodzeniem nerwów obwodowych, chorobą lub interwencją farmakologiczną, powoduje natychmiastową utratę funkcji skurczu mięśni. Mięśnie jednocześnie zaczynają zanikać, a atrofia ta jest odwracalna, jeśli w porę nastąpi dobrej jakości unerwienie1,2. W przypadku braku reinerwacji postępuje zanik włókien mięśniowych, a wraz ze zwłóknieniem mięśni i śmiercią włókien dochodzi do nieodwracalnych zmian biologicznych w mięśniach. Tutaj pokazujemy model przecięcia nerwu piszczelowego, model atrofii i zwłóknienia mięśni szkieletowych wywołanych odnerwieniem u myszy. Model ten umożliwia naukowcom badanie fizjologicznych, komórkowych i molekularnych mechanizmów biologicznych, które leżą u podstaw zaniku mięśni in vivo w mięśniach brzuchatych łydki i płaszczkowatych. Chociaż historycznie stosowany głównie u szczurów, nowsze zastosowanie tego modelu do nokautujących i transgenicznych linii myszy, pozwala badaczom ocenić rolę ich konkretnego białka (białek) zainteresowania w indukcji, rozwoju i utrzymaniu lub alternatywnie w ustąpieniu atrofii mięśni i zwłóknienia in vivo.
Nerw piszczelowy jest mieszanym motoryczno-czuciowym nerwem obwodowym w tylnej kończynie gryzonia i jest jednym z trzech końcowych odgałęzień nerwu kulszowego. Przecięcie nerwu piszczelowego odnerwia mięśnie brzuchatego łydki, płaszczkowatego i podeszwowego (oraz trzy małe głębokie mięśnie zginacze stopy, w tym piszczel tylny, zginacz palca długi i zginacz palcowy długi) i jest dobrze ustandaryzowanym i zwalidowanym modelem u szczurów3,4. Mięśnie brzuchaty łydki i płaszczkowaty mogą być łatwo wypreparowane w szeregowych punktach czasowych po przecięciu nerwu piszczelowego, utrwalone i przetworzone w celu oceny histologii mięśni i morfometrii włókien mięśniowych lub błyskawicznie zamrożone w celu ekstrakcji RNA i białka mięśniowego w celu zbadania, na przykład, komórkowych sieci sygnalizacyjnych regulujących zanik mięśni. Mięsień brzuchaty łydki jest mięśniem o mieszanym typie włókien (typ I i typ II, chociaż przeważa typ II), a mięsień płaszczkowaty składa się z dużej części włókien typu I, zapewniając w ten sposób zarówno mięsień szybkokurczliwy, jak i wolnokurczliwy do oceny5,6. Model przecięcia nerwu piszczelowego nadaje się do badania procesu zaniku mięśni wywołanego odnerwieniem zarówno w perspektywie krótkoterminowej (dni)7, jak i długoterminowej (tygodnie do miesięcy)4,8.
W przeciwieństwie do modelu przecięcia nerwu kulszowego (drugi model zaniku mięśni wywołanego odnerwieniem, powszechnie stosowany u gryzoni), przecięcie nerwu piszczelowego wywołuje mniejszą zachorowalność u zwierzęcia, co czyni go bardziej atrakcyjnym modelem. Przecięcie nerwu kulszowego powoduje odnerwienie wszystkich mięśni nogi (poniżej kolana) i stopy, upośledzając zdolność zwierzęcia do poruszania się2, podczas gdy przecięcie nerwu piszczelowego pozostawia nienaruszone gałęzie nerwu strzałkowego i łydkowego nerwu kulszowego, zachowując w ten sposób ich docelowe mięśnie i obszary czuciowe. Mysz nie jest w stanie zgiąć podeszwy ani odwrócić stopy, ale jest w stanie łatwo się poruszać, a ciężar spoczywa równomiernie na obu tylnych kończynach, co znacznie zmniejsza chorobowość modelu. Badania analizy chodu oceniające wzorce chodu przeprowadzono u szczurów po urazach nerwu piszczelowego i kulszowego i wykazały, że odcisk stopy i obciążenie są lepiej zachowane w przypadku urazu piszczelowego9,10. Ponadto, w modelu transsekcji nerwu piszczelowego, nerw strzałkowy może zostać zmobilizowany w późniejszym czasie i przekazany jako źródło opóźnionego unerwienia, jeśli projekt badania wymaga3. Natomiast opóźnione unerwienie w modelu przecięcia nerwu kulszowego wymaga zastosowania przeszczepu nerwu do deficytu nerwu kulszowego, co bardzo znacznie zwiększa trudność techniczną modelu i ogranicza jego zastosowanie do wykwalifikowanych chirurgów.
Podczas gdy model przecięcia nerwu piszczelowego wymaga od operatora zaznajomienia się z sterylną techniką operacyjną w chirurgii zwierząt, zarówno nerw piszczelowy, jak i mięśnie łydek, które unerwia, są łatwo dostępne i możliwe do zidentyfikowania do manipulacji, dzięki czemu osoby, które nie są chirurgami, lub mają duże doświadczenie w chirurgii zwierząt, mogą łatwo opanować ten model.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki i materiały</td></tr><tr><td>10-0 Nici nylonowe</td><td>Ethicon</td><td>2850G</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J553G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Spring nożyczki do mikropreparacji</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>15021-15</td><td></td></tr><tr><td>Ultracienkie kleszcze</td><td>Fine Surgical Narzędzia</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Nieblokujący uchwyt na mikroigłę (sterownik)</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Zwijacz sprężynowy</td><td>Drobne narzędzia chirurgiczne</td><td>17000-02</td><td></td></tr></tbody></table>

przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

Model przecięcia nerwu piszczelowego jest dobrze tolerowanym, sprawdzonym i powtarzalnym modelem atrofii mięśni szkieletowych wywołanej odnerwieniem u gryzoni. Chociaż pierwotnie opracowany i szeroko stosowany u szczurów ze względu na jego większy rozmiar, nerw piszczelowy u myszy jest na tyle duży, że można nim łatwo manipulować za pomocą zgniecenia lub przecięcia, pozostawiając nienaruszone gałęzie nerwu strzałkowego i łydkowego nerwu kulszowego, a tym samym zachowując ich docelowe mięśnie. W związku z tym model ten oferuje zalety wywoływania mniejszej zachorowalności i utrudnień w poruszaniu się niż model przecięcia nerwu kulszowego, a także pozwala badaczom badać fizjologiczne, komórkowe i molekularne mechanizmy biologiczne regulujące proces zaniku mięśni u genetycznie modyfikowanych myszy. Nerw piszczelowy zaopatruje mięśnie brzuchaty łydki, płaszczkowaty i podeszwowy, więc jego przecięcie pozwala na badanie odnerwionych mięśni szkieletowych złożonych z włókien szybkokurczliwych typu II i/lub wolnokurczliwych typu I. Tutaj demonstrujemy model przecięcia nerwu piszczelowego w myszy C57Black6. Oceniamy zanik mięśnia brzuchatego łydki, jako mięśnia reprezentatywnego, po 1, 2 i 4 tygodniach od denerwacji, mierząc masę mięśni i pole przekroju poprzecznego specyficzne dla rodzaju włókien na odcinkach histologicznych zatopionych w parafinie barwionych immunologicznie pod kątem miozyny szybkokurczliwej.

Przecięcie nerwu piszczelowego powoduje denerwację mięśni brzuchatego łydki, płaszczkowatego i podeszwowego. W niniejszym badaniu oceniamy rozwój zaniku w mięśniu brzuchatym łydki jako mięśniu reprezentacyjnym. Mięsień brzuchaty łydki pobrano od myszy szczepu C57Black 6 (Jackson Laboratories) w wieku 2-3 miesięcy, u których denerwacja trwała 1, 2 lub 4 tygodnie. Masa mięśni stopniowo maleje (Rycina 1), podobnie jak pole przekroju szybkokurczliwych włókien mięśniowych typu II (Rycina 2) w...

Model przecięcia nerwu piszczelowego jest dobrze tolerowanym, sprawdzonym i powtarzalnym modelem zaniku mięśni szkieletowych. Modelowy protokół chirurgiczny został opisany i zademonstrowany na myszach C57Black6.

Przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Ogólnym celem niniejszego filmu jest zaprezentowanie modelu zaniku mięśni szkieletowych u myszy poprzez przecięcie nerwu piszczelowego. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wyizolowanie nerwu kulszowego oraz jego trzech odgałęzień: nerwu piszczelowego, nerwu suralnego i nerwu strzałkowego. Po izolacji nerw piszczelowy zostaje przecięty.Po denerwacji ranę zamyka się, a stan zwierzęcia jest ściśle monitorowany. W rezultacie uzyskuje się próbki wykazujące progresywny spadek masy mięśniowej po denerwacji. Model zaniku mięśni szkieletowych indukowanego denerwacją poprzez przecięcie nerwu piszczelowego jest powszechnie stosowanym i dobrze zwalidowanym modelem u szczurów, który wiąże się z znacznie mniejszą zachorowalnością niż model oparty na przecięciu nerwu kulszowego.Zaadaptowaliśmy ten model do zastosowania u myszy, co zostanie tutaj zaprezentowane. Pozwala to badaczowi na wykorzystanie dostępności myszy modyfikowanych genetycznie i badanie procesu zaniku mięśni w przypadku braku białek kluczowych dla regulacji masy mięśni skóry, wywołując przy tym minimalną zachorowalność u zwierzęcia. Najpierw należy zmierzyć masę ciała myszy po potwierdzeniu odpowiedniego znieczulenia za pomocą ucisku palca u nogi, zlokalizować palpacyjnie wcięcie kulszowe, a następnie zgolić boczną stronę uda i pośladek od tego miejsca aż do kolana.Następnie oczyść obszar, wielokrotnie aplikując alkohol i jodowy preparat odkażający. Zakładając sterylne rękawiczki, umieść mysz na boku pod mikroskopem operacyjnym lub stereomikroskopem. Zlokalizuj wcięcie kulszowe metodą palpacyjną.Nacinamy skórę bocznej strony uda od otworu kulszowego do kolana. Delikatnie rozszerzamy brzegi nacięcia skóry. Za pomocą cienkich nożyczek identyfikujemy mięsień dwugłowy uda, który jest płaskim, powierzchownym mięśniem bocznej strony uda, znajdującym się bezpośrednio pod skórą.Przeciąć mięsień dwugłowy uda wzdłuż włókien mięśniowych i wprowadzić retraktor sprężynowy. Aby odsłonić nerw kulszowy i jego odgałęzienia, należy zidentyfikować nerw kulszowy znajdujący się bezpośrednio pod mięśniem dwugłowym uda. Można go rozpoznać po charakterystycznym błyszczącym białym kolorze; jego średnica wynosi około 0.8 mm.Biegnie od wyrostka kulszowego do kolana, rozgałęziając się na nerwy piszczelowy, strzałkowy oraz srodkowy na poziomie dołu podkolanowego. Ostrożnie oddziel gałęzie nerwu piszczelowego od gałęzi nerwu strzałkowego i srodkowego, używając ultraprecyzyjnej pęsety oraz mikronożyczek chirurgicznych. Nerw piszczelowy jest największą gałęzią i zazwyczaj znajduje się centralnie.Ostrożne obchodzenie się z nerwem kulszowym i jego gałęziami jest niezbędne dla powodzenia tej procedury. Należy zadbać o to, aby gałęzie nerwu sromowego i kroczeńca nie zostały uszkodzone ani rozciągnięte. Uszkodzenie lub rozciągnięcie tych gałęzi spowoduje również denerwację ich obszarów docelowych.Utrzymywanie nerwu za samą zewnętrzną warstwę błony zewnętrznej za pomocą pęsety ultra-precyzyjnej oraz pozostawienie go w stanie rozluźnienia pozwoli uniknąć zmiażdżenia nerwu i urazu trakcyjnego podczas tymczasowej denerwacji. W przypadku oczekiwanej pełnej regeneracji w ciągu dwóch do czterech tygodni, należy zmiażdżyć nerw piszczelowy pęsetą ultra-precyzyjną przez 15 sekund, aby uzyskać całkowitą i trwałą denerwację. Nerw piszczelowy należy przeciąć nożyczkami do mikrodissekcji jak najdalej dystalnie. Należy przy tym zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić naczyń podkolanowych, jeśli wymagana jest pełna denerwacja.Przyszyj koniec przeciętego nerwu piszczelowego do powierzchni przedniej mięśnia dwugłowego uda za pomocą nici nylonowej 10-0 i ponownie zbliż mięsień dwugłowy uda szwem z Vicryl 5-0, aby zapobiec aberracyjnej reinnerwacji mięśni brzuchatych łydki i płaszczkowatych. Po zakończeniu denerwacji zamknij skórę szwem ciągłym z Vicryl 5-0. Po przygotowaniu wyłącz anestetyk wziewny, zachowując jednocześnie przepływ tlenu.Po podaniu pojedynczej dawki leku przeciwbólowego umieść mysz w ciepłej, czystej klatce bez ściółki. Pozostaw mysz pod bezpośrednią obserwacją do momentu odzyskania zdolności poruszania się. Po pełnym powrocie do sprawności przenieś mysz do czystej klatki z pełnym dnem i obfitą ilością miękkiej ściółki.Codziennie należy badać operowaną kończynę oraz stopę pod kątem powstawania odleżyn piętowych lub oznak obgryzania; drobne problemy można leczyć za pomocą antybiotyków lub środków antyseptycznych stosowanych miejscowo, takich jak jodyna. Wskaźnikami końcowymi wymagającymi eutanazji zwierzęcia są utrata masy ciała, oznaki zaniedbania higieny osobistej oraz zgarbiona postawa. Ponadto zwierzęta z rozpadem rany lub owrzodzeniami, które nie goją się w ciągu jednego do dwóch tygodni pielęgnacji rany, również powinny zostać uśmiercone.Dodatkowo, w przypadku zwierząt odczuwających nadmierny ból w okresie pooperacyjnym, pobiera się pożądane tkanki do analizy. Po eutanazji należy ogolić wewnętrzną stronę obu kończyn – operacyjnej oraz przeciwległej kontrolnej – i oczyścić je alkoholem. Pracując pod mikroskopem sekcyjnym, należy skalpelem naciąć skórę wewnętrznej strony łydki od kostki do kolana oraz okrężnie wokół kostki w kończynie operacyjnej. Następnie należy delikatnie odsunąć skórę od mięśnia, przesuwając ją proksymalnie w stronę uda.Aby odsłonić wszystkie mięśnie nogi, należy zidentyfikować mięsień brzuchaty łydki, który znajduje się na tylnej powierzchni nogi i biegnie od kolana do kostki. Następnie należy zlokalizować dystalne przyczepy mięśnia dwugłowego uda, znajdujące się proksymalnie względem mięśnia brzuchatego łydki po stronie przyśrodkowej kolana. W miejscu przyczepu dystalnego mięsień dwugłowy uda wydaje się cienki i błonisty oraz pokrywa najbardziej proksymalną część mięśnia brzuchatego łydki; należy go odsłonić, używając nożyczek i rozwarstwiania tępym końcem narzędzia.Ostrożnie oddziel dystalne przyczepy mięśnia dwugłowego uda od mięśnia brzuchatego łydki. W miejscu jego dystalnego przyczepu do kości piętowej mięsień brzuchaty łydki przechodzi w ścięgno Achillesa. Zidentyfikuj ścięgno Achillesa, które ma biały, włóknisty wygląd.Uchwyć ścięgno Achillesa pęsetą. Uważając, aby nie chwytać ani nie zmiażdżyć mięśnia brzuchatego, oddziel ścięgno Achillesa od przyczepu do kości piętowej. Używając nożyczek i nadal trzymając ścięgno, delikatnie unieś bladoróżowy mięsień brzuchaty znad ciemnoróżowego mięśnia płaszczkowatego, przesuwając się od przyczepu dystalnego w kierunku jego początku w kolanie, stosując bardzo delikatną trakcję.Aby ułatwić ten proces, odseparuj mięsień brzuchaty łydki od nogi, przecinając jego przyczepy od przyśrodkowego i bocznego kłykcia kości udowej. Użyj do tego nożyczek. Należy uważać, aby nie zmiażdżyć mięśnia.Mięsień płaszczkowaty będzie teraz wyraźnie widoczny bezpośrednio pod brzuścem mięśnia brzuchatego. Odseparuj mięsień płaszczkowaty, zaczynając od jego przyczepu do ścięgna Achillesa, aż do jego początku na tylnej części łydki. Po usunięciu zważ mięśnie oddzielnie na wadze precyzyjnej.Następnie podzielone mięśnie należy przeciąć pionowo na pół: jedną część do szybkiego mrożenia w ciekłym azocie, a drugą do badań histologicznych. Na koniec powtórzyć powyższe procedury na przeciwległej stronie kontrolnej w celu pobrania kontrolnych mięśni brzuchatych oraz płaszczowatych. Mięśnie brzuchate pobrano z kończyn tylnych zdenerwowanych oraz przeciwległych kontrolnych w pierwszym, drugim lub czwartym tygodniu, a wyniki przedstawiono w formie stosunku.Denerwacja wywołała postępującą utratę masy mięśniowej w czasie. Pole przekroju poprzecznego włókien mięśniowych zmierzono po barwieniu immunologicznym, jak pokazano tutaj. Szybkokurczliwe włókna typu dwa barwią się na brązowo, a wolnokurczliwe włókna typu jeden barwią się na biało.W odnerwionym mięśniu zaobserwowano progresywny spadek pola przekroju poprzecznego włókien szybkokurczliwych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić przecięcie nerwu piszczelowego u myszy. Pozwala to na stworzenie powtarzalnego, solidnego i dobrze zwalidowanego modelu zaniku mięśni szkieletowych indukowanego odnerwieniem.

tibial-nerve-transection-standardized-model-for-denervation-induced

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przecięcie nerwu piszczelowego - Znormalizowany model atrofii mięśni szkieletu wywołanej denerwacją u myszy

Opisano tutaj model zwierzęcy Spared Nerve Injury jako mysi model obwodowego bólu neuropatycznego po częściowej denerwacji nerwu kulszowego poprzez uszkodzenie gałęzi nerwu piszczelowego i wspólnego strzałkowego, przy zachowaniu nienaruszonego nerwu podszywkowego. Modyfikację behawioralną wynikającą z allodynii mechanicznej ilościowo określono za pomocą włókien von Freya.

Model Spared Nerve Injury (SNI) indukowanej allodynii mechanicznej u myszy

Źródło: Brakkee, E. M.,  i wsp. Chirurgia i testy behawioralne w modelu transpozycji nerwiaka piszczelowego u szczurów. J. Vis. Exp. (2023). Ten film przedstawia procedurę generowania modelu transpozycji nerwiaka piszczelowego szczura (TNT). Po odsłonięciu nerwu piszczelowego w tylnej nodze znieczulonego szczura, przeciąć nerw. Następnie utwórz tunel podskórny, przeciągnij przecięty nerw przez tunel i zszyj go na miejscu. W przypadku braku celu do reinerwacji, zdezorganizowane wyrostki...

Generowanie szczurzego modelu transpozycji nerwiaka piszczelowego

Prezentujemy protokół chirurgiczny szczegółowo opisujący, jak wykonać aksotomię cięcia lub zgniecenia nerwu twarzowego u myszy. Akskotomia nerwu twarzowego może być wykorzystana do badania fizjologicznej reakcji na uszkodzenie nerwu i testowania technik terapeutycznych.

Aksotomia nerwu twarzowego u myszy: model do badania reakcji neuronów ruchowych na uraz

Ocena regeneracji motorycznej pozostaje punktem odniesienia w eksperymentalnych badaniach nerwów obwodowych. Izometryczny pomiar siły tężcowej mięśnia piszczelowego przedniego u szczura jest nieocenionym narzędziem do oceny wyników funkcjonalnych po rekonstrukcji wad nerwu kulszowego. Metody i niuanse są szczegółowo opisane w tym artykule.

Maksymalny izometryczny pomiar siły tężcowej mięśnia piszczelowego przedniego u szczura

Kwantyfikacja maksymalnej siły prostownika kolana jest niezbędna do zrozumienia funkcjonalnych adaptacji do starzenia się, chorób, urazów i rehabilitacji. Przedstawiamy nowatorską metodę wielokrotnego pomiaru in vivo izometrycznego szczytowego momentu obrotowego tężcowego wyprostu kolana.

Pomiar in vivo funkcji mięśni prostowników stawu kolanowego u myszy

Zmodyfikowana operacja to uproszczona metoda dla modelu uszkodzenia nerwu oszczędzonego u myszy lub szczura, która wymaga tylko jednego podwiązania i jednego cięcia, aby uszkodzić zarówno wspólne nerwy strzałkowe, jak i łydkowe.

Zmodyfikowany model chirurgii oszczędzonego uszkodzenia nerwu bólu neuropatycznego u myszy

Ten protokół opisuje model transpozycji nerwiaka piszczelowego, który pociąga za sobą uszkodzenie nerwu piszczelowego z późniejszą transpozycją końca nerwu proksymalnego w kierunku podskórnej pozycji przedpiszczelowej lub bocznej. Testy behawioralne bólu nerwiaka i hiperalgezji podeszwowej określa się ilościowo przy użyciu monofili von Freya.

Chirurgia i testy behawioralne w modelu transpozycji nerwiaka piszczelowego u szczurów

Ten protokół pokazuje, jak wykonać amputację poniżej kolana u szczurów i natychmiast przeprowadzić ukierunkowaną reinnerwację mięśni (iTMR), aby zbadać strategie leczenia i zapobiegania bólowi związanemu z amputacją oraz lepiej zrozumieć mechanizmy bólu związane z amputacją.

Model ćwiczeniowy amputacji kończyny dolnej szczura poniżej kolana i natychmiastowa ingerencja mięśniowa

Protokół ten przedstawia powtarzalny model szczura wykorzystujący nerwy czuciowe do naśladowania bólu neuromimy u człowieka oraz oceny zabiegów chirurgicznych, oferując cenne narzędzie do badań nad neuromią translacyjną.

Nowy chirurgiczny model gryzonia do badania opcji leczenia bólu nerwiaka z wykorzystaniem ukierunkowanej renerwacji mięśni przez nerw odpiszczelowy

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Poznaj model przecięcia nerwu piszczelowego u myszy do badania atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją. Ta metoda oferuje niską śmiertelność i pozwala monitorować postępujący spadek masy mięśniowej po zabiegu chirurgicznym.

Przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy

Przeglądaj więcej filmów