Name: Barwienie przeciwciał u C. elegans za pomocą krakingu zamrażalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Naucz się barwienia przeciwciał w nicieniach C. elegans przy użyciu metody krakingu zamrażalnego. Technika ta minimalizuje obróbkę chemiczną próbek, umożliwiając skuteczną lokalizację białek w tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez NSF CCLI#0633618 i Uniwersytet Ohio. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center. W filmie pojawia się doktorantka Reetobrata Basu.

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoulin%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Duerr, J. S. Immunohistochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth%2C+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li>
<li>Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+DM+%22Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).</li>
<li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li>
<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
<li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Using+Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Using Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

Autorka oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół krakingu przez zamrażanie jest jedną z kilku metod barwienia przeciwciał u C. elegans. Zapewnia stosunkowo prosty sposób barwienia robaków, ale wymaga określonych odczynników i praktyki w celu uzyskania optymalnych wyników. Etapy krytyczne (przedstawione na rysunku 1) obejmują: 1) przygotowanie szkiełek (patrz kroki 1 i 2) ręczne wyciskanie nicieni (patrz kroki 2 i 3) szybkie utrwalanie (patrz krok 3). Po pierwsze, aby zmaksymalizować przyczepność nicieni do szkiełek, najlepiej jest prz...

Aby określić komórkową i subkomórkową lokalizację białek, naukowcy tradycyjnie oznaczali tkanki przeciwciałami wybranymi do specyficznego rozpoznawania określonych białek1. W niektórych organizmach modelowych, takich jak C. elegans, barwienie przeciwciałami zostało często zastąpione technikami genetyki molekularnej, które dają wyniki szybciej. Należą do nich transformujące się organizmy z konstruktami składającymi się z fuzji genów między regionami promotora i kodującymi genu będącego przedmiotem zainteresowania a zielonym białkiem fluorescencyjnym. Jednak techniki molekularne są narażone na szereg artefaktów, w tym problemy z poznaniem prawdziwego promotora i zmiany w ekspresji konstruktów przy dużej liczbie kopii (typowe techniki u C. elegans)2,3. Dlatego barwienie przeciwciałami pozostaje celem wielu naukowców badających funkcję białek in vivo.
Barwienie tkanek przeciwciałami może być trudne, ponieważ przeciwciała mogą rozpoznać swój antygen tylko w określonej konformacji1. Na przykład przeciwciała mogą rozpoznawać tylko zdenaturowany lub nienaruszony antygen utrwalony w określony sposób i mogą nie rozpoznawać antygenu in situ. Problem barwienia przeciwciałami u nicieni pogłębia fakt, że naskórek nicienia tworzy stosunkowo nieprzepuszczalną barierę, blokując dostęp przeciwciał do tkanek.
Istnieje kilka różnych metod barwienia przeciwciał u C. elegans (omówione w naszej poprzedniej pracy4). Aby zabarwić nienaruszone "robaki", opracowano metody zamrażania i rozmrażania w stosunkowo twardym utrwalaczu (formaldehyd lub aldehyd glutarowy); Cykle zamrażania i rozmrażania pomagają pęknąć naskórek, aby umożliwić szybką penetrację utrwalacza5. Po utrwaleniu naskórek został przeniknięty, aby umożliwić penetrację przeciwciała; Metody obejmowały leczenie środkami redukującymi, kolagenazą lub obiema5-7. Terapie te zachowywały morfologię, ale często zmniejszały lub niszczyły rozpoznawanie przeciwciał. Alternatywne metody obejmują preparację8, aby umożliwić penetrację przeciwciał.
"Freeze-cracking" to jeden ze sposobów na uzyskanie dostępu do wnętrza częściowo nienaruszonego robaka, aby umożliwić barwienie przeciwciał9-10. Freeze-cracking można przeprowadzić w różnych warunkach utrwalenia, unikając kolagenazy i zabiegów redukcyjnych. Nicienie umieszcza się między dwoma szkiełkami samoprzylepnymi, zamraża, a następnie szkiełka rozdziela się, pozostawiając większość nicieni na dolnym szkiełku i większość naskórka na górnym szkiełku. Dolne szkiełko można umieścić w utrwalaczu, a całe szkiełko z przylegającymi nicieniami jest przenoszone przez procedurę barwienia przeciwciałami. Metoda ta wiąże się z dwiema poważnymi trudnościami. Po pierwsze, trudno jest zastosować odpowiednią siłę nacisku niezbędną do rozszczepienia nicieni bez ich poważnego zdeformowania. Po drugie, wiele robaków nie przyklei się do żadnego szkiełka i zostanie utraconych w utrwalaczu lub płukankach. Jednak przy odpowiednich preparatach i praktyce metoda szybko da nicienie o rozsądnej morfologii, które można stosować z szeroką gamą utrwalaczy i przeciwciał.
Metoda może być nieco zróżnicowana, w zależności od celu eksperymentatora. Jeśli pożądane jest barwienie pojedynczych nicieni (np. w celu określenia, czy pojedynczy transformant ma zmienione barwienie przeciwciałami), można zastosować szkiełka o maksymalnej przyczepności (ale wyższym barwieniu tła), takie jak przygotowane laboratoryjnie szkiełka z dodatkową polilizyną (patrz poniżej). Do utrwalania formaldehydu lub aldehydu glutarowego należy stosować szkiełka o wyższej przyczepności (przygotowane laboratoryjnie szkiełka polilizynowe), ponieważ nicienie gorzej przylegają do polilizyny po tych utrwaleniach. Jeżeli nicienie typu dzikiego są utrwalane metanolem i/lub acetonem, należy stosować szkiełka o mniejszej przyczepności i niższym barwieniu tła (szkiełka komercyjne lub przygotowane laboratoryjnie). Jeśli w laboratorium stosuje się różne przeciwciała i utrwalacze, wybór preparatów może być przygotowany z wyprzedzeniem i przechowywany do czasu, gdy będą potrzebne.
Po uzyskaniu dostępu do tkanki nicienia, procedury barwienia przeciwciał są zgodne ze standardowymi metodami (z dłuższymi inkubacjami charakterystycznymi dla tkanek, a nie komórek1,11).

<table><tbody><tr><td>suwak poli-L-lizynowy (marka ESCO)Fisher</td><td></td> <td>12-545-78</td><td>Prowadnice marki Sigma pasują również do</td></tr><tr><td>bromowodorku poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td>WAŻNE:</mocny> Marka i wysoka masa cząsteczkowa krytycznych dla polilizyny</td></tr><tr><td>szkiełek z pojedynczą matową krawędzią</td><td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>Inne marki są odpowiednie</td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>TOXIC, nosić rękawiczki i maskę podczas ważenia proszku, aby uzyskać 10% zapasu. Nosić rękawice podczas pipetowania roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>słoik do barwienia coplin</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>Inne marki są odpowiednie</td></tr><tr><td>5-szkiełkowa koperta</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>71549-01</td><td>Jedna z wielu różnych marek małych uchwytów do szkiełek, odpowiednich do barwienia</td></tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><mocny>WAŻNE:</mocny> Zwykłe roztwory formaliny (37% formaldehydu) NIE są odpowiednie. 1) Rozpuść paraformaldehyd krystalinowy w buforze fosforanowym i przechowuj w małych porcjach zamrożonych. Lub 2) kup paraformaldehyd klasy mikroskopii elektronowej w podwielokrotnościach. TOXIC - nosić rękawice; Nadmiar zlewu wylać wodą.</td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego, 25% w wodzie</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td>WAŻNE: kup aldehyd glutarowy klasy do mikroskopii elektronowej w ampułkach; TOXIC - nosić rękawice; Nadmiar zlewu wylać wodą.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>Inne marki są odpowiednie</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher</td><td>ICN820451</td><td>Inne marki są odpowiednie</td></tr><tr><td>Serum osła, liofilizowane</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>Inne marki są odpowiednie</td></tr><tr><td>Cy3 Donkey anty-mysie IgG wieloznakowe</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>Firma ta jest zalecana do produkcji wysokiej jakości przeciwciał wieloznakowych (zubożonych w powinowactwo). Wybierz odpowiedni barwnik i antygen (zwierzę używane do wytworzenia przeciwciała pierwotnego). </td></tr><tr><td>galusan n-propylu</td><td>Fisher</td><td>ICN10274750</td><td>Inne marki są odpowiednie</td></tr><tr><td>DAPI, dichlorowodorek 4',6'-diamidino-2-fenyloindolu</td><td>Sigma</td><td>D 9542</td><td>TOXIC. Nosić rękawice i dozować do małych porcji i feeze, aby zminimalizować narażenie</td></tr><tr><td>Whatman #1 Filtry o średnicy 15 cm</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe #1 1/2 prostokąt 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 grubość 1/2 jest optycznie najlepsza</td></tr><tr><td>Teczka na szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>Inne marki są odpowiednie</td></tr></tbody></table>

barwienie przeciwciał u c. elegans za pomocą "krakingu zamrażalnego"

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Do plamy C. elegans z przeciwciałami, stosunkowo nieprzepuszczalny naskórek należy ominąć metodami chemicznymi lub mechanicznymi. "Freeze-cracking" to jedna z metod stosowanych do fizycznego wyciągania naskórka z nicieni poprzez ściskanie nicieni między dwoma przylegającymi szkiełkami, zamrażanie ich i rozsuwanie szkiełek. Freeze-cracking zapewnia prosty i szybki sposób na uzyskanie dostępu do tkanek bez obróbki chemicznej i może być stosowany z różnymi utrwalaczami. Prowadzi to jednak do utraty wielu próbek, a wymagana kompresja mechanicznie zniekształca próbkę. Wymagana jest praktyka, aby zmaksymalizować odzysk próbek o dobrej morfologii. Kraking zamrażalniczy można zoptymalizować pod kątem określonych warunków utrwalania, odzysku próbek lub niskiego niespecyficznego barwienia, ale nie dla wszystkich parametrów jednocześnie. W przypadku przeciwciał, które wymagają bardzo twardych warunków wiązania i tolerują obróbkę chemiczną potrzebną do chemicznej przepuszczalności naskórka, preferowane może być leczenie nienaruszonych nicieni w roztworze. Jeśli przeciwciało wymaga lżejszego mocowania lub jeśli optymalne warunki wiązania są nieznane, kraking zamrażalny stanowi bardzo przydatny sposób szybkiego oznaczania przeciwciała i może dostarczyć określonych informacji o lokalizacji subkomórkowej i komórkowej dla interesującego antygenu.

Gdy nicienie zostaną prawidłowo ściśnięte, rozkruszone i lekko utrwalone, praktycznie cały organizm może stać się dostępny dla barwienia przeciwciałami (patrz Rycina 2). Lokalizacja jąder wskazana przez barwienie DAPI pokazuje, które części nicienia pozostały nienaruszone. W przypadku zastosowania silniejszego utrwalacza, takiego jak formaldehyd, morfologia nicienia może ulec zniekształceniu (co widać po nienaturalnie pofalowanym wyglądzie mięśni na Rycina 3A-D). Innym częstym problemem ...

"Freeze-cracking", metoda wystawiania wewnętrznych tkanek nicienia C. elegans na działanie przeciwciał w celu lokalizacji białek.

Barwienie przeciwciał u C. elegans za pomocą "krakingu zamrażalnego"

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie barwienia przeciwciałami u C. elegans. W tym celu nicienie są płukane, rozkładane na szkiełkach i ostrożnie dociskane pomiędzy dwoma szkiełkami adhezyjnymi, które następnie są mrożone na suchym lodzie. Następnie szkiełka są rozdzielane, aby rozłamać ciała nicieni, i niezwłocznie umieszczane w utrwalaczu.Następnie nicienie są barwione przy użyciu standardowych technik barwienia przeciwciałami; analiza za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej wykazuje pomyślne barwienie przeciwciałami półzachowanych nicieni. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fiksacja całych nicieni, jest minimalizacja obróbki chemicznej próbki. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ przygotowanie preparatów i nicieni jest dość wymagającym procesem do zaprezentowania.Procedurę przeprowadzę ja oraz RTO Basu, doktorant z mojego laboratorium. Aby przygotować płytki z nicieniami do barwienia, należy zacząć od umieszczenia płaskiego kawałka metalu na suchym lodzie w celu jego schłodzenia. Za pomocą wody destylowanej i szklanej pipety należy przepłukać nicienie wyhodowane na jednej 60 mm płytce NGM z bakteriami i przenieść je do probówki mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Nicienie mogą być zsynchronizowane lub w różnym wieku, jednak należy unikać używania płytek z dużą liczbą dorosłych osobników, które są trudne do rozbicia, lub nicieni głodujących, co zwiększy autofluorescencję, używając tej samej szklanej pipety.Przepłucz nicienie od trzech do czterech razy wodą destylowaną, aby oczyścić je z bakterii. Następnie, aby zebrać głównie osobniki dorosłe, pozostaw je na blacie na trzy do pięciu minut. Po opadnięciu nicieni na dno probówki odlej większość wody, pozostawiając objętość wody około dwukrotnie większą niż objętość nicieni, lecz nie mniej niż 25 µl całkowitej objętości.Oznacz matową stronę szkiełek pokrytych polilizyną nieusuwalnym pisakiem i połóż szkiełka na blacie obok pojemnika z suchym lodem, stroną z oznaczeniem do góry. Będzie to szkiełko dolne. Przygotuj taką samą liczbę czystych szkiełek niepoddanych obróbce polilizyną.Przygotuj górne szkiełka. Następnie pipetuj około 25 µL zawiesiny nicieni w wodzie na dolne szkiełko do adhezji, a następnie, używając bocznej krawędzi końcówki pipety, rozprowadź nicienie w centralnej części szkiełka. Pozostaw je na 30 sekund do dwóch minut, aby osiadły.Końce nicieni będą przylegać do szkiełka podczas kontaktu z jego powierzchnią. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest zapobieganie nadmiernemu zniekształceniu nicieni podczas wykonywania kolejnych kilku kroków. Najlepszą metodą jest zachowanie cierpliwości, przygotowanie wszystkich niezbędnych materiałów oraz unikanie nadmiaru kofeiny, aby dłonie pozostały stabilne.Trzymając dolny szkiełko w jednej ręce, należy położyć na nim górne szkiełko w taki sposób, aby pokrywały się one całkowicie, z wyjątkiem części matowych. Ciecz powinna utrzymywać szkiełka w niewielkiej odległości od siebie, aby nicienie zachowały pewną mobilność. Należy uważać, aby szkiełka nie przesunęły się względem siebie, co mogłoby doprowadzić do skręcenia nicieni.Następnie, używając kciuków i palców wskazujących obu dłoni, ostrożnie naciśnij pionowo w dół górne szkiełko. Przy zastosowaniu odpowiedniej siły nacisku, kilka z największych osobników obojnakowych pęknie na krawędzi szkiełka. Podczas gdy większość dorosłych osobników i larw zetknie się z każdym szkiełkiem, pozostaną one nienaruszone; natychmiast i ostrożnie, nie dopuszczając do przesunięcia szkiełeczek, umieść je na kawałku metalu znajdującym się na suchym lodzie. W ciągu minuty szkiełka będą wyglądać na zamrożone, jednak należy pozostawić je tam przez pięć minut, aby upewnić się, że zostały całkowicie zamrożone.Preparaty są teraz gotowe do fiksacji. Jeśli proces nie zostanie rozpoczęty natychmiast, należy przechowywać preparaty w oznakowanym pudełku w temperaturze -80 °C przez kilka dni. Powinny one zostać wykorzystane w ciągu około tygodnia od momentu przygotowania.Nie należy używać preparatów po długotrwałym przechowywaniu. Pojedyncze nicienie można również przygotować na szkiełkach w sposób podobny do tego, który został właśnie przedstawiony. Umieść płaski kawałek metalu na suchym lodzie, aby go schłodzić.Następnie, używając pęsety do nicieni, przenieś pojedyncze nematody do kropli wody na płytce NGM, aby oczyścić je z bakterii. Nicienie powinny być dobrze odżywione w celu zmniejszenia autofluorescencji. Jeśli to możliwe, powtórz przenoszenie do nowych kropli wody tak długo, aż nicień będzie wolny od bakterii.Następnie przygotuj szkiełka górne i dolne w taki sam sposób jak poprzednio. Po czym, obserwując przez mikroskop, nanieś kroplę wody o objętości od 5 do 10 µL na obszar dolnego szkiełka pokryty polilizyną. Za pomocą pęsety do nicieni przenieś do kropli wody do 20 osobników.Robaki powinny opaść na lepką powierzchnię szkiełka. Następnie należy nałożyć górne szkiełko w taki sam sposób jak wcześniej, ale bez dociskania, dbając jednocześnie o to, aby szkiełka nie przesunęły się natychmiast. Szkiełka należy umieścić na metalowej podstawie na suchym lodzie.Przechowywać na suchym lodzie od 5 do 30 minut, a następnie bezzwłocznie przystąpić do fiksacji. Preparatów na szkiełkach nie można przechowywać do późniejszego użycia. Aby przeprowadzić lekką fiksację nicieni, należy rozpocząć od umieszczenia słoików do barwienia zawierających roztwory fiksacyjne w lodzie w celu ich schłodzenia przez 10 minut.Wymagane roztwory to 100% methanol, 100% aceton oraz bufor fosforanowo-solny (PBS). Szybko wyjmij z suchego lodu parę szkiełek (dolne i górne), rozdziel je zdecydowanym ruchem obrotowym i natychmiast zanurz dolne szkiełko w lodowatym metanolu na dwie minuty; górne szkiełko należy odrzucić. Następnie przenieś szkiełka z metanolu do lodowatego acetonu na cztery minuty.Jeśli na szkiełkach znajdowało się dużo nicieni, większość z nich odpadnie w utrwalaczu, nawet przy prawidłowo przygotowanych preparatach. W przypadku prawidłowo przygotowanych szkiełeczek z pojedynczymi nicieniami, zwierzęta powinny pozostać przylegające. Na koniec, aby wypłukać utrwalacz, zanurz szkiełka w słoiku z PBS.Preparaty są teraz gotowe do barwienia w celu przeprowadzenia utrwalania twardego przy użyciu formaldehydu lub glutaraldehydu. Należy rozpocząć od rozcieńczenia roztworu formaldehydu lub glutaraldehydu klasy odczynnikowej w PBS do stężenia końcowego od 0.5 do 4%. Alikwoty można przechowywać w temperaturze od -20 do -30°C i rozmrażać w razie potrzeby. Pamiętaj, że formaldehyd i glutaraldehyd są bardzo toksyczne, dlatego należy nosić rękawice i pracować pod wyciągiem.Wyjmij parę szkiełek przedmiotowych i nakrywek z suchego lodu i niezwłocznie je od siebie oddziel. Połóż szkiełko przedmiotowe z nicieniami w płaskim naczyniu z pokrywką, natychmiast wyrzuć nakrywkę, a następnie pipetą nanieś 200 µL utrwalacza na środek obszaru szkiełka z nicieniami. Utrwalacz częściowo zamarznie w miejscu, a następnie rozpuści się, pokrywając większy obszar szkiełka.Jeśli nicienie nie zostały natychmiast i starannie całkowicie przykryte utrwalaczem, należy dodać więcej utrwalacza za pomocą mikropipety. Nie wolno dopuścić do przelania utrwalacza przez krawędź szkiełka. Do naczynia należy dodać złożone, wilgotne chusteczki bezpyłowe, aby utrzymać wilgotność.Należy dopilnować, aby chusteczki nie dotknęły szkiełek. Następnie przykryć szalkę pokrywką i pozostawić ją od 10 minut do całej nocy w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu utrwalania, za pomocą pipety ostrożnie przenieść utrwalacz wraz z wolnymi nicieniami do probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie zanurzyć szkiełko w naczyniu do barwienia zawierającym PBS.Wirować probówkę z nicieniami z dużą prędkością przez 30 sekund, aby uzyskać osad. Przepłukać nicienie dwukrotnie w PBS. Następnie przystąpić do ich barwienia równolegle z nicieniami znajdującymi się na szkiełku.Protokół barwienia przeciwciałami jest podobny do standardowych protokołów dla dowolnej tkanki na szkiełkach i został szczegółowo opisany w dołączonym dokumencie. Po barwieniu należy przenieść szkiełka do PBS i pozostawić je tam do 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsius, aż będą gotowe do montowania. Aby zamontować preparaty, należy wyjąć szkiełko z PBS.Użyj ściereczki niezostawiającej włókien, aby osuszyć tylną stronę, a następnie szybko przełóż ją na ręcznik papierowy. Nanieś około 20 µL medium montażowego na nicienie, tak aby na szkiełku przedmiotowym znalazły się w przybliżeniu równe części medium i PBS.Delikatnie przechyl preparat, aby wymieszać oba roztwory. Uwaga: medium montażowe jest toksyczne. Trzymaj za matową krawędź.Przechyl szkiełko tak, aby roztwór zgromadził się przy matowej krawędzi. Następnie połóż jedną krawędź szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 by 60 mm na roztworze, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza, które nasilają blaknięcie i utrudniają obserwację. Delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe.Jeśli powstaną pęcherzyki powietrza, powoli unieś krawędź szkiełka nakrywnego. Następnie, unikając przesuwania go po nicieniach, ponownie je opuść. W razie potrzeby dodaj więcej PBS, aby usunąć pęcherzyki powietrza.Używając chusteczki bezpyłowej, dociśnij krawędzie szkiełka nakrywki i preparatu, aby ostrożnie osuszyć brzeg. Brzeg preparatu musi być widoczny wokół całej krawędzi szkiełka nakrywki i nie powinien być zbyt wilgotny. Uszczelnij szkiełko nakrywki, nakładając dwie do trzech warstw lakieru do paznokci na krawędź.Gdy preparat zostanie szczelnie zamknięty i wyschnie, należy oczyścić szkiełko nakrywkowe oraz spód szkiełka podstawnego, a następnie umieścić go w otworach uchwytu do szkiełek. Zamknięte preparaty można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4 °C lub przez kilka tygodni w temperaturze -20 °C w przypadku dłuższego okresu przechowywania. Barwienie DNA i większości barwników zielonych ulega blaknięciu; w razie potrzeby należy ponownie uszczelnić szkiełko nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci, szczególnie po zastosowaniu obiektywu imersyjnego.Poniższe reprezentatywne obrazy zostały zarejestrowane przy użyciu preparatów wykonanych podczas pierwszych prób barwienia przeciwciałami przez studentów w ramach kursu biologii komórki. Zdjęcie to przedstawia przykład głów dwóch dorosłych hermafrodyt, które zostały prawidłowo skompresowane, rozkruszone i lekko utrwalone w mieszaninie metanolu i acetonu. Zostały one znakowane za pomocą wielu przeciwciał i barwników.W tym przypadku niemal cały organizm nicienia jest dostępny dla przeciwciał. W przypadku takiego barwienia lokalizacja jąder, wyznaczona przez barwienie DPI, wskazuje, które części nicienia pozostały nienaruszone. Gdy nicienie poddaje się działaniu silniejszego utrwalacza, takiego jak formaldehyd, morfologia organizmu może ulec zniekształceniu.Można to zauważyć na tych obrazach jako pofalowany wygląd mięśni zaznaczonych na czerwono. Innym częstym problemem związanym z użyciem silniejszych utrwalaczy jest nierównomierne utrwalenie lub przenikanie do poszczególnych tkanek. Widać to tutaj, gdzie mięsień zaznaczony na czerwono jest zabarwiony tylko w części ciała nicienia.W tym przypadku obecność innego barwienia, w tym DNA widocznego w kolorze niebieskim, wskazuje, że co najmniej część ciała była obecna. Powstały wzór częściowego barwienia można łatwo zidentyfikować wraz z praktyką, co pozwala na określenie całkowitego rozkładu barwienia, nawet jeśli pojedynczy nicień wykazuje nierównomierne zabarwienie. Przedstawiono tutaj typowe problemy występujące podczas pękania przez zamrażanie przy zastosowaniu dowolnych warunków fiksacji.Najczęstszym problemem jest skręcanie się próbki na skutek względnego ruchu dwóch szkiełek. Podczas kompresji morfologia barwionych tkanek wskazuje tutaj, że ciało nicienia jest skręcone tuż za gardłem. Obraz ten pokazuje również problem z barwieniem tła spowodowany przyleganiem przeciwciał do powłoki z polilizyny na szkiełku.Można tego uniknąć, korzystając z mikroskopu konfokalnego. Należy pamiętać, że nawet przy wprawie wiele pojedynczych nicieni zostanie utraconych lub wystąpią w ich przypadku niektóre z opisanych tutaj problemów. Po opanowaniu techniki przygotowanie i utrwalenie próbek można przeprowadzić w ciągu godziny, a barwienie w ciągu jednego dnia.Po wykonaniu tej procedury można zastosować różne metody utrwalania w celu optymalizacji barwienia dla konkretnego przeciwciała i tkanki.

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Barwienie przeciwciał w C. Elegans za pomocą „mrożenia-pękania”

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Ten film opisuje freeze-cracking, metodę umożliwiającą barwienie tkanek C. elegans do barwienia przeciwciałami poprzez naruszanie naskórka.

Kraking zamrażalny nicieni: metoda wystawiania wewnętrznych tkanek robaków do barwienia

Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

Prezentujemy metodę obrazowania immunofluorescencyjnego opartą na przestrzennej i czasowej lokalizacji aktywnego ERK w wypreparowanej gonadzie C. elegans. Opisany tutaj protokół może być dostosowany do wizualizacji dowolnego białka sygnalizacyjnego lub strukturalnego w gonadzie C. elegans, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni odczynnik przeciwciała.

Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Naucz się barwienia przeciwciał w nicieniach C. elegans przy użyciu metody krakingu zamrażalnego. Technika ta minimalizuje obróbkę chemiczną próbek, umożliwiając skuteczną lokalizację białek w tkankach.

Barwienie przeciwciał u C. elegans za pomocą "krakingu zamrażalnego"

Przeglądaj więcej filmów