Kwantyfikacja reakcji na impuls oddechowy jako wskaźnik wrodzonego zdrowia immunologicznego u danio pręgowanego
12 września 2013
Wrodzona odpowiedź immunologiczna chroni organizmy przed infekcją patogenem. Krytyczny składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, pęknięcie oddechowe fagocytów, generuje reaktywne formy tlenu, które zabijają atakujące mikroorganizmy. Opisujemy test wyrzutu oddechowego, który określa ilościowo reaktywne formy tlenu wytwarzane, gdy wrodzona odpowiedź immunologiczna jest indukowana chemicznie.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie fluorescencji do ilościowego określenia odpowiedzi na impuls oddechowy. Najpierw załaduj zarodki danio pręgowanego do dołków 96-dołkowej płytki. Następnie dodaj podłoże fluorescencyjne i aktywuj wybuch oddechowy za pomocą środka chemicznego.
Następnie określ ilościowo względną fluorescencję za pomocą fluorymetru. Ostatecznie fluorescencja jest wykorzystywana do pokazania potencjału impulsu oddechowego. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób manipulacje eksperymentalne wpływają na ogólny wrodzony stan zdrowia immunologicznego.
Tutaj używamy go, aby zapewnić wgląd w wybuch oddechowy zarodków danio pręgowanego, ale można go również zastosować do innych systemów, takich jak dorosłe danio pręgowane, komórki nerkowe i preparaty komórkowe innych gatunków ryb. Hoduj zarodki na głębokich szalkach Petriego w temperaturze 28 stopni Celsjusza w wodzie jajecznej, aż do pożądanego etapu rozwoju. Codziennie usuwaj martwe zarodki.
Ostrożnie zdekantuj starą wodę z jajek i codziennie uzupełniaj ją nową wodą z jajek. W dniu eksperymentu przygotuj zredukowany roztwór roboczy fluoresceiny w owiniętej folią 1,7 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Przygotuj również roztwór roboczy o stężeniu końcowym 20 mikrogramów na mililitr PMA.
Następnie przygotuj pięć mililitrów każdego roztworu dozującego w 15-mililitrowych stożkowych probówkach, jak opisano w załączonym tekście. Utrzymuj roztwory dozujące na lodzie, najpierw włącz czytnik mikropłytek i rozgrzej źródło światła, aby zmierzyć fluorescencję. Skonfiguruj program szczegółowo opisujący długości fal wzbudzenia i emisji, czułość położenia optyki, a także uwzględnij pięciosekundowy krok potrząsania.
Przed trzciną należy zorganizować eksperymentalne zapasy naczyń z powlekanymi zarodkami. 96-dołkowa mikropłytka, pipeter P 200 i końcówki wiaderka z lodem z odczynnikami zawierającymi fluoresceinę. Wielokanałowy pipeter P 200, dwa sterylne zbiorniki, folia aluminiowa i nożyczki.
Teraz odetnij końcówkę pipety tak, aby zarodki lub nerki mogły zmieścić się w otworze. Ustaw pipeter P 200 na 100 mikrolitrów i przenieś jeden zarodek wraz z wodą jajeczną do tylu dołków czarnej 96-dołkowej mikropłytki, ile chcesz. Teraz wlej roztwór dozujący do sterylnego zbiornika o pojemności 25 mililitrów za pomocą wielokanałowego pipetera P 200.
Dodaj 100 mikrolitrów roztworu dozującego H 2D CFDA do jednej kolumny 96. Dobrze powtórzyć mikropłytkę dla połowy kontrolnych próbek zarodków i połowy eksperymentalnie manipulowanych próbek zarodków. Wlej roztwór dozujący zawierający PMA do nowego sterylnego zbiornika o pojemności 25 mililitrów.
Następnie porcjować ten roztwór dozujący do pozostałych kolumn mikropłytki 96-dołkowej. Przykryj mikropłytkę folią aluminiową i umieść na shakerze na około 20 sekund. Przy 150 obr./min inkubuj mikropłytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza, gdy nie jest odczytywana.
Odczytać mikropłytkę po dodaniu PMA. Kontynuuj wykonywanie pomiarów co kilka minut w żądanym przedziale czasu lub inkubuj owiniętą folią mikropłytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza do ustalonego punktu czasowego. Następnie wyjmij zarodki ze studni, poddaj je eutanazji zgodnie z instytucjonalnym protokołem opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.
Mikropłytkę i inne materiały jednorazowego użytku należy również wyrzucić do lakiernika odpadów niebezpiecznych biologicznie. Zdecyduj się na punkt czasowy, w którym chcesz porównać fluorescencję. Odejmij średnią wartość fluorescencji grupy kontrolnej indukowanej PMA od wartości fluorescencji grypy w indywidualnej grupie kontrolnej indukowanej PMA.
Powtórz to dla grupy eksperymentalnej z PMA i bez niego. Następnie zapisz te znormalizowane wartości fluorescencji w kolumnach, grupie kontrolnej plus PMA i grupie eksperymentalnej plus PMA. Następnie oblicz średnie i odchylenia standardowe dla znormalizowanych wartości fluorescencji grupy kontrolnej plus PMA i grupy eksperymentalnej plus PMA.
Porównaj znormalizowane wartości fluorescencji za pomocą niesparowanego testu T, aby określić istotność statystyczną. Teraz narysuj średnie grupy kontrolnej plus PMA i grupy eksperymentalnej plus PMA ze słupkami błędów odzwierciedlającymi odpowiednie odchylenia standardowe, zapisz poziom istotności na wykresie i w legendzie rysunku. W tym eksperymencie porównano reakcję impulsu oddechowego u zarodków danio pręgowanego typu dzikiego o tle AB po 48 godzinach i 72 godzinach od zapłodnienia.
Surową fluorescencję zmierzono cztery godziny po dodaniu PMA w grupach indukowanych PMA. Wartości surowej fluorescencji były wyższe w populacji 72 HPF. Jak wskazują obliczone średnie, wartości fluorescencji są znormalizowane w celu uwzględnienia zmienności poziomów tła fluorescencji.
Wyniki tego testu impulsu oddechowego ujawniły, że 72 zarodki zebry zebry HPF są w stanie wytwarzać znacznie więcej reaktywnych form tlenu, a tym samym wytwarzać silniejszą reakcję impulsu oddechowego niż 48 zarodków HPF po indukcji PMA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać fluorescencji do ilościowego określania potencjału wybuchu oddechowego zarodków danio pręgowanego. Nie zapominaj, że praca z proszkiem PMA może być bardzo niebezpieczna, dlatego stosuj środki ostrożności, takie jak noszenie maski na twarz podczas ważenia proszku PMA.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje test wyrzutu oddechowego, który pozwala na ilościowe określenie aktywności reaktywnych form tlenu powstających podczas wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Metoda ta wykorzystuje fluorescencję do pomiaru wyrzutu oddechowego w embrionach zebrafish po aktywacji za pomocą czynnika chemicznego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Odporność wrodzona
- Funkcja fagocytów
- Reaktywne formy tlenu
Wprowadzenie
- Wrodzona odpowiedź immunologiczna jest kluczowa dla obrony przed patogenami.
- Fagocyty generują reaktywne formy tlenu w celu zabijania drobnoustrojów.
- Ilościowe oznaczenie wyrzutu oddechowego może dostarczyć informacji o stanie układu odpornościowego.
- Ten test może zostać dostosowany do różnych manipulacji eksperymentalnych.
Cel badania
- Opracowanie metody ilościowego oznaczania odpowiedzi w postaci wyrzutu oddechowego.
- Ocena wpływu czynników chemicznych na funkcje odporności wrodzonej.
- Dostarczenie narzędzia do badania stanu układu odpornościowego w modelach danio pręgowanego.
Zastosowane metody
- Umieszczanie zarodków danio pręgowanego na płytce 96-dołkowej.
- Dodawanie substratu fluorescencyjnego do dołków.
- Aktywacja wyrzutu oddechowego za pomocą czynnika chemicznego.
- Ilościowe oznaczanie fluorescencji przy użyciu fluorometru.
Główne wyniki
- Test ten pozwala na skuteczne ilościowe oznaczenie potencjału wyrzutu oddechowego.
- Poziomy fluorescencji korelują z wrodzoną odpowiedzią immunologiczną.
- Metoda ta umożliwia ocenę stanu zdrowia układu odpornościowego.
- Za pomocą tego testu można ocenić wpływ manipulacji eksperymentalnych.
Wnioski
- Test wyrzutu oddechowego jest cennym narzędziem do badania odporności wrodzonej.
- Ilościowe oznaczanie fluorescencji dostarcza informacji na temat odpowiedzi immunologicznych.
- Metoda ta może pogłębić zrozumienie stanu zdrowia układu odpornościowego w badaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określenie odpowiedzi w postaci wyrzutu oddechowego dostarcza funkcjonalnych danych na temat stanu odporności wrodzonej w modelach rybek danio pręgowanych, umożliwiając wczesną ocenę związków immunomodulujących. Analiza ta wspomaga walidację punktów uchwytu poprzez powiązanie manipulacji genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami w produkcji reaktywnych form tlenu, które stanowią kluczowy mechanizm efektorowy w obronie przed patogenami. Możliwość dostosowania tej metody do różnych stadiów rozwojowych i rodzajów próbek zwiększa jej użyteczność w ograniczaniu ryzyka związanego z prowadzeniem immunomodulujących substancji wiodących przed etapem inwestycji przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar funkcjonalnego efektu aktywacji fagocytów w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki ilościowemu porównaniu potencjału wyrzutu oddechowego w różnych warunkach genetycznych lub terapeutycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez korelację wyników analizy z kompetencją odporności wrodzonej, dostarczając podstaw do decyzji go/no-go w przypadku kandydatów immunomodulujących.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje ustandaryzowane, ilościowe wyniki fluorescencji, odpowiednie do wysokoprzepustowego przesiewu bibliotek związków.
- Powtarzalność: Wykorzystuje znormalizowaną fluorescencję i porównanie statystyczne (nieparzysty test t), aby zapewnić wiarygodność porównań między eksperymentami.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami płytek 96-dołkowych ułatwia testowanie wielu warunków oraz ponowne wykorzystanie na różnych platformach w ramach procesów profilowania immunologicznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje reaktywność odporności wrodzonej istotną dla infekcji i stanu zapalnego, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy wyniki badań odkrywczych z funkcjonalną walidacją immunologiczną w całych organizmach lub preparatach tkankowych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje dotyczące optymalizacji związków wiodących poprzez identyfikację substancji znacząco modulujących aktywność wyrzutu oddechowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test ten wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając danych z funkcjonalnego profilowania immunologicznego, które uzupełniają badania angażowania celu oraz przesiewy fenotypowe.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez łączenie wyciszania genów, nadekspresji lub leczenia farmakologicznego z mierzalnymi zmianami w funkcji efektorowej odporności wrodzonej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników, które umożliwiają wiarygodne porównanie wpływu związków na aktywację fagocytów.
- Analityka: Generuje znormalizowane wartości fluorescencji i wyniki statystyczne (średnie, odchylenia standardowe, wyniki testu t), które pozwalają na obiektywne porównanie warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne odkrycia immunologiczne z istotnością przedkliniczną dzięki zastosowaniu w nerkach dorosłych danio pręgowanych oraz w preparatach komórkowych różnych gatunków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako modułowy odczyt stanu zdrowia immunologicznego, który można zastosować w wielu projektach badających immunomodulację, modele infekcji lub szlaki zapalne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w odniesieniu do efektów immunomodulacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki określonym protokołom inkubacji substratu, indukcji oraz pomiaru.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka w przypadku immunomodulacyjnych związków wiodących na podstawie funkcjonalnych odczytów stanu układu odpornościowego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację związków, które znacząco zmieniają potencjał wyrzutu oddechowego, będącego wskaźnikiem sprawności odporności wrodzonej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z zarodkami danio pręgowanego, pomiarach fluorescencji oraz analizie statystycznej znormalizowanych danych.
- Zależne od dostępu do czytnika mikropłytek z funkcją detekcji fluorescencji oraz odpowiedniego rozgrzania źródła światła.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji etapów rozwoju zarodków, czasu dawkowania oraz protokołów odejmowania tła.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu metody w odniesieniu do tkanek dorosłych lub innych gatunków ryb, zgodnie z treścią źródła.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak niebezpieczny charakter PMA, co wymaga zachowania środków ostrożności podczas obchodzenia się z odczynnikiem i jego ważenia.
