Name: Kwantyfikacja reakcji na impuls oddechowy jako wskaźnik wrodzonego zdrowia immunologicznego u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-12T16:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji reakcji oddechowej u zarodków Danio rerio przy użyciu fluorescencji. Ta technika umożliwia ocenę wrodzonej odporności i zdrowia immunologicznego w modelu zwierzęcym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować byłym i obecnym członkom laboratorium Kim, Markowi Nilanowi za opiekę i utrzymanie danio pręgowanego, dr Robertowi Wheelerowi za pomocne dyskusje i dzielenie się danymi, a także granty NIH 3RO1GM087308-02S1 i 1P20RR024475-01A2 oraz Maine Agricultural and Forest Experiment Station (numer publikacji 3303) za finansowanie.

1. Pielęgnacja i utrzymanie danio pręgowanego
<ol>
	<li>Hodowla: Masowe tarło dorosłego danio pręgowanego, jak opisano wcześniej13. Zbierz odrodzone zarodki, jak opisano wcześniej14.</li>
	<li>Mikroiniekcja (w razie potrzeby): Mikrowstrzyknąć 1-4 zarodki danio pręgowanego w stadium komórkowym z oligonukleotydami morfolino, aby zniszczyć produkty genów lub mRNA w celu nadekspresji produktów genów, jak opisano wcześniej15.
	<ol>
		<li>Utrzymuj odpowiednią pulę próbnych kontrolnych, którym wstrzyknięto (co najmniej 48 żywych, pozorowanych ryb kontrolnych, którym wstrzyknięto szczepionkę, i 48 żywych, eksperymentalnie zmanipulowanych ryb jest potrzebnych do wypełnienia mikropłytki w 96 dołkach).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj zarodki: Hoduj zarodki na głębokich szalkach Petriego w temperaturze 28 °C w wodzie jajowej (60 μg/ml natychmiastowej soli morskiej oceanicznej w wodzie destylowanej w autoklawie) do pożądanego etapu rozwoju (reakcja na impuls oddechowy nie jest wykrywalna przy użyciu tego protokołu u zarodków danio pręgowanego w wieku młodszym niż 2 dni po zapłodnieniu12). Uwaga: Zaobserwowano, że zapobieganie pigmentacji w zarodkach danio pręgowanego poprzez stosowanie 1-fenylo 2-tiomocznika (PTU) lub złotego/slc24a5 zmutowanego danio pręgowanego nie zmienia znacząco indukcji fluorescencji przez PMA (dane niepublikowane, zarodki testowane w 48, 72 i 96 hpf).
	<ol>
		<li>Martwe zarodki należy usuwać codziennie za pomocą plastikowej pipety do transferu.</li>
		<li>Ostrożnie przelej starą wodę z jaj i codziennie uzupełniaj nową wodę z jaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zarodki dechorionatowe: W dniu eksperymentu, zarodki dechorionate (jeśli zarodki są nadal w swoich kosmówkach), jak opisano wcześniej, przy użyciu dwóch cienkich kleszczy14 (ten test pęknięcia oddechowego można również przeprowadzić na wypreparowanych nerkach od dorosłego danio pręgowanego12, a szczegółowe protokoły wycinki nerki od dorosłego danio pręgowanego zostały wcześniej opisane16,17).</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy H2DCFDA: Odważyć 1 mg H2DCFDA.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1 mg H2DCFDA w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml.</li>
		<li>Przygotować 22 μl podwielokrotności tego roztworu podstawowego w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.</li>
		<li>Zawiń porcje roztworu podstawowego H2DCFDA folię aluminiową i trzymaj w ciemności, gdy tylko jest to możliwe H2DCFDA ponieważ jest wrażliwa na światło.</li>
		<li>Przechowywać H2DCFDA porcji w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>UWAGA - Przygotować roztwór podstawowy octanu mirystynianu forbolu (PMA): Odważyć 1 mg PMA przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (tj. rękawic, okularów i maski).
	<ol>
		<li>Rozpuścić PMA w 1 ml DMSO, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml.</li>
		<li>Przygotować 11 μl porcji w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.</li>
		<li>Podwielokrotności roztworu podstawowego PMA należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy H2DCFDA: W dniu doświadczenia przygotować H2DCFDA roztwór roboczy, dodając 1 część H2DCFDA roztworu podstawowego do 1 części DMSO (500 μg/ml H2DCFDA stężeniu końcowym). Na przykład dodać 20 μl roztworu podstawowego H2DCFDA i 20 μl DMSO do owiniętej folią probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy PMA: W dniu eksperymentu przygotuj roztwór roboczy PMA, dodając 1 część roztworu podstawowego PMA do 49 części wody wolnej od nukleaz (końcowe stężenie 20 μg/ml PMA). Na przykład rozcieńczyć 10 μl roztworu podstawowego PMA w 490 μl wody wolnej od nukleaz w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.</li>
	<li>Przygotuj roztwór dozujący H2DCFDA: W dniu doświadczenia przygotuj H2DCFDA roztwór dozujący o końcowym stężeniu 1 μg/ml H2DCFDA w wodzie jajecznej. Przygotowane objętości roztworów dozujących można dowolnie modyfikować, ale należy pamiętać o utrzymaniu końcowych stężeń odczynników. W przypadku nerek, zamiast wody jajecznej, użyj tej samej objętości zmodyfikowanego podłoża Eagle's firmy Dulbecco/F-12 (50% DMEM, 50% F-12, bez czerwieni fenolowej). Aby przygotować 5 ml roztworu dozującego H2DCFDA, użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby przenieść 5 ml wody jajecznej (lub DMEM/F-12) do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml owiniętej folią i oznaczonej literą "H".
	<ol>
		<li>Usunąć 10 μl wody jajecznej (lub DMEM/F-12) z 15 ml stożkowej probówki oznaczonej "H" i wyrzucić.</li>
		<li>Dodać 10 μl roztworu roboczego H2DCFDA do stożkowej probówki o pojemności 15 ml oznaczonej literą "H" i przemieszać (objętość ta wystarcza na 48 próbek zarodków lub nerek (połowa pełnej mikropłytki 96-dołkowej), a studzienki te zapewnią pomiary poziomu fluorescencji tła).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór dozujący H2DCFDA + PMA: W dniu doświadczenia należy sporządzić roztwór dozujący H2DCFDA + PMA o stężeniach końcowych: H2DCFDA - 1 μg/ml i PMA - 400 ng/ml. Aby przygotować 5 ml roztworu dozującego H2DCFDA + PMA, użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby przenieść 5 ml wody jajecznej (lub DMEM/F-12) do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml oznaczonej "H + P".
	<ol>
		<li>Usunąć 110 μl wody jajecznej (lub DMEM/F-12) z 15 ml stożkowej probówki oznaczonej "H + P" i wyrzucić.</li>
		<li>Dodać 10 μl roztworu roboczego H2DCFDA, następnie dodać 100 μl roztworu roboczego PMA do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z napisem "H + P" i wymieszać (objętość ta wystarcza na 48 próbek lub drugą połowę pełnej 96-dołkowej mikropłytki).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory dozujące należy przechowywać na lodzie.</li>
</ol>
3. Programowanie czytnika mikropłytek
<ol>
	<li>Przygotuj urządzenie: Włącz czytnik mikropłytek.
	<ol>
		<li>Rozgrzej źródło światła.</li>
		<li>Ustaw program do odczytu fluorescencji: np. Wzbudzenie: 485 nm; emisja: 528 nm; Pozycja optyki: góra 510 nm; Czułość: 65, z 5-sekundowym krokiem potrząsania przed odczytem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 96-dołkowa mikropłytka (patrz rysunek 2)
<ol>
	<li>Zbierz zapasy: Zaopatrz się w naczynia z dekorionowanymi zarodkami, czarną 96-dołkową mikropłytkę, pipetor i końcówki p200, wiaderko z lodem z roztworami dozującymi H2DCFDA i H2DCFDA + PMA, wielokanałowy pipetor p200, dwa sterylne zbiorniki, folię aluminiową i nożyczki.</li>
	<li>Przenieś jeden zarodek do każdego dołka na 96-dołkowej mikropłytce: Użyj nożyczek, aby przeciąć końcówkę pipety tak, aby zarodki lub nerki zmieściły się w otworze.
	<ol>
		<li>Ustawić pipetor p200 na 100 μl i przenieść jeden zarodek wraz z wodą jajeczną (lub DMEM/F-12) do tylu dołków czarnej 96-dołkowej mikropłytki, ile jest pożądane (nie jest konieczna zmiana końcówki pipety dla każdej próbki zarodka w warunkach doświadczalnych, ale może być konieczna zmiana końcówek między warunkami doświadczalnymi). Należy unikać przenoszenia resztkowych chorakcji, ponieważ mają one tendencję do zniekształcania zebranych danych. Do transferu nerek można użyć pipetora o większej objętości (ustawionego na 100 μl) i w razie potrzeby przyciąć końcówki pipet w celu uzyskania większego rozmiaru otworu. Może być konieczne włączenie studzienek bez próbek zarodków lub nerek, ale z roztworami dozującymi w celu kontroli niektórych manipulacji eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać roztwory dozujące: Wlej H2DCFDA roztwór dozujący do sterylnego zbiornika o pojemności 25 ml.
	<ol>
		<li>Za pomocą wielokanałowego pipetora p200 i ośmiu końcówek można jednocześnie pipetować 100 μl roztworu dozującego H2DCFDA do jednej kolumny na mikropłytce 96-dołkowej (końcowe stężenie 500 ng/ml H2DCFDA).</li>
		<li>Powtórz to (zmiana końcówek nie jest konieczna) dla dowolnej liczby kolumn (zwykle sześć kolumn lub 48 dołków, jeśli napełniasz całą mikropłytkę z 96 dołkami). Dodaj ten roztwór do połowy kontrolnych próbek zarodków i połowy eksperymentalnie zmanipulowanych próbek zarodków (przykładowy zestaw 96-dołkowych mikropłytek pokazano na rysunku 2, te studzienki (kolor pomarańczowy) dostarczą danych o fluorescencji tła w próbkach nieindukowanych PMA).</li>
		<li>Wlej roztwór dozujący H2DCFDA + PMA do nowego, sterylnego zbiornika o pojemności 25 ml.</li>
		<li>Użyj wielokanałowego pipetora p200 i ośmiu końcówek, aby jednocześnie pipetować 100 μl roztworu dozującego H2DCFDA + PMA do pozostałych kolumn (oznaczonych na czerwono na rysunku 2) mikropłytki 96-dołkowej (zmiana końcówek nie jest konieczna, końcowe stężenia H2DCFDA-500 ng/ml i PMA-200 ng/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryj mikropłytkę folią aluminiową.</li>
	<li>Potrząsaj mikropłytką przez około 20 sekund z prędkością 150 obr./min, aby homogenizować roztwory w każdym dołku.</li>
	<li>Inkubować mikropłytkę w temperaturze 28 °C, gdy nie jest ona odczytywana.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja fluorescencji
<ol>
	<li>Odczytać mikropłytkę w czasie = 0 godzin po dodaniu PMA, korzystając z parametrów opisanych w kroku 3.1.2.
	<ol>
		<li>Kontynuować wykonywanie pomiarów co kilka minut w żądanym przedziale czasu lub inkubować owiniętą folią mikropłytkę w temperaturze 28 °C do późniejszego punktu czasowego, a następnie wykonać pomiar końcowy w żądanym czasie (np. 4 godziny po dodaniu PMA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety transferowej, aby pobrać zarodki ze studzienek.</li>
	<li>Poddaj zarodki eutanazji zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami i ich użyciem, np. zanurzenie w trikainie MS222.</li>
	<li>Wyrzuć mikropłytkę i inne materiały jednorazowego użytku do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Zdecyduj o punkcie czasowym, w którym chcesz porównać wartości fluorescencji (np. 4 godziny po dodaniu PMA, Tabela 1).</li>
	<li>Odejmij średnią wartość fluorescencji nieindukowanej grupy kontrolnej od wartości fluorescencji indywidualnej grupy kontrolnej indukowanej PMA.</li>
	<li>Powtórz to dla grupy eksperymentalnej z PMA i bez niego.</li>
	<li>Przechowuj te znormalizowane wartości fluorescencji w dwóch kolumnach, grupie kontrolnej + PMA i grupie eksperymentalnej + PMA (Tabela 2).</li>
	<li>Obliczyć średnie i odchylenia standardowe dla znormalizowanych wartości fluorescencji grupy kontrolnej + PMA i grupy eksperymentalnej + PMA.</li>
	<li>Porównaj znormalizowane wartości fluorescencji za pomocą niesparowanego testu t w celu określenia istotności statystycznej (Tabela 2).</li>
	<li>Na wykresie przedstawiono średnie z grupy kontrolnej + PMA i grupy eksperymentalnej + PMA ze słupkami błędów odzwierciedlającymi odpowiednie odchylenia standardowe.</li>
	<li>Zapisz poziom istotności na wykresie i w legendzie rysunku (rysunek 2).</li>
</ol>

<ol><li>Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immunity%3A+Impact+on+the+Adaptive+Immune+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response.</a> Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).</li>
<li>Lam, S. H., Chua, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Maturation+of+the+Immune+System+in+Zebrafish%2C+Danio+rerio%3A+A+Gene+expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22In+Situ+Hybridization+and+Immunological%22%5BJournal%5D)">Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling.</a> In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).</li>
<li>Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+Profiling+and+Functional+Analyses+of+the+Zebrafish+Embryonic+Innate+Immune+Response+to+Salmonella+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol.+9%22%5BJournal%5D)">Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection.</a> J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).</li>
<li>Ordas, A., Hegedus, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Sequencing+of+the+Innate+Immune+Transcriptomic+Response+of+Zebrafish+Embryos+to+Salmonella+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+%26+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection.</a> Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).</li>
<li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transgenic+Zebrafish+Model+of+Neutrophilic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation.</a> Blood. 13, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+Inflammation+by+Retrograde+Chemotaxis+of+Neutrophils+in+Transgenic+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+Promoter+Transgenes+Direct+Macrophage-Lineage+Expression+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish.</a> Blood. 4, 56-56 (2011).</li>
<li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Zebrafish+is+Mediated+by+the+Cystic+Fibrosis+Transmembrane+Conductance+Regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.</a> Infect. Immun. 11, 4542(2010).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Disseminated+Candidiasis+in+Zebrafish+Reveals+Role+of+Phagocyte+Oxidase+in+Limiting+Filamentous+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth.</a> Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).</li>
<li>Rotman, J., van Gils, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Screening+of+Innate+Immune+Gene+Expression+in+Zebrafish+using+Reverse+Transcription+-+Multiplex+Ligation-Dependent+Probe+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification.</a> BMC Research Notes. 4, (2011).</li>
<li>d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Chemically+Induced+Inflammation+Assay+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish.</a> BMC Biology. 8, 151(2010).</li>
<li>Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Respiratory+Burst+Assay+using+Zebrafish+Kidneys+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos.</a> Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).</li>
<li>Avdesh, A., Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+Care+and+Maintenance+of+a+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Laboratory%3A+An+Introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Brothers, K. M., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+Imaging+of+Disseminated+Candidiasis+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (65), e4051(2012).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (37), e1717(2010).</li>
<li>Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+Unconventional+Behavior+of+Neutrophils+in+Developing+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li>
<li>Davidson, A. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27Definitive%27+%28and+%27Primitive%27%29+Guide+to+Zebrafish+Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis.</a> Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).</li>
<li>Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Stimuli+Change+Expression+of+Genes+and+Neutrophil+Function+in+Fathead+Minnow+Pimephales+promelas+Rafinesque%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque.</a> Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue-Scale+Gradient+of+Hydrogen+Peroxide+Mediates+Rapid+Wound+Detection+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish.</a> Nature. 459, 996-1000 (2009).</li>
<li>Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThisse%2C+B+%22ZFIN+Direct+Data+Submission%22">ZFIN Direct Data Submission</a>. , (2001).</li>
<li>Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThisse%2C+B+%22ZFIN+Direct+Data+Submission%22">ZFIN Direct Data Submission</a>. , (2004).</li>
<li>Table 18.4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Molecular+Probes+Handbook%22">The Molecular Probes Handbook</a>. , 11th, Forthcoming.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podstawową funkcją fagocytów jest wykrywanie, pochłanianie i niszczenie patogenów. Zdolność fagocytów do wytwarzania odpowiedniego wybuchu oddechowego ma kluczowe znaczenie dla tej funkcji. Tak więc kwantyfikacja odpowiedzi na impuls oddechowy jest jedną z metod umożliwiających porównanie ogólnego wrodzonego zdrowia i funkcji immunologicznej między grupami osób i/lub w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne. W tym miejscu opisujemy protokół indukcji, ilościowego określania i porównywania reakcji na wybuch oddechowy m...

System immunologiczny składa się z dwóch gałęzi: odporności wrodzonej i nabytej. Odporność wrodzona jest ewolucyjnie starsza niż odporność nabyta. Obecnie uważa się, że bezkręgowce mają tylko wrodzoną odporność, podczas gdy kręgowce posiadają zarówno gałęzie wrodzone, jak i adaptacyjne. Podczas gdy odporność nabyta zapewnia specyficzną i długotrwałą odporność na niektóre patogeny, odporność wrodzona jest natychmiastową reakcją na atakujące bakterie, wirusy i grzyby. Kluczowym aspektem wrodzonej odpowiedzi immunologicznej jest uwalnianie cytokin i chemokin, co powoduje stan zapalny i rekrutację fagocytów (np. makrofagów, neutrofili) do pochłaniania i niszczenia obcych najeźdźców.
Udane wrodzone reakcje immunologiczne obejmują: (1) rozpoznawanie atakujących mikroorganizmów; (2) indukcja odpowiednich kaskad sygnalizacyjnych (np. uwalnianie cytokin i chemokin); (3) prawidłowy rozwój/odpowiednia liczba komórek fagocytarnych; (4) migracja fagocytów do miejsc zakażenia; (5) pochłanianie patogenów; oraz (6) niszczenie pochłoniętych mikroorganizmów. Niedobór któregokolwiek z tych kroków może prowadzić do tego, że gospodarz zostanie przytłoczony infekcją i podda się jej. Silna wrodzona odpowiedź immunologiczna ma zasadnicze znaczenie dla zdrowia organizmów, ponieważ jest pierwszą linią obrony przed patogenami we wszystkich roślinach i zwierzętach. U kręgowców nasila również adaptacyjną odpowiedź immunologiczną1. Dlatego tak ważne jest, abyśmy byli w stanie ocenić wszystkie aspekty wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, aby lepiej ją zrozumieć i zoptymalizować jej funkcję.
Wiele organizmów modelowych jest używanych do badania odporności wrodzonej, począwszy od Arabadopsis, przez C. elegans, Drosophila, myszy, aż po hodowane komórki ludzkie. Zaletą stosowania systemu modelowego danio pręgowanego (Danio rerio) do badania odporności wrodzonej jest to, że danio pręgowany jest kręgowcem, posiadającym zarówno odporność wrodzoną, jak i nabytą, jednak rozwój odporności wrodzonej i nabytej jest czasowo oddzielony. Danio pręgowany polega wyłącznie na odporności wrodzonej w celu ochrony przed infekcją, dopóki odporność adaptacyjna nie stanie się w pełni funkcjonalna, co następuje około 4-6 tygodni po zapłodnieniu2. Oprócz narzędzi do manipulacji genetycznej, jasności optycznej i szybkiego, zewnętrznego rozwoju, odporność wrodzona jako główny sposób obrony zarodków danio pręgowanego zapewnia uproszczony model, w którym można badać złożoność wrodzonej odpowiedzi immunologicznej in vivo.
Opracowano wiele protokołów do oceny różnych aspektów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u zarodków danio pręgowanego. Mikromacierze i RNAseq potwierdziły, że profile cytokin wywołane przez wrodzoną odpowiedź immunologiczną danio pręgowanego są podobne do ludzkiej, a także zasugerowały udział nieoczekiwanych genów w odporności wrodzonej3,4. Przezroczystość zarodka danio pręgowanego oraz fluorescencyjnych, transgenicznych szczepów patogenów i danio pręgowanego pozwala na wizualizację dynamicznych interakcji gospodarz-patogen in vivo w czasie rzeczywistym. Transgeniczne zarodki danio pręgowanego wykazujące ekspresję GFP pod kontrolą promotora mieloperoksydazy specyficznego dla neutrofili 5,6 lub promotora mpeg1 specyficznego dla makrofagów7 umożliwiły wizualizację i ilościowe określenie migracji fagocytów do miejsc zlokalizowanych infekcji8, a także wizualizację fagocytozy i niszczenia patogenów znakowanych fluorescencyjnie8,9. Zarodki danio pręgowanego są również podatne na generowanie wysokoprzepustowych testów i chemicznych badań przesiewowych. W związku z tym niedawno opracowano wysokoprzepustowe metody analizy transkryptomu po zakażeniu10 i migracji fagocytów do miejsc uszkodzenia wywołanegochemicznie11.
Spośród technik wymienionych powyżej, żadna nie ocenia ilościowo końcowego etapu niszczenia patogenów przez fagocyty. Ten ostatni etap polega na wybuchu oddechowym (tj. produkcji ROS i innych toksycznych związków), które zabijają pochłonięte patogeny. Enzym oksydaza NADPH jest głównym źródłem ROS w komórkach fagocytarnych. Złożenie podjednostek enzymu oksydazy NADPH powoduje przeniesienie elektronów do tlenu, generując aniony ponadtlenkowe. W wyniku kolejnych reakcji enzymatycznych ponadtlenek może zostać przekształcony w nadtlenek wodoru i kwas podchlorawy (ryc. 1A). To właśnie wybuch oddechowy fagocytów zabija patogeny, a zatem ilościowe określenie potencjału wybuchu oddechowego zarodków danio pręgowanego wskazuje na ogólny wrodzony stan zdrowia immunologicznego. Opracowaliśmy test oparty na fluorescencji w celu ilościowego określenia wybuchu oddechowego w grupach pojedynczych zarodków danio pręgowanego12. Test ten wykorzystuje niefluorescencyjną, zredukowaną formę dostępnego na rynku, przepuszczalnego dla komórek barwnika. Barwnik ten, dioctan 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (H2DCFDA), po utlenieniu przekształca się w związek fluorescencyjny, 2',7'-dichlorofluoresceinę (DCF). Różnorodne ROS generowane przez wybuch oddechowy fagocytów może utleniać H2DCFDA i generować fluorescencję24. Pojawienie się fluorescencji można wykorzystać do ilościowego określenia i porównania reakcji na wybuch oddechowy między grupami danio pręgowanego. Octan mirystynianu forbolu agonistycznego kinazy białkowej C (PMA) jest używany do chemicznej indukcji oksydazy NADPH w celu wytworzenia ROS, a tym samym zwiększenia odczytów fluorescencji (Figura 1B). W niniejszym dokumencie przedstawiamy szczegółowy protokół zmodyfikowanej i zoptymalizowanej wersji tego testu na wybuch oddechowy zarodka danio pręgowanego. Test ten można wykorzystać do porównania wybuchu oddechowego między grupami pojedynczych zarodków danio pręgowanego w czasie i/lub w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne (np. knockdown białka za pośrednictwem morfoliny). Zastosowanie tej metody, w połączeniu z innymi testami odporności wrodzonej danio pręgowanego, zapewni pełniejszy obraz złożonej i krytycznej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.

<table><tbody><tr><td>Natychmiastowa sól morska oceaniczna</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>H2DCFDA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>35845-1G</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Fisher</td><td>BP6851</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2438-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina S MS222</td><td>Western Chemical</td><td>100 gramów</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, bez technologii </td><td></td><td>Phenol Red Life11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Głębokie szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pipety transferowe</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>#5 Kleszcze Dumonta</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Mikroprobówki</td> wirówkowe <td>Axygen</td><td>10011-724</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Stożkowe probówki wirówkowe</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Wielomodowy czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>Kontakt BioTek</td><td></td></tr><tr><td>Black 96-dołkowa mikropłytka</td><td>VWR</td><td>82050-728</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Sterylne zbiorniki</td><td>VistaLab</td><td>3054-2003</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipetor</td><td></td><td></td> wielokanałowy Gilson F123601 <td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89079-948</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>89079-478</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja reakcji na impuls oddechowy jako wskaźnik wrodzonego zdrowia immunologicznego u danio pręgowanego

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Wybuch oddechowy fagocytów jest częścią wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na infekcję patogenem i obejmuje produkcję reaktywnych form tlenu (ROS). ROS są toksyczne i działają w celu zabijania fagocytowanych mikroorganizmów. Kwantyfikacja in vivo ROS pochodzących z fagocytów dostarcza informacji na temat zdolności organizmu do wytworzenia silnej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Tutaj opisujemy protokół ilościowego określania i porównywania ROS w całych zarodkach danio pręgowanego po chemicznej indukcji wybuchu oddechowego fagocytów. Metoda ta wykorzystuje związek niefluorescencyjny, który staje się fluorescencyjny po utlenieniu przez ROS. Pojedyncze zarodki danio pręgowanego są pipetowane do studzienek mikropłytki i inkubowane w tym fluorogennym podłożu z lub bez chemicznego induktora wybuchu oddechowego. Fluorescencja w każdym dołku jest oznaczana ilościowo w żądanych punktach czasowych za pomocą czytnika mikropłytek. Odczyty fluorescencji są korygowane w celu wyeliminowania fluorescencji tła, a następnie porównywane za pomocą niesparowanego testu t. Metoda ta pozwala na porównanie potencjału impulsów oddechowych zarodków danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju oraz w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne, takie jak knockdown białka, nadekspresja lub leczenie środkami farmakologicznymi. Metoda ta może być również stosowana do monitorowania reakcji na impuls oddechowy w całych wypreparowanych nerkach lub preparatach komórkowych z nerek dorosłego danio pręgowanego i niektórych innych gatunków ryb. Wierzymy, że względna prostota i zdolność adaptacji tego protokołu uzupełni istniejące protokoły i będzie interesująca dla badaczy, którzy chcą lepiej zrozumieć wrodzoną odpowiedź immunologiczną.

Poniżej przedstawiamy dane porównujące odpowiedź w postaci wyrzutu oddechowego w embrionach zebrafish (typ dziki, tło AB) w 48. i 72. godzinie po zapłodnieniu (hpf). Embriony w 48 hpf stanowiły grupę kontrolną, a embriony w 72 hpf grupę eksperymentalną. Wielkość próby wynosiła 24 embriony nieindukowane oraz 24 embriony indukowane PMA dla każdego etapu rozwoju. Surowe odczyty fluorescencji (w względnych jednostkach fluorescencji (RFU)) uzyskano poprzez odczyt mikropłytki 4 godziny po dodaniu PMA. Surowe wartości fluoresce...

Wrodzona odpowiedź immunologiczna chroni organizmy przed infekcją patogenem. Krytyczny składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, pęknięcie oddechowe fagocytów, generuje reaktywne formy tlenu, które zabijają atakujące mikroorganizmy. Opisujemy test wyrzutu oddechowego, który określa ilościowo reaktywne formy tlenu wytwarzane, gdy wrodzona odpowiedź immunologiczna jest indukowana chemicznie.

Kwantyfikacja reakcji na impuls oddechowy jako wskaźnik wrodzonego zdrowia immunologicznego u danio pręgowanego

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie fluorescencji do ilościowego oznaczenia odpowiedzi w postaci wyrzutu oddechowego. Najpierw należy umieścić zarodki danio pręgowanego w dołkach płytki 96-dołkowej. Następnie dodaje się substrat fluorescencyjny i aktywuje wyrzut oddechowy za pomocą czynnika chemicznego.Następnie należy określić ilość względnej fluorescencji przy użyciu fluorymetru. Ostatecznie fluorescencję wykorzystuje się do wykazania potencjału wyrzutu oddechowego. Metodę tę można zastosować do badania wpływu manipulacji eksperymentalnych na ogólny stan zdrowia odporności wrodzonej.W niniejszej pracy wykorzystujemy tę metodę do analizy wyrzutu oddechowego embrionów danio przebrzmionego, jednak można ją zastosować również w innych systemach, takich jak dorosłe osobniki danio przebrzmionego, komórki nerek oraz preparaty komórkowe z innych gatunków ryb. Hodować embriony w głębokich szalkach Petriego w temperaturze 28 °C w wodzie do jaj aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwojowego. Codziennie usuwać martwe embriony.Ostrożnie odlej zużytą wodę z jaj i codziennie uzupełniaj ją nową wodą z jaj. W dniu eksperymentu przygotuj rozcieńczony roztwór roboczy fluorescein

quantification-respiratory-burst-response-as-an-indicator-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Określenie liczby reakcji oddechowych jako wskaźnik stanu zdrowia odporności wrodzonej u Danio pręgowanego

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

W niniejszej pracy opisujemy nowatorski wysokoprzepustowy test chemicznie indukowanego stanu zapalnego, którego celem jest identyfikacja bioaktywnych substancji immunomodulujących. Skutecznie połączyliśmy zautomatyzowaną mikroskopię z autorskimi skryptami oprogramowania, co umożliwia automatyczną kwantyfikację odpowiedzi zapalnej, a także dalsze przetwarzanie, analizę, wydobywanie i przechowywanie danych.

Usprawnianie odkrywania leków: zautomatyzowany wysokotreściowy test stanu zapalnego u rybek danio pręgowanych

Artykuł opisuje behawioralną metodę oceny stresu u danio pręgowanego. W odpowiedzi na stres danio pręgowany ma tendencję do pływania na dnie zbiornika, dopóki stres nie zostanie usunięty. Przykładowy protokół opisuje krokową metodę wykonywania testu.

Nowatorski test nurkowania w butli: metoda badania wrodzonych reakcji na stres u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół generowania i obrazowania zlokalizowanej infekcji bakteryjnej w pęcherzyku zewnętrznym danio pręgowanego.

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Pokazano systemiczne i zlokalizowane modele infekcji wirusa grypy A u ludzi. Korzystając z modelu infekcji ogólnoustrojowej, danio pręgowany może być używany do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. Korzystając z modelu infekcji zlokalizowanej, danio pręgowany może być wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza.

Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

Tutaj prezentujemy protokół modelowania ludzkiej gruźlicy u dorosłego danio pręgowanego przy użyciu jego naturalnego patogenu Mycobacterium marinum. Wyekstrahowane DNA i RNA z narządów wewnętrznych zakażonego danio pręgowanego można wykorzystać do ujawnienia całkowitego obciążenia prątkami u ryb i odpowiedzi immunologicznej gospodarza za pomocą qPCR.

Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum

Protokół opisuje intubację dorosłego danio pręgowanego za pomocą leku biologicznego; następnie preparację i przygotowanie jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR. Metoda ta pozwala na podawanie związków bioaktywnych w celu monitorowania wychwytu jelitowego i wywołanego miejscowego bodźca immunologicznego. Ma to znaczenie dla badania dynamiki jelit w profilaktyce doustnej.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

Ten protokół opisuje model infekcji Aspergillus u larw danio pręgowanego. Zarodniki Aspergillus są mikrowstrzykiwane do tyłomózgowia larw, a leczenie chemiczne stosuje się w celu wywołania immunosupresji. Postęp infekcji jest monitorowany za pomocą codziennego zestawu do obrazowania w celu monitorowania wzrostu grzybów i odpowiedzi immunologicznej, a także liczenia żywych zarodników przez posiewanie jednostek tworzących kolonie.

Zakażenie larw danio pręgowanego zarodnikami Aspergillus w celu analizy interakcji gospodarz-patogen

Tutaj opisujemy protokoły do wykonywania obrazowania na żywo i analizy ilościowej dynamiki receptorów chemoatraktantu u neutrofili danio...

Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę

Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

Poznaj metodę kwantyfikacji reakcji oddechowej u zarodków Danio rerio przy użyciu fluorescencji. Ta technika umożliwia ocenę wrodzonej odporności i zdrowia immunologicznego w modelu zwierzęcym.

Kwantyfikacja reakcji na impuls oddechowy jako wskaźnik wrodzonego zdrowia immunologicznego u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów