Barwienie przeciwciał u C. elegans za pomocą "krakingu zamrażalnego"

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie barwienia przeciwciałami na C elegancji. W tym celu nicienie są płukane, rozprowadzane na szkiełkach i ostrożnie ściskane między dwoma szkiełkami samoprzylepnymi, które następnie zamraża się na suchym lodzie. Następnie szkiełka są rozdzielane w celu rozłupania nicieni i natychmiast umieszczane w utrwalaczu.

Nicienie są następnie barwione przy użyciu standardowych technik barwienia przeciwciał Analiza technik barwienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ujawnia udane barwienie przeciwciałami częściowo nienaruszonych nicieni. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak utrwalanie nienaruszonych nicieni, jest to, że minimalizuje ona chemiczną obróbkę próbki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ przygotowanie szkiełek i nicieni jest nieco trudne do zademonstrowania.

Procedura będzie przeprowadzona przeze mnie i RTO Basu, doktoranta z mojego laboratorium Aby przygotować płytki z nicieniami do barwienia, zacznij od umieszczenia płaskiego kawałka metalu na suchym lodzie, aby schłodzić go za pomocą wody destylowanej i szklanej pipety do płukania. Robaki wyhodowane na jednej 60-milimetrowej płytce NGM z bakteriami w 1,5-mililitrowej mikro tubie fuge. Robaki mogą być zsynchronizowane lub w różnym wieku, ale unikaj używania płytek z wieloma posagami, które są trudne do złamania lub zagłodzonych robaków, które zwiększą autofluorescencję przy użyciu tej samej szklanej pipety.

Opłucz robaki trzy do czterech razy wodą destylowaną, aby uwolnić je od bakterii. Następnie, aby zebrać głównie dorosłych, pozwól im usiąść na ławce przez trzy do pięciu minut. Po tym, jak robaki osiądą na dnie rurki, usuń większość wody z rurki, pozostawiając około dwa razy większą objętość wody niż robaki, ale co najmniej 25 mikrolitrów całkowitej objętości.

Oznacz matową stronę szkiełek z polilizyny niezmywalnym atramentem i umieść szkiełka na blacie obok pojemnika etykietą z suchym lodem do góry. Będzie to służyć jako dolna prowadnica. Poddać równą liczbę czystych substancji niezawierających polilizyny.

Dostępne zjeżdżalnie górne. Następnie odpipetuj około 25 mikrolitrów robaków w wodzie na dolną szkiełko przylegające i używając boku końcówki pipety, rozprowadź robaki na środku szkiełka. Pozwól im osiąść na 30 sekund do dwóch minut.

Końce robaków będą się przyklejać, gdy zetkną się ze zjeżdżalnią. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest zapobieganie zbytniemu zniekształceniu robaków podczas wykonywania kilku następnych kroków. Najlepszym sposobem na to jest cierpliwość, przygotowanie wszystkiego do pracy i nie picie zbyt dużej ilości kofeiny, aby ręce były ładne i stabilne.

Trzymając dolną prowadnicę w jednej ręce, umieść na niej górną prowadnicę tak, aby wszystkie oprócz matowych części zachodziły na siebie. Płyn powinien lekko rozsuwać szkiełka, aby robaki nadal miały pewną mobilność. Nie pozwól, aby zjeżdżalnia ślizgała się po sobie, co spowoduje skręcenie robaków.

Następnie, używając kciuków i palców wskazujących każdej ręki, ostrożnie dociśnij prosto w dół górny suwak Przy odpowiednim nacisku kilka największych hermafrodytów pęknie na krawędzi szkiełka. Podczas gdy większość dorosłych i larw będzie miała kontakt z każdym szkiełkiem, ale pozostanie nienaruszona natychmiast i ostrożnie, nie dopuszczając do ześlizgnięcia się szkiełek, połóż je na kawałku metalu na suchym lodzie. W ciągu jednej minuty szkiełka będą wyglądały na zamrożone, ale trzymaj je tam przez pięć minut, aby upewnić się, że są dokładnie zamrożone.

Prowadnice są teraz gotowe do mocowania. Jeśli nie wykonasz tego zadania, przechowuj szkiełka w oznaczonym pudełku w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez kilka dni. Powinny być zużyte w ciągu około tygodnia po ich wykonaniu.

Nie używać szkiełek po długotrwałym przechowywaniu. Pojedyncze nicienie można również przygotować na szkiełkach w sposób podobny do pokazanego powyżej. Umieść płaski kawałek metalu na suchym lodzie, aby go schłodzić.

Następnie użyj kilofa, aby przenieść pojedyncze nicienie do kropli wody na płytce NGM, aby uwolnić je od bakterii. Nicienie powinny być dobrze odżywione, aby zmniejszyć autofluorescencję. Jeśli to możliwe, w razie potrzeby powtórz przenoszenie do nowych miejsc w wodzie, aż robak będzie wolny od bakterii.

Następnie przygotuj górne i dolne szkiełka jak poprzednio. Następnie umieść kroplę wody o pojemności od pięciu do 10 mikrolitrów na obszarze dolnego szkiełka poddanego działaniu polilizyny, obserwując pod mikroskopem. Użyj kilofa do robaków, aby przenieść do 20 robaków do kropli wody.

Robaki powinny opaść w dół, aby dotknąć lepkiej powierzchni zjeżdżalni. Następnie umieść górną prowadnicę jak poprzednio, ale nie ściskaj, upewniając się, że prowadnice nie zsuwają się natychmiast. Umieść szkiełka na metalu na suchym lodzie.

Trzymaj na suchym lodzie przez pięć do 30 minut i natychmiast przystąp do utrwalenia. Slajdy te nie mogą być przechowywane do późniejszego wykorzystania. Aby lekko naprawić robaki, zacznij od umieszczenia słoików barwiących zawierających roztwory utrwalające na lodzie, aby schłodzić je przez 10 minut.

Potrzebne roztwory to 100% metanol, 100% aceton i sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Wyjmij parę dolnych i górnych szkiełek z suchego lodu, szybko je rozsuń i natychmiast zanurz dolną szkiełko w lodowatym metanolu na dwie minuty, wyrzuć górną szkiełko. Następnie przenieś szkiełka z metanolu na lodowaty aceton na cztery minuty.

Jeśli szkiełka miały dużo robaków, większość z nich odpadnie w utrwalaczu nawet przy dobrze przygotowanych szkiełkach. Jeśli szkiełka pojedyncze ślimakowe zostały odpowiednio przygotowane, robaki powinny pozostać przylegające. Na koniec, aby spłukać utrwalacz, zanurz szkiełka w słoiku z PBS.

Szkiełka są teraz gotowe do barwienia w celu wykonania twardej naprawy za pomocą formaldehydu lub aldehydu glutarowego. Zacznij od rozcieńczenia odczynnika formaldehydu lub roztworu aldehydu glutarowego w PBS do końcowego stężenia od 0,5 do 4%Podwielokrotności można przechowywać w temperaturze od minus 20 do minus 30 stopni i rozmrażać w razie potrzeby. Pamiętaj, że formaldehyd i aldehyd glutarowy są zawsze bardzo toksyczne, więc musisz nosić rękawice i pracować pod wyciągiem.

Wyjmij parę dolnych i górnych szkiełek z suchego lodu i natychmiast je szybko rozsuń. Umieść dolne szkiełko z robakami w płaskim naczyniu z pokrywką, natychmiast wyrzuć górne szkiełko, odpipetuj 200 mikrolitrów utrwalacza na środku obszaru szkiełka. W przypadku robaków utrwalacz częściowo zamarznie na miejscu, a następnie stopi się, aby pokryć większy obszar szkiełka.

Jeśli robaki nie są całkowicie pokryte utrwalaczem, natychmiast i ostrożnie dodaj więcej utrwalacza za pomocą mikropipety. Nie pozwól, aby utrwalacz przepłynął przez krawędź szkiełka. Dodaj do naczynia złożone, mokre, niestrzępiące się chusteczki, aby było nawilżone.

Nie pozwól, aby chusteczki dotykały szkiełek. Następnie przykryj naczynie pokrywką i pozostaw na 10 minut do nocy w temperaturze pokojowej po zakończeniu utrwalania, za pomocą pipety ostrożnie przenieś utrwalacz z luźnymi robakami do 1,5 mililitrowej probówki. Następnie zanurz szkiełko w słoiku do barwienia zawierającym PBS.

Obracaj rurkę zawierającą robaki z dużą prędkością przez 30 sekund, aby je ogrzać. Opłucz robaki dwukrotnie za pomocą PBS. Następnie przystąp do barwienia ich równolegle z robakami na szkiełku.

Protokół barwienia przeciwciał jest podobny do standardowych protokołów dla dowolnej tkanki na szkiełkach podstawowych i jest szczegółowo opisany w dokumencie towarzyszącym. Po zabarwieniu przenieś szkiełka do PBS i pozostaw je tam do 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do montażu. Aby zamontować prowadnice, wyjmij suwak z PBS.

Użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby wysuszyć tył, a następnie szybko połóż go na ręczniku papierowym. Umieść około 20 mikrolitrów pożywki montażowej na robakach tak, aby były w przybliżeniu równe części podłoża i PBS. Na slajdzie.

Delikatnie przechyl szkiełko, aby wymieszać oba roztwory. Uwaga: podłoże montażowe jest toksyczne. Trzymając matową krawędź.

Przechyl szkiełko tak, aby roztwór zebrał się w pobliżu lukru. Następnie umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 na 60 milimetrów na roztworze, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza, które zwiększają bielenie i zakłócają oglądanie. Delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe.

Jeśli pojawią się pęcherzyki, powoli podnieś krawędź szkiełka nakrywkowego. Następnie, nie przesuwając się po robakach, opuść go. W razie potrzeby dodaj więcej PBS, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.

Za pomocą niestrzępiącej się chusteczki ściśnij krawędzie szkiełka nakrywkowego i ostrożnie zsuń, aby wysuszyć krawędź. Krawędź szkiełka musi być widoczna dookoła krawędzi szkiełka nakrywkowego i nie powinna być zbyt mokra. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe i nałóż dwie do trzech warstw lakieru do paznokci na krawędź.

Gdy szkiełko jest dobrze uszczelnione i suche, wyczyść szkiełko nakrywkowe i tylną część szkiełka i umieść je w zagłębieniach na suwak. Uszczelnione szkiełka mogą być przechowywane przez dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub tygodnie w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dłuższe okresy. Delikatne barwienie DNA i większość zielonych barwników blakną, w razie potrzeby ponownie uszczelnij szkiełko nakrywkowe większą ilością lakieru do paznokci, szczególnie po użyciu dowolnej soczewki zanurzeniowej z olejkiem.

Poniższe reprezentatywne obrazy zebrano przy użyciu preparatów wykonanych podczas pierwszych prób barwienia przeciwciałami przez studentów na kursie laboratoryjnym biologii komórki. Ten obraz przedstawia przykład głów dwóch dorosłych hermafrodytów, które są odpowiednio ściśnięte, popękane i lekko przymocowane acetonem metanolowym. Zostały one oznaczone wieloma przeciwciałami i barwnikami.

W tym przypadku praktycznie cały robak jest dostępny dla przeciwciał. Barwienie w tym miejscu, lokalizacja jąder wskazywana przez barwienie DPI wskazuje, które części robaka są nienaruszone. Kiedy robaki są poddawane działaniu twardszego utrwalacza, takiego jak formaldehyd, morfologia robaka może zostać zniekształcona.

Na tych zdjęciach można to zobaczyć jako falisty wygląd mięśni pokazanych na czerwono. Innym częstym problemem związanym ze stosowaniem twardszych utrwalaczy jest nierównomierne utrwalanie lub penetracja poszczególnych tkanek. Można to zobaczyć tutaj, gdzie mięsień pokazany na czerwono jest zabarwiony tylko w części robaka.

W tym przypadku obecność innych zabarwień, w tym DNA, pokazanych na niebiesko wskazuje, że przynajmniej część ciała była obecna. Uzyskany wzór częściowego barwienia można łatwo zidentyfikować w praktyce, dzięki czemu można określić cały rozkład barwienia, nawet jeśli którykolwiek z pojedynczych robaków wykazuje nierównomierne zabarwienie. Typowe problemy napotykane podczas pękania zamrażalniczego przy użyciu dowolnych warunków mocowania są zilustrowane tutaj.

Najczęstszym problemem jest skręcanie się próbki spowodowane względnym ruchem dwóch szkiełek. Podczas kompresji Tutaj morfologia barwionych tkanek wskazuje, że ciało robaka jest skręcone tuż za gardłem. Ten obraz pokazuje również problem z barwieniem tła z powodu przyklejania się przeciwciał do polilizyny pokrywającej szkiełko.

Można tego uniknąć, stosując mikroskop konfokalny. Zauważ, że nawet przy odrobinie wprawy wiele pojedynczych robaków zostanie utraconych lub pokaże niektóre z pokazanych tutaj problemów. Po opanowaniu przygotowanie i utrwalenie można wykonać w ciągu godziny, a barwienie można wykonać w ciągu jednego dnia.

Po tej procedurze można zastosować różne metody utrwalania w celu optymalizacji barwienia dla danego przeciwciała i tkanki.