Name: Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-07T22:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodologię decelularyzacji jelita szczura w celu produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej. Technika ta zachowuje mikroarchitekturę tkanek i sieć naczyniową, umożliwiając zastosowania w inżynierii tkankowej oraz testowaniu leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Instytutowi Medycyny Regeneracyjnej Wake Forest za pomoc w opracowaniu tego protokołu. Dziękujemy za wsparcie w postaci dotacji od organizacji charytatywnej Great Ormond Street Hospital, Fundacji Eugenio Litta (Genewa, Szwajcaria), Rady Badań Medycznych, Królewskiego Kolegium Chirurgów Anglii, Sparks Children's Medical Charity, brytyjskiego Ministerstwa Spraw Zagranicznych na rzecz brytyjsko-amerykańskiej współpracy w dziedzinie komórek macierzystych oraz Mittal Research Fund. Dziękujemy również Royal Society/ Wolfson Foundation za uzyskany grant na remont laboratorium inżynierii tkankowej dla Oddziału Chirurgii Dziecięcej w Instytucie Zdrowia Dziecka. PDC i SE są wspierane przez Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

1. Izolacja jelita szczura
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (Sigma, Wielka Brytania) z 1% antybiotykiem/antybiotykiem (Sigma, Wielka Brytania) (PBS/AA). Zamontuj pompę perystaltyczną (Masterflex L/S o zmiennej prędkości) z dwiema rurkami. Przepuścić 70% etanolu (EtOH) przez rurki pompy perystaltycznej przez 15 minut z maksymalną prędkością, a następnie PBS/AA przez kolejne 15 minut.</li>
	<li>Poddaj eutanazji dorosłe szczury Sprague-Dawley o wadze około 250-350 g poprzez wdychanie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z lokalnymi wytycznymi i zezwoleniami dla zwierząt (w Wielkiej Brytanii wytyczne Ministerstwa Spraw Wewnętrznych na mocy ustawy o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r.).</li>
	<li>Autoklaw narzędzi chirurgicznych przed użyciem. Spryskaj i wytrzyj brzuch zwierzęcia za pomocą 70% EtOH.</li>
	<li>Wykonaj laparotomiczne nacięcie xifo-łonowe na brzuchu, aby zapewnić czyste pole operacyjne.</li>
	<li>Wypatroszyć jelito cienkie po prawej stronie zwierzęcia na ręcznik papierowy spryskany 70% EtOH. Należy pamiętać o ciągłym zwilżaniu jelita PBS/AA, aby uniknąć odwodnienia tkanki i denaturacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).</li>
	<li>Zlokalizuj tętnicę krezkową górną (SMA) powstającą pod kątem 90° od aorty w kierunku jelita. Użyj kaniuli 27 G, aby wprowadzić się do SMA z aorty i szybko wycofaj igłę, aby uniknąć rozerwania ściany naczynia. Wsuń plastikową rurkę kaniuli do SMA i zabezpiecz za pomocą szwów (Vicryl 5/0).</li>
	<li>Potwierdź kaniulację, wstrzykując 1 ml PBS/AA. Za pomocą nożyczek sprężynowych naciąć aortę proksymalną i dystalną do SMA, aby uwolnić kaniulę.</li>
	<li>Aby uniknąć wycieku kału podczas wycinania jelita grubego, umieść jeden węzeł szwu (Silk 5/0) na bliższym końcu połączenia krętniczo-kątniczego i jeden na dystalnym końcu esicy. Następnie przetnij końcowe jelito kręte i okrężnicę między dwoma węzłami i usuń jelito grube.</li>
	<li>Przeciąć jelito na połączeniu jelita czczego i dwunastnicy i uwolnić jelito od wszelkich połączeń tkanki łącznej, które może mieć z jamą brzuszną.</li>
	<li>Przenieść jelito cienkie na szalkę Petriego z PBS/AA. Kankaniuluj proksymalny odcinek jelita za pomocą plastikowej pipety Pasteura (LSL Laboratory Consumables) i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą szwów. Przyciąć pipetę tak, aby pasowała do Luer-Lok strzykawki o pojemności 60 ml (BD Plastipak). Przepłucz światło jelita 2x 60 ml PBS/AA w celu usunięcia kału i zanieczyszczeń.</li>
</ol>
2. Metodologia decelularyzacji
<ol>
	<li>Podłącz kaniulę naczyniową do trójdrogowego kranu. Ułatwi to obsługę, zminimalizuje naprężenia na drzewie naczyniowym i umożliwi usunięcie pęcherzyków z rurki. </li>
	<li>Rozpocznij przepuszczanie wody dejonizowanej (rezystywność 18,2 MΩ/cm) przez pompę rolkową Masterflex L/S o zmiennej prędkości z prędkością 0,6 ml/h. Upewnij się, że w rurce nie ma pęcherzyków przed podłączeniem do kurka światła jelitowego. Niektóre pęcherzyki mogą być obecne w świetle od kroku 1.9, co może upośledzać proces decelularyzacji. Zmieniaj prędkość pompy i ostrożnie obchodź się z tkanką kleszczami, aby upewnić się, że pęcherzyki wydostają się z dystalnego końca. Nie podłączaj kaniuli naczyniowej, dopóki ten proces nie zostanie zakończony, ponieważ duże prędkości mogą uszkodzić drzewo naczyniowe.</li>
	<li>Przenieść aparaturę do chłodni, ponieważ następny etap decelularyzacji przeprowadza się w temperaturze 4 °C. Niska temperatura pozwala na usunięcie komórek przy jednoczesnym zminimalizowaniu rozkładu tkanek. Umieść szalkę Petriego w pojemniku, który zbierze przelewający się roztwór. Perfuzję zarówno światła jelita, jak i drzewa naczyniowego wodą dejonizowaną (rezystywność 18,2 MΩ/cm) przez 24 godziny przy 0,6 ml/h. Przez pierwszą godzinę regularnie sprawdzaj aparat, aby upewnić się, że wszystkie połączenia są bezpieczne, wyciek jest minimalny, a w jelicie nie ma pęcherzyków.</li>
	<li>Po 24 godzinach leczenia wodą dejonizowaną należy przenieść aparat do decelularyzacji na zewnątrz chłodni, ponieważ pozostałe etapy są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Zważyć deoksycholan sodu (Sigma, Wielka Brytania), aby przygotować 300 ml 4% roztworu w wodzie dejonizowanej. Zważyć deoksycholan sodu pod ssawką, ponieważ działa drażniąco na jamę ustną i oczy. Mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny. Roztwór można utrzymywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Zamień roztwór dejonizowany na deoksycholan sodu, sprawdź połączenia, usuń wszelkie pęcherzyki i perfuzuj w tempie 0,6 ml/h przez 4 godziny.</li>
	<li>Po etapie deoksycholanu sodu przemyć PBS/AA przez 30 minut, aby uniknąć interakcji między deoksycholanem sodu a DNazą-I.</li>
	<li>Odważyć dezoksyrybonukleazę-I (DNazę-I, Sigma) i przygotować 250 ml roztworu o stężeniu 2 000 kU w 1 M chlorku sodu o pH 7,4. Mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i nie można go przechowywać.</li>
	<li>Utylizować z DNazą-I przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z prędkością 0,6 ml/h.</li>
	<li>Postępując zgodnie z krokiem DNase-I, przenieś rusztowanie do okapu do hodowli tkankowej i zmień płytki i narzędzia. Zaleca się stosowanie techniki aseptycznej.</li>
	<li>Myć PBS/AA przez 30 minut, aby upewnić się, że wszystkie pozostałości roztworów decelularyzacyjnych zostały usunięte. Umieść rusztowanie na nowej szalce Petriego i przenieś do urządzenia sieciującego UV (Spectroline, USA). Uruchom dwa cykle sterylizacji. Przechowywać w 5% PBS/AA i zmieniać roztwór co 3 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li>
<li>Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li>
<li>Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+transplantation+of+a+bioengineered+airway+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiov.+Surg%22%5BJournal%5D)">First human transplantation of a bioengineered airway tissue.</a> J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li>
<li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+a+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multicellular+Approach+Forms+a+Significant+Amount+of+Tissue-Engineered+Small+Intestine+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+optimizes+the+formation+of+tissue-engineered+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine.</a> Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).</li>
<li>Chen, M. K., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+bowel+tissue+engineering+using+small+intestinal+submucosa+as+a+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold.</a> J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).</li>
<li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+small+intestinal+submucosa+as+a+small+bowel+graft+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model.</a> J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).</li>
<li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+evaluation+of+regenerated+small+bowel+by+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa.</a> J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).</li>
<li>Hori, Y., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+on+tissue+engineering+of+the+small+intestine+by+mesenchymal+stem+cell+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding.</a> J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).</li>
<li>Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+tissue-engineered+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in tissue-engineered small intestine.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).</li>
<li>Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+matrices%2C+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method%2C+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Int%22%5BJournal%5D)">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).</li>
<li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , 1-8 (2010).</li>
<li>Uygun, B. E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li>
<li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+lung+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).</li>
<li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li>
<li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li>
<li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Najtrudniejsze kroki w przygotowaniu tego eksperymentu obejmują kaniulację SMA oraz ustanowienie i utrzymanie sterylności. Kaniulacja SMA u gryzoni bez pęknięcia ściany może być dość trudna ze względu na rozmiar i położenie naczynia. Alternatywnie, szew może być założony wokół bliższej aorty przed powstaniem SMA, a następnie kaniulacja samej aorty dystalnie, kierując plastikową kaniulę do SMA. Podczas decelularyzacji połączenie złego ułożenia kaniuli i wysokich prędkości przepływu może spowodować utratę dostępu naczyniowego. Bezpłodność jest poważnym problemem ze względu na ilość flory bakteryjnej obecnej w jelicie cienkim. Mycie PBS/AA po zbiorach jest bardzo ważne, a wszelkie ślady kału lub zanieczyszczeń należy usunąć ze światła. Umieszczenie części rusztowania w probówce sokoła z DMEM w inkubatorze po sterylizacji UV powinno być wskaźnikiem, czy osiągnięto sterylność. W przypadku kolonizacji bakteryjnej pożywka zmieni pH, a jego kolor zmieni się z czerwonego na żółty. Aby sobie z tym poradzić, zaleca się dalsze cykle UV, a także mycie PBS zawierającym wysokie stężenie antybiotyku/antybiotyku.
Możliwą modyfikacją w celu uzyskania rusztowania z dostępem zarówno naczyniowym, jak i żylnym byłaby kanniulacja żyły głównej dolnej (IVC), a także SMA. Decelularyzacja od strony żylnej i naczyniowej powinna być podejmowana z przerwami dla wszystkich trzech roztworów. Ciągła decelularyzacja może spowodować pęknięcie naczyń włosowatych poprzez dodatnie ciśnienie po obu stronach.
Na przestrzeni lat podjęto szereg wysiłków w zakresie TE jelitowego przy użyciu różnych kombinacji komórek i rusztowań in vitro i in vivo6,9,12. Większość prac została wykonana przy użyciu rusztowań z włókniny rurkowej 95% PGA-5% PLGA pokrytych kolagenem typu I6,7,13,22. Po wysianiu za pomocą nabłonkowych jednostek organoidowych nabłonka jelitowego (OU) i okresie implantacji w sieci myszy, tworzą torbiele z mięśniami na zewnątrz i nabłonkiem wewnątrz, które można następnie zrurkować. Jednak porowatość i prostota konstrukcji tych rusztowań nie pozwala na wytwarzanie dużych fragmentów sztucznego jelita w środowisku in vitro , takim jak bioreaktor. Dodatkowo, brak wrodzonej sieci naczyniowej, którą można połączyć z biorcą, dodatkowo ogranicza użycie tego rusztowania do tłumaczenia klinicznego. Oprócz eksperymentów z rusztowaniami PGA-PLGA, inne grupy używały rusztowań kolagenowych lub SIS, które nie odtwarzają złożoności przewodu pokarmowego. W szczególności SIS jest jedyną wcześniej opublikowaną metodologią inżynierii tkanki jelitowej i była stosowana w ponad 150 środowiskach medycznych, wykazując zdolność rusztowań bezkomórkowych do zapewniania stabilności mechanicznej i promowania wzrostu komórek, jednocześnie prowadząc do braku odpowiedzi immunogennej. Jednak brak odpowiedniej makro- i mikroarchitektury doprowadził do słabych wyników w jego stosowaniu do celów jelitowych TE9-11,23.
Korzyści płynące z opisanej przez nas metodologii decelularyzacji obejmują zachowanie cech mikroskopowych, takich jak architektura kosmków krypty świetlnej, które reprezentują odpowiednie środowisko do ponownego zasiedlenia przez niszę jelitowych komórek macierzystych. W aspekcie makroskopowym obecność hierarchicznej sieci naczyniowej umożliwi przywiązanie do biorcy, umożliwiając dostarczanie składników odżywczych i tlenu do wszystkich warstw jelita TE21. Co więcej, utrzymanie składników ECM, takich jak kolagen, elastyna i gliokozaminoglikany, odgrywa ważną rolę nie tylko dla właściwości mechanicznych, ale także dla kierowania proliferacją i różnicowaniem komórek. Co najważniejsze, zdolność metodologii decelularyzacji do skalowania do większych tkanek przy zachowaniu tych samych cech jest ważną cechą dla klinicznego translacji TE.
Opracowanie naturalnej macierzy jelitowej z siecią naczyniową pozwala na tworzenie większych segmentów sztucznego jelita, które można połączyć z gospodarzem.

Inżynieria tkankowa (TE) stanowi terapeutyczną alternatywę dla transplantacji narządów, omijając problemy immunosupresji i niedoboru narządów. TE ma ostatnio udane zastosowania w klinice, z wymianą narządów, takich jak pęcherzmoczowy 1, cewka moczowa2 i tchawica, zarówno u dorosłych3,4, jak i dzieci5.
Budowa organu inżynierii tkankowej wymaga połączenia rusztowania z odpowiednimi komórkami. Rusztowanie można przygotować przy użyciu składników pochodzenia naturalnego (np. kolagen) i syntetycznych (np. kwas poli-L-glikolowy; PLGA) lub być otrzymywane przez decelularyzację natywnych narządów i tkanek. Rusztowania, które do tej pory były stosowane w leczeniu TE w jelitach, były głównie pozbawione komórek (błona podśluzowa jelita cienkiego) lub syntetyczne (kwas poli-L-glikolowy i kwas polimlekowy)6-13. Te biomateriały są bardzo proste zarówno pod względem makro, jak i mikroarchitektury, co może nie być idealne, jeśli jelito modyfikowane tkankowo ma być klinicznie translowane. Optymalny biomateriał dla jelita powinien mieć wrodzone drzewo naczyniowe, które można podłączyć do dopływu krwi gospodarza, wielopoziomową ścianę rurkową o różnych właściwościach, które odbijają warstwy ściany jelita oraz oś kosmka-krypta po stronie światła, aby pomóc w ponownym zasiedleniu przez nabłonkowe komórki macierzyste.
Decelularyzacja to nowatorska metodologia, która tworzy rusztowania poprzez usuwanie komórek z całych narządów, zachowując ich oryginalną architekturę14. Jest to lepsze niż już istniejące rusztowania, ponieważ nie tylko replikują strukturę narządu, ale także zawierają sygnały chemiczne osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które wspomagają proliferację i różnicowanie komórek. W 2008 r. tchawica zwłok została pozbawiona komórek14, obsiana własnymi komórkami pacjenta i przeszczepiona w celu zastąpienia głównego lewego oskrzela u młodego mężczyzny3. Od tego czasu wiele grup zgłosiło produkcję bezkomórkowych rusztowań dla serca15, wątroby16,17 i płuc18-20 u małych i dużych zwierząt.
Dostosowaliśmy również tę samą metodologię do produkcji rusztowania bezkomórkowego dla jelita cienkiego21. Celem opisanej w niniejszym dokumencie metody jest wytworzenie bezkomórkowych matryc jelitowych, które zachowują makroskopowe cechy oryginalnej tkanki, takie jak ukrwienie, a także mikroskopijną architekturę osi kosmek-krypta w świetle jelita. Uważamy, że ta metodologia może ostatecznie zostać zastosowana w innych narządach w celu poprawy skuteczności decelularyzacji.

<table><tbody><tr><td>Roztwór etanolu, 70% w H20</td><td>Sigma</td><td>02877</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami</td><td>Sigma</td><td>79382</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100x)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Działa drażniąco na jamy ustne i oczy; ochrona użytkowania</td></tr><tr><td>Chlorek</td><td></td><td></td><td></td> sodu</tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydła</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Skuteczna inżynieria tkankowa polega na połączeniu rusztowań z odpowiednimi komórkami in vitro lub in vivo. Rusztowania mogą być syntetyczne, pochodzenia naturalnego lub pochodzące z tkanek/narządów. Te ostatnie uzyskuje się za pomocą techniki zwanej decelularyzacją. Decelularyzacja może obejmować połączenie metod fizycznych, chemicznych i enzymatycznych. Celem tej techniki jest usunięcie wszystkich śladów komórkowych przy jednoczesnym zachowaniu makro- i mikroarchitektury pierwotnej tkanki.
Inżynieria tkankowa jelit do tej pory używała stosunkowo prostych rusztowań, które nie odtwarzają skomplikowanej architektury rodzimego organu. Celem tego artykułu jest opisanie skutecznej techniki decelularyzacji jelita cienkiego szczura. Opisano izolację jelita cienkiego w celu zapewnienia utrzymania połączenia naczyniowego. Przedstawiono również kombinację roztworów chemicznych i enzymatycznych w celu usunięcia komórek przy jednoczesnym zachowaniu osi kosmek-krypta w aspekcie świetlnym rusztowania. Na koniec omówiono ocenę produkowanych rusztowań pod kątem odpowiednich charakterystyk.

Po pomyślnej decelularyzacji (Rysunek 1), rusztowanie powinno mieć wygląd makroskopowy zbliżony do natywnego jelita, jednak z półprzezroczystymi ścianami (Rysunek 2A). Zachowanie makroarchitektury powinno być również widoczne poprzez drożność drzewa naczyniowego. Po wstrzyknięciu barwnika przez kaniulę SMA powinien on równomiernie rozprowadzić się w całym rusztowaniu i dotrzeć do sieci naczyń kapilarnych (Rysunek 2B). Rusztowanie powinno być wolne od materiału jądrowego i cytoplazmatycznego, co można ocenić za pomocą zestawu do ilościowego oznaczania DNA oraz prostej analizy histologicznej. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) powinno wykazać brak materiału jądrowego i cytoplazmatycznego, przy jednoczesnym zachowaniu warstw jelita cienkiego (Rysunek 3A). W szczególności, po badaniu za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, widoczne powinno być zachowanie kosmków i krypt po stronie światła jelita (Rysunek 4). Oczekuje się również zachowania składników macierzy pozakomórkowej, takich jak kolagen, elastyna i glikozaminoglikany. Na przykład, barwienie metodą trichromu Massona wykazuje nienaruszoną tkankę łączną w rusztowaniu (Rysunek 3B).
<img alt="Schemat harmonogramu konserwacji jelita cienkiego;y obróbka NaDeoxy, DNAse-I; etapy roztworu PBS/AA." fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Plan eksperymentalny. Harmonogram procedury decelularyzacji; PBS/AA: fosforanowy bufor solny z antybiotykiem i środkiem przeciwgrzybiczym, NaDeoxy:todecylochlorek sodu, RT: temperatura pokojowa, DNAse-I: doksyrybonukleaza-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Porównanie technik perfuzji, szalek Petriego, demonstracja przepływu krążenia, układ doświadczalny." fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Makroskopowe charakterystyki rusztowania. Wygląd makroskopowy jelita cienkiego szczura po udanej decelularyzacji (A). Wstrzyknięcie barwnika Rosso Ponceau przez SMA wykazuje nienaruszoną sieć naczyniową (B) ; SMA: tętnica krezkowa górna <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Porównanie barwień histologicznych, obrazy mikroskopowe, kontrast barwników tkankowych, analiza strukturalna." fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Histologia. Barwienie H&amp;E (A) oraz MT (B) wykazują brak materiału komórkowego przy zachowaniu architektury tkanki łącznej; H&amp;E: hematoksylina i eozyna, MT: trichrom Massona. Pasek skali: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Obraz SEM tekstury powierzchni liścia; szczegół struktury epidermy; badanie biologii roślin; mikrografia." fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Mikroskopia elektronowa. Skaningowa mikroskopia elektronowa wykazuje zachowaną architekturę kosmków i krypt w świetle rusztowania; Pasek skali: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.

Artykuł opisuje metodologię produkcji bezkomórkowej macierzy z jelita szczura. Wyprowadzenie rusztowań jelitowych jest ważne dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej, biologii komórek macierzystych i testowaniu leków.

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie naturalnego rusztowania acelularnego do inżynierii tkanki jelita. Osiąga się to poprzez uprzednie wprowadzenie kaniuli do tętnicy krezkowej górnej (SMA) szczura oraz pobranie jelita cienkiego wraz z dostępem naczyniowym. W drugim kroku wypłukuje się zanieczyszczenia z wnętrza światła jelita, a kaniule doprzewodowe i naczyniowe podłącza się do pompy perystaltycznej.Następnie jelito cienkie jest perfundowane wodą dejonizowaną przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W ostatnim kroku jelito cienkie jest perfundowane roztworem deoksycholanu sodu i DNazy w temperaturze pokojowej. Ostatecznie całkowitą decelularyzację jelita cienkiego, a także jego architekturę i składniki można zwizualizować odpowiednio za pomocą histologii oraz mikroskopii elektronowej.Obecnie mierzymy się z klinicznym problemem niewydolności jelit, która jest wyniszczającym stanem dotykającym zarówno dzieci, jak i dorosłych. Żywienie pozajelitowe oraz konwencjonalna transplantacja nie zapewniają pełnego wyleczenia. Produkcja trójwymiarowego unaczynionego rusztowania jelitowego, zaprezentowana w poniższym filmie, stanowi krok w kierunku terapii niewydolności jelit.Wyjątkową cechą tej techniki jest to, że zastosowanie łagodnych odczynników do decelularyzacji pozwala zachować mikroarchitekturę jelit, co potwierdzają wyniki z mikroskopu elektronowego. Ponadto utrzymanie hierarchicznej sieci naczyniowej po decelularyzacji umożliwia zasiedlenie struktury, która może zostać ponownie połączona z organizmem biorcy. Zaopatrzenie w krew: rozpocząć należy od wyposażenia pompy perystaltycznej w dwie rurki, następnie przepuścić przez rurki pompy perystaltycznej 70% etanol przez 15 minut z maksymalną prędkością, a po tym świeżo przygotowany PBS AA przez kolejne 15 minut.Po przepłukaniu pompy spryskaj i przetrzyj brzuch uśpionego szczura linii Sprague-Dawley o masie od 250 do 350 g 70% etanolem. Następnie, używając wysterylizowanych w autoklawie narzędzi chirurgicznych, wykonaj nacięcie laparotomii łonowej w kształcie litery XO na brzuchu, aby zapewnić czyste pole operacyjne, i wysuń jelito cienkie na prawą stronę zwierzęcia, kładąc je na ręczniku papierowym spryskanym 70% etanolem. Należy zadbać o ciągłe nawilżanie jelita roztworem P-B-S-A-A, aby uniknąć odwodnienia tkanki oraz denaturacji macierzy zewnątrzkomórkowej.Następnie zlokalizuj tętnicę krezkowa górna (SMA), która odgałęzia się od aorty pod kątem 90 stopni w kierunku jelit. Załóż szew wokół SMA i przygotuj węzeł. Użyj kaniuli o rozmiarze 27 G, aby wprowadzić ją do SMA z poziomu aorty, a następnie szybko wycofaj igłę, aby uniknąć przerwania ściany naczynia.Następnie wprowadź plastikową rurkę kaniuli do SMA, mocując rurkę szwami Vicryl 5-0, a potem wstrzyknij 10 ml PBSA, aby potwierdzić prawidłowe ukaniulowanie. Dalej, używając nożyczek, nacinaj aortę proksymalnie i dystalnie względem SMA, aby zwolnić kaniulę i zapobiec wyciekowi treści kałowej podczas wycinania jelita grubego; zawiąż jeden węzeł szwem jedwabnym 5-0 na końcu proksymalnym połączenia kątniczo-krętniczego oraz jeden na końcu dystalnym okrężnicy esowca. Następnie przetnij końcowy odcinek jelita cienkiego oraz jelito grube pomiędzy obydwoma węzłami i usuń jelito grube.Następnie przetnij jelito cienkie na połączeniu dwunastniczo-jelitowym i uwolnij jelito z wszelkich połączeń z tkanką łączną, jakie może mieć z jamą brzuszną. Przenieś jelito cienkie do szalki Petriego zawierającej PBS aa. Następnie za pomocą plastikowej pipety tylnej przeprowadź kanulację proksymalnego odcinka jelita, mocując go w miejscu za pomocą szwów.Na koniec przytnąć pipetę tak, aby pasowała do złącza luer lock strzykawki o pojemności 60 ml, a następnie przepłukać światło jelita dwukrotnie 60 ml PBSAA, aby usunąć kał i zanieczyszczenia. Przed rozpoczęciem procesu decelularyzacji należy upewnić się, że w świetle jelita oraz w kaniulach naczyniowych nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie podłączyć kranik trójdrożny do kaniuli naczyniowej i umieścić szalkę Petriego w pojemniku, aby zbierać nadmiar roztworu. Następnie rozpocząć przepływ wody dejonizowanej za pomocą pompy perystaltycznej Master Flex LS o regulowanej prędkości z przepływem 0,6 ml/h.Należy ostrożnie obchodzić się z tkanką, aby zapewnić wydostanie się pęcherzyków powietrza z końca dystalnego. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków z kaniul, należy przenieść aparat do pomieszczenia chłodniczego. Następnie należy rozpocząć proces decelularyzacji poprzez perfuzję światła jelita oraz drzewa naczyniowego bieżącą wodą dejonizowaną przez 24 godziny, z przepływem 0.6 milliliters per hour podczas pierwszej godziny.Regularnie sprawdzać aparatę, aby upewnić się, że wszystkie połączenia są szczelne. Wyciek powinien być minimalny, a wewnątrz jelita nie powinny znajdować się pęcherzyki powietrza. Po 24 godzinach przenieść aparatę do decelularyzacji z powrotem do temperatury pokojowej.Kolor jelita pod maską ssącą powinien zmienić się na jasnoróżowy. Odważ odpowiednią ilość dejksydekoatu sodu, aby przygotować 4% roztwór w 300 mililitrach wody dejonizowanej. Użyj voreksu do mieszania roztworu, aż stanie się on klarowny.Następnie zastąp roztwór dejonizowany roztworem doksylanu sodu. Sprawdź szczelność połączeń. Usuń pęcherzyki powietrza i perfunduj jelito cienkie z prędkością 0,6 milliliters per hour przez cztery godziny.Po etapie odbarwiania sodowego (sodium deoxycollate), tkanka staje się przezroczysta. Zachowanie sieci naczyniowej staje się widoczne po dodaniu PBS AA do pompy. Przemyj jelito roztworem PBS AA przez 30 s, aby uniknąć oddziaływań między sodium deoxycollate a DNA.Następnie poddaj tkankę perfuzji świeżo przygotowanymi DNAs, z których jeden znajduje się w temperaturze pokojowej, przy prędkości 0,6 milliliters per hour. Po trzech godzinach przenieś rusztowanie do komory z laminarnym przepływem powietrza i, stosując technikę aseptyczną, wymień płytkę. Ponownie wysterylizuj dreny pompy perystaltycznej, przepuszczając przez nie etanol.Przepłucz jelito po raz ostatni w PBSAA przez 30 minut, aby upewnić się, że wszystkie pozostałości roztworów do decelularyzacji zostały usunięte. Następnie przenieś rusztowanie do urządzenia do sieciowania UV i przeprowadź dwa cykle sterylizacji. Po wszystkim przechowuj rusztowanie w PBSAA.Wymiana roztworu co trzy dni. Po pomyślnej decelularyzacji rusztowanie powinno mieć wygląd makroskopowy zbliżony do natywnego jelita, lecz z półprzezroczystymi ścianami. Zachowanie makroarchitektury powinno być również widoczne poprzez drożność drzewa naczyniowego.Po wstrzyknięciu barwnika przez kaniulę SMA powinien on równomiernie rozprzestrzenić się w całym rusztowaniu i dotrzeć do sieci naczyń włosowatych. Rusztowanie powinno być wolne od materiału jądrowego i cytoplazmatycznego, co można poddać ocenie. Przy użyciu zestawu do kwantyfikacji DNA oraz prostej analizy histologicznej, barwienie hematoksyliną i eozyną powinno wykazać brak materiału jądrowego i cytoplazmatycznego, przy jednoczesnym zachowaniu warstw jelita cienkiego, co zostało przedstawione na tym obrazie.W szczególności, po zastosowaniu skaningowej mikroskopii elektronowej, powinna być widoczna zachowana struktura kosmków i fałdów po stronie światła. Należy również spodziewać się dalszej konserwacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, elastyna i glikozaminoglikany, co pokazano tutaj. Na przykład, barwienie Masson's Trichrome pozwala na wykazanie nienaruszonej tkanki łącznej w rusztowaniu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób tworzenia naturalnego komórkowego rusztowania jelitowego.

a-decellularization-methodology-for-production-natural-acellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macicy jelita

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy i porównujemy dwa protokoły używane do decelularizacji tkanek roślinnych: podejście oparte na detergentach i podejście bez detergentów. Obie metody pozostawiają macierz zewnątrzkomórkową zastosowanych tkanek roślinnych, które można następnie wykorzystać jako rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej.

Dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych do zastosowań w inżynierii tkankowej

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z chrząstki mogą być używane jako rusztowanie do naprawy chrząstki i jako środek do regeneracji tkanki kostno-chrzęstnej. W artykule szczegółowo opisano proces decelularyzacji i przedstawiono sugestie dotyczące wykorzystania tych rusztowań w warunkach in vitro.

Wytwarzanie bezkomórkowych rusztowań matrycowych pochodzących z chrząstki

Ten protokół opisuje produkcję filamentu polikaprolaktonu (PCL) z wbudowanymi mikrosferami kwasu polimlekowego (PLA), które zawierają matryce decelularyzowane (DM) do druku 3D strukturalnych konstrukcji inżynierii tkankowej.

Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Bezkomórkowa matryca zewnątrzkomórkowa (dECM) może dostarczyć odpowiednich wskazówek mikrośrodowiskowych do podsumowania inherentnych funkcji tkanek docelowych w skonstruowanym konstrukcie. W tym artykule wyjaśniono protokoły decelularyzacji tkanki trzustkowej, ocenę biotuszu dECM pochodzącego z tkanki trzustki oraz generowanie konstruktów 3D tkanki trzustki przy użyciu techniki biodruku.

Biotusz do macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z tkanki trzustki do drukowania 3D obciążonych komórkami konstruktów tkanki trzustkowej

Ten protokół ma na celu decelularyzację serca i płuc myszy. Powstałe w ten sposób rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) mogą być barwione immunologicznie i obrazowane w celu zmapowania lokalizacji i topologii ich elementów.

Decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego

W tej pracy zoptymalizowano protokół decelularyzacji w celu uzyskania zdecelularyzowanych matryc mięśni szkieletowych płodu myszy. Mioblasty C2C12 mogą kolonizować te matryce, namnażać się i różnicować. Ten model in vitro może być wykorzystany do badania zachowania komórek w kontekście chorób mięśni szkieletowych, takich jak dystrofie mięśniowe.

Przygotowanie 3D bezkomórkowych matryc z mięśni szkieletowych płodu myszy do hodowli komórkowej

Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Poznaj metodologię decelularyzacji jelita szczura w celu produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej. Technika ta zachowuje mikroarchitekturę tkanek i sieć naczyniową, umożliwiając zastosowania w inżynierii tkankowej oraz testowaniu leków.

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

Przeglądaj więcej filmów