Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie naturalnego bezkomórkowego rusztowania do inżynierii tkanki jelitowej. Osiąga się to poprzez pierwszą kaniulację, tętnicę krezkową górną szczura lub SMA, i pobranie jelita cienkiego wraz z dostępem naczyniowym. W drugim etapie zanieczyszczenia śródświetlne są wypłukiwane, a kaniule śródświetlne i naczyniowe są podłączane do pompy perystaltycznej.

Następnie jelito cienkie jest perfundowane wodą dejonizowaną przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W ostatnim etapie jelito cienkie jest perfundowane deoksy sodu, coate i DNA w temperaturze pokojowej. Ostatecznie całkowita decelularyzacja jelita cienkiego, a także jego architektura i składniki mogą być uwidocznione odpowiednio za pomocą histologii i mikroskopii elektronowej.

Obecnie mamy do czynienia z klinicznym problemem niewydolności jelit, wyniszczającej choroby, która dotyka zarówno dzieci, jak i dorosłych. Żywienie rodzicielskie i konwencjonalne przeszczepy nie zapewniają całkowitego wyleczenia. Produkcja trójwymiarowego unaczynionego rusztowania jelitowego, jak pokazano na poniższym filmie, rozciąga się w kierunku terapii niewydolności jelitowej.

Niezwykłe w tej technice jest to, że zastosowanie delikatnych substancji chemicznych do digitalizacji zachowuje mikroarchitekturę jelit, co widać na podstawie wyników mikroskopu elektronowego. Dodatkowo, utrzymanie hierarchicznej sieci naczyniowej podążającej za cywilizacją pozwala na zasianie struktury, która może być ponownie połączona z gospodarzem. Zaopatrzenie w krew Rozpocznij od zamontowania pompy perystaltycznej w dwie rurki, następnie przepuszczaj 70% etanol przez rurki pompy perystaltycznej przez 15 minut z maksymalną prędkością, a następnie świeżo przygotowany PBS AA przez kolejne 15 minut.

Po przepłukaniu pompki spryskaj i wytrzyj brzuch poddanego eutanazji szczura spra dolly o wadze od 250 do 350 gramów 70% etanolem. Następnie, za pomocą wysterylizowanych w autoklawie narzędzi chirurgicznych, wykonaj nacięcie laparotomii łonowej XO na brzuchu, aby zapewnić czyste pole chirurgiczne, wypatroszyć jelito cienkie po prawej stronie zwierzęcia na ręcznik papierowy spryskany 70% etanolem. Należy uważać, aby stale zwilżać jelito P-B-S-A-A, aby uniknąć odwodnienia tkanki i denaturacji macierzy zewnątrzkomórkowej.

Następnie zlokalizuj SMA, który powstaje pod kątem 90 stopni od aorty w kierunku jelita. Założyć szew wokół SMA i przygotować węzeł. Użyj kaniuli o rozmiarze 27, aby wprowadzić się do SMA z aorty, a następnie szybko wyjmij igłę, aby uniknąć rozerwania ściany naczynia.

Teraz wsuń plastikową rurkę kaniuli do SMA, zabezpieczając rurkę pięcioma szwami Vicryl, a następnie wstrzyknij 10 mililitrów P-B-S-A-A, aby potwierdzić kaniulację. Następnie za pomocą nożyczek naciąć aortę proksymalną i dystalną do SMA, aby uwolnić kaniulę, aby uniknąć wycieku kału podczas wycinania jelita grubego, umieść jeden jedwabny węzeł szwu pięć oh na bliższym końcu połączenia krętniczo-kątniczego i jeden na dystalnym końcu esicy. Następnie przetnij końcowe jelito kręte i okrężnicę między dwoma węzłami i usuń jelito grube.

Teraz przetnij jelito cienkie na skrzyżowaniu dwunastnicy Juno i uwolnij jelito od wszelkich połączeń tkanki łącznej, które może mieć z brzuchem. Przenieść jelito cienkie na szalkę Petriego zawierającą PBS aa. Następnie użyj plastikowej pipety tylnej, aby kaniulować proksymalny odcinek jelita, zabezpieczając go na miejscu za pomocą szwów.

Na koniec przetnij pipetę tak, aby pasowała do zamka przynęty 60-mililitrowej strzykawki, a następnie przepłucz światło jelita dwoma płukaniami 60 mililitrów P-B-S-A-A, aby usunąć kał i zanieczyszczenia Przed rozpoczęciem procesu decelularyzacji upewnij się, że w świetle jelita i kaniulach naczyniowych nie ma pęcherzyków. Następnie podłącz trójdrożny kurek zatrzymujący do kaniuli naczyniowej i umieść szalkę Petriego w pojemniku, aby zebrać przelewający się roztwór. Następnie zacznij przepuszczać wodę dejonizowaną przez pompę rolkową o zmiennej prędkości master flex LS z prędkością 0,6 mililitra na godzinę.

Z tkanką należy obchodzić się ostrożnie, aby pęcherzyki wydostały się z dystalnego końca. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków z kaniul przenieś aparat do chłodni. Następnie rozpocznij proces decelularyzacji, perfundując zarówno światło jelita, jak i drzewo naczyniowe bieżącą wodą dejonizowaną przez 24 godziny w ilości 0,6 mililitra na godzinę w ciągu pierwszej godziny.

Regularnie sprawdzaj urządzenie, aby upewnić się, że wszystkie połączenia są bezpieczne. Wyciek jest minimalny, a w jelicie nie ma pęcherzyków. Po 24 godzinach przenieś aparat do decelularyzacji z powrotem do temperatury pokojowej.

Kolor jelita powinien zmienić się na jasnoróżowy pod sssący. Zważ wystarczającą ilość deoksy sodu, aby uzyskać 4% roztwór w 300 mililitrach wody dejonizowanej. Użyj wiru, aby wymieszać roztwór, aż będzie klarowny.

Teraz zastąp roztwór dejonizowany deoksykolalatem sodu. Sprawdź połączenia. Usuń wszelkie pęcherzyki i perfuzuj jelito cienkie w ilości 0,6 mililitra na godzinę przez cztery godziny.

Po etapie deoksy sortowania sodu tkanka staje się przezroczysta. Utrzymanie sieci naczyniowej staje się również widoczne po dodaniu PBS AA do pompy. Przemyj jelito PBS AA przez 30 sekund, aby uniknąć interakcji między deoksy sodu, coate i DNA.

Następnie perfekuj tkankę świeżo przygotowanymi DNA, jednym w temperaturze pokojowej z prędkością 0,6 mililitra na godzinę. Po trzech godzinach przenieś rusztowanie do okapu do hodowli tkankowej i za pomocą techniki septycznej zmień płytkę. Ponownie wysterylizuj rurki pompy perystaltycznej, przepuszczając przez nie etanol.

Przemyj jelito po raz ostatni za pomocą P-B-S-A-A przez 30 minut, aby upewnić się, że wszystkie pozostałości roztworów decelularyzacyjnych zostały usunięte. Na koniec przenieś rusztowanie do sieciownika UV i uruchom dwa cykle sterylizacji. Następnie przechowuj rusztowanie w P-B-S-A-A.

Zmiana roztworu co trzy dni. Po udanej decelularyzacji rusztowanie powinno mieć makroskopowy wygląd podobny do jelita rodzimego, ale z półprzezroczystymi ściankami. Zachowanie makroarchitektury powinno być również widoczne w drożności drzewa naczyniowego.

Gdy barwnik jest wstrzykiwany przez kaniulę SMA, powinien równomiernie rozprowadzić się po rusztowaniu i dotrzeć do drzewa kapilarnego. Rusztowanie powinno być wolne od materiału jądrowego i cytoplazmatycznego, co można ocenić. Korzystając z zestawu do kwantyfikacji DNA i prostej analizy histologicznej, barwienie hematyną i eoiną powinno wykazać brak materiału jądrowego i cytoplazmatycznego przy jednoczesnym zachowaniu warstw jelita cienkiego, jak pokazano na tym obrazie.

W szczególności utrzymanie kosmków i karbów po stronie światła powinno być widoczne po skaningowej mikroskopii elektronowej. Należy również spodziewać się dalszej konserwacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, elastyna i glikany gliko-amina, jak pokazano tutaj. Na przykład barwienie Massen Tri CHRO pozwala na wykazanie nienaruszonej tkanki łącznej w rusztowaniu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć naturalne rusztowanie komórkowe jelitowe.