Name: Nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej? (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Poznaj syntezę nanoleków na bazie kwasu polimalowego do celowanej terapii nowotworowej. Metoda bioprodukcji z Physarum polycephalum umożliwia personalizowane leczenie raka piersi Her2+ z wysoką czystością optyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bardzo dziękujemy za wsparcie finansowe od NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, grantów z Wydziału Neurochirurgii w Cedars-Cedars Medical Center oraz Arrogene Technology Inc.

Wszystkie eksperymenty są zgodne z oficjalnymi przepisami dotyczącymi zwierząt, w tym zabiegi chirurgiczne i niechirurgiczne wykonywane in vivo i są w pełni zgodne z protokołami IACUC.
1. Bioprodukcja kwasu polimalowego
<ol>
	<li>Wyhodować kulturę nasienną z sferuli na agarze i przenieść plazmodię do 100 ml pożywki hodowlanej, używając inkubatora o temperaturze 25 °C i podstawowego podłożahodowlanego 8,9.</li>
	<li>Wyprodukuj ilość 500 ml mikroplazmodii wypełnionych grawitacyjnie bez dostępu światła, aby uniknąć zarodnikowania.</li>
	<li>Przygotować 80 g CaCO3 zawieszonego w 8 l pożywki podstawowej w 10-litrowym naczyniu bioreaktora. Przenieść wypełnione 500 ml mikroplazmodia do zamontowanego naczynia reakcyjnego i pozostawić bioproces przez 75 godzin w temperaturze 25 °C, przepływie przefiltrowanego powietrza 10 l/min i mieszaniu 150 obr./min, mieszając za pomocą mieszadła segmentowego.</li>
	<li>Zakończyć, gdy bulion hodowlany ma pH 4,8 wskazujące na koniec produkcji PMLA i zmierzyć zawartość PMLA za pomocą testu hydroksymatu/Fe(III).</li>
	<li>Schłodzić bulion do temperatury 17 °C i pozostawić komórki do grawitacyjnego osiadania.</li>
	<li>Schłodzić do 4 °C i dostosować do pH 7,5, użyć 2 M NaOH. Przepompować supernatant przez kolumnę wypełnioną 1,5 l DEAE-celulozy w kierunku od dołu do góry (gruboziarnisty DEAE, zrównoważony z 20 mM Tris-HCl pH 7,5 w 5 °C).</li>
	<li>Przemyć 3 kolumnami buforu zawierającego 0,3 M NaCl po zmianie kierunku od góry do dołu i wymyć PMLA w obecności 0,7 M NaCl.</li>
	<li>Dostosuj do 0,1 M CaCl2 i wytrącić PMLA-Wapń 80% lodowatym etanolem. Frakcjonować nad Sephadex G25 do PMLA-wapń o stężeniu 80 – 300 kDa, 50 – 80 kDa i 10 – 50 kDa, używać wody pod nieobecność buforu i soli.</li>
	<li>Przepuść każdą frakcję przez kolumnę Amberlite IR 120H+ i natychmiast zamroź przepływający kwas polimalowy w ciekłym azocie w celu liofilizacji.</li>
	<li>Rozpuścić w suchym acetonie. Po filtracji usunąć rozpuszczalnik ze strumienia suchego powietrza, liofilizować i przechowywać w temperaturze minus 20 °C.</li>
</ol>
2. Synteza nanoleku na bazie kwasu polimalowego
<ol>
	<li>Aktywuj grupy karboksylowe PMLA (P) przez zmieszanie 116 mg (1 mmol jednostek malylowych) PMLA-H w 1 ml bezwodnego acetonu i 1 mmol N-hydroksysukcynimidu i 1 mmol dicykloheksylu karbodymidu w 2 ml dimetyloformamidu (DMF). Mieszać w temperaturze 20 °C przez 3 godziny. Dodać 0,05 mmol mPEG5000-NH 2 (0,05 mol% jednostek malylowych) do 1 ml DMF, a następnie 0,05 mmol trietyloaminy (TEA).</li>
	<li>Dodać kroplami rozpuszczoną w DMF 0,4 mmol estru etylowego leucyny (LOEt) (40 mol% jednostek malylowych), 0,1 mmol 2-tiol-1-etyloaminy (2-MEA) (10 mol% jednostek malylowych) i 0,5 mmol TEA, wszystkie rozpuszczone w DMF. Po każdym dodaniu odczekaj 1 godzinę i sprawdź zakończenie reakcji przez ujemną odpowiedź ninhydryny (chromatografia cienkowarstwowa, TLC).</li>
	<li>Usuń resztki estru NHS przez spontaniczną hydrolizę soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (30 min, pH 6,8). Odsolić na kolumnie PD-10, otrzymać "prekoniugat" w postaci białego proszku przez liofilizację. Przechowywać w suchym miejscu w temperaturze minus 20 °C.</li>
	<li>Rozpuścić 30 mg przeciwciała (mAb, IgG2a-κ) w 4,5 ml 100 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 5,5.</li>
	<li>Zredukować wiązania dwusiarczkowe za pomocą 5 mM chlorowodorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny przez 30 minut w temperaturze 20 °C i oczyścić kolumnę PD-10.</li>
	<li>Rozpuścić Mal-PEG3400-Mal w 2 ml tego samego buforu i dodać zredukowany mAb w końcowej objętości 10 ml i mieszać przez noc w temperaturze 4 °C. Skoncentrować do 2,5 ml nad Vivaspin 20, wykluczenie 30 kD, i oczyścić nad Sephadex G75. Sprawdzić produkt w sec-HPLC i zmierzyć ilość fotometrycznie przy długości fali 280 nm.</li>
	<li>Przyłącz Mal-PEG-Mal-mAb do "presprzężonych" tioli, uzyskując P / PEG5000 (5%) / LOEt (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). W tym celu należy zmieszać 5 ml 200 nmol mAb-PEG3400-Mal z 50 mg (P/mPEG5000/LOEt/2-MEA) w powyższym buforze o pH 5,5, dostosować stężenie sulfhydrylu do 2 mM i inkubować w temperaturze 20 °C przez 3 godziny (wydajność 98%).</li>
	<li>Rozpuścić 3'-H2N-AON w DMF / PBS (pH 7,2) i reagować z N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylotio)propionianem (SPDP) w (1:1 v / v) DMF / metanolu (test ninhydryny) i oczyszczać AON-PDP nad Sephadex-LH20 w metanolu, a następnie w wodzie i liofilizować.</li>
	<li>Inkubować aktywowane 800 nmol AON w buforze o pH 5,5 z wyżej przygotowanym prekoniugatem Mal-PEG3400-Mal-mAb przez noc, aż do zakończenia reakcji wymiany dwusiarczkowej.</li>
	<li>Zawiera fluorescencyjny tioeter tworzący fluorescencyjny Alexa Fluor 680-maleimid z polimerem-2-MEA-SH. Zablokuj nadmiar sulfhydrylów za pomocą 3-pirydylotitiopropionianu (PDP) i oczyść nad Sephadex G75. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub zatrzaskowo zamrożone w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.</li>
</ol>
3. Testy i właściwości
<ol>
	<li>Przeprowadzić badania czystości i stabilności PBS i surowicy w temperaturze 4 °C i 37 °C za pomocą analizy sec-HPLC. Stosować sulfonian polistyrenu jako wzorce masy cząsteczkowej. Zmierz rozkład rozmiarów nano i potencjały zeta. Korzystaj z systemów komercyjnych.</li>
	<li>Do próbki 320 μl dodać 160 μl 10% (m/v) chlorku hydroksyloamonu i 160 μl 10% (m/v) NaOH. Po 10-15 minutach wymieszać ze 160 μl 5% (w/v) Fe(III)Cl3 w 12% (v/v) HCl i odczytać A540 hydroksymatu/Fe(III). Obliczyć PMLA przy założeniu, że 1 mg/ml PMLA odpowiada 2,5 A540.</li>
	<li>Hydrolizować nanolek przez noc w 2 M HCl w temperaturze 110 °C i oznaczyć kwas jabłkowy na chromatografii z odwróconymi fazami w odniesieniu do próbek wzbogaconych wzorcami kwasu jabłkowego. Rozszczepić nanolek za pomocą 100 mM ditiotreitolu i zmierzyć Morpholino-AON za pomocą ilościowej HPLC z odwróconymi fazami w stosunku do wzorców Morpholino AON.</li>
	<li>Weź nanolek bez rozszczepienia i zmierz przeciwciała za pomocą zestawu do oznaczania białek. Określić ilościowo mPEG, pozwalając na jego reakcję z ferrotioniocyjanianem amonu, a następnie wyekstrahować chloroformem i odczytać absorbancję przy długości fali 510 nm10.</li>
	<li>Wykonaj test ELISA z 5 μl nanoleku (1-10 μg mAb) na studzienkę, testując aktywność przeciwciał i koligację. Użyj odpowiednio receptora transferyny 0,5 μg/basenik i HER2 jako antygenów powlekanych płytką i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą.</li>
	<li>Obliczyć osiągnięty % dla AON, mPEG i mAb w odniesieniu do kwasu jabłkowego (100%) i porównać z % zamierzonym w projekcie (zob. przykłady w Tabeli 1 i Tabeli 2).</li>
</ol>
4. Badania in vitro
<ol>
	<li>Inkubuj nanolek z hodowanymi komórkami rakowymi i zmierz komórki, które przeżyły w czasie, na podstawie ich aktywności w celu redukcji żółtego odczynnika [3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium] (MTS) do niebieskiego barwnika i odczytać względną absorbancję za pomocą fotometru. Postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy zestawu.</li>
	<li>Przygotuj ekstrakty komórkowe in vitro lub ex vivo do Western blot. Użyj lodowatego buforu ekstrakcyjnego, który zawiera SDS i koktajl inhibitorów proteazy. Oddzielanie białek poprzez redukcję elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS.</li>
	<li>Wykonaj western blotting dla białek będących przedmiotem zainteresowania w ekstraktach próbki. Użyj przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fosfatazą alkaliczną.</li>
	<li>Użyj mikroskopii konfokalnej, aby zademonstrować wychwyt komórek i kolokalizację platformy polimerowej nanoleku, AON i endosomów za pomocą znakowania fluorescencyjnego. Podłącz Alexa Fluor 680 do platformy nano sprzężonej i Lissamine do AON-ów jako etykiety fluorescencyjne. Użyj mikroskopowego skanera spektralnego 5X i żywych komórek rakowych, aby zobrazować rozmieszczenie znakowanych cząsteczek</li>
	<li>Zabarwić błony endosomów barwnikiem fluorescencyjnym czerwieni styrylowej i wykazać kolokalizację lub uwalnianie endosomu.</li>
</ol>
5. Testy in vivo
<ol>
	<li>Przygotuj ludzki HER2-dodatni model myszy z rakiem piersi (naga mysz Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm). Umieść 0,72 mg 17β-estradiolu uwalniającego osad (uwalnianie 90-dniowe) podskórnie w szyję każdej myszy.</li>
	<li>Następnie wstrzyknij 1 x 107 komórek nowotworowych BT-474 podskórnie w prawą flankę i pozwól guzowi rosnąć.</li>
	<li>Leczenie należy rozpocząć, gdy guzy mają wielkość 120mm3, wstrzykując do żyły ogonowej 150 μl nanokoniugatu zawierającego 2,5 mg/kg AON i/lub 4,5 mg/kg każdego przeciwciała. W leczeniu wstrzykiwać dwa razy w tygodniu, łącznie sześć razy.</li>
	<li>Zmierz rozmiar guza za pomocą suwmiarki dwa razy słabszej i oblicz objętość za pomocą wzoru (długość x głębokość x szerokość) x (π/6). Eutanazja zwierząt 2 tygodnie po ostatnim wstrzyknięciu i po uspokojeniu roztworem ketaminy i deksmedetomidyny, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Izoluj guzy i skrawki barwników za pomocą H&E w celu oceny morfologicznej.</li>
	<li>Do oceny dystrybucji leków w skali zwierzęcej należy użyć systemu obrazowania fluorescencyjnego. Wstrzyknij nanolek i obraz oznaczony Alexa Fluor 680 po 24 i 48 godzinach.</li>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji i wykryj fluorescencję w izolowanych i perfundowanych guzach i narządach.</li>
</ol>

<ol><li>Koboldt, D. C., Fulton, R. S., McLellan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.+Cancer+Genome+Atlas+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Cancer Genome Atlas Network.</a> Nature. 490, 61-70 (2012).</li>
<li>Kwong, L. N., Costello, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+NRAS+signaling+differentially+regulates+survival+and+proliferation+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma.</a> Nat. Med. 18, 1503-1510 (2012).</li>
<li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGerlinger%2C+M+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. Gerlinger, M., Rowan, A. J. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Yap, T. A., Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+cancer+genome%3A+strategies+for+the+discovery+and+clinical+development+of+targeted+molecular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Exploiting the cancer genome: strategies for the discovery and clinical development of targeted molecular therapies.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 549-573 (2012).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Biomarkers%3A+Knowing+the+Present+and+Predicting+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer Biomarkers: Knowing the Present and Predicting the Future.</a> Future Oncol. 1, 37-50 (2005).</li>
<li>Suh, K. S., Sarojini, S., Youssif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Banking%2C+Bioinformatics%2C+and+Electronic+Medical+Records%3A+The+Front-End+Requirements+for+Personalized+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tissue Banking, Bioinformatics, and Electronic Medical Records: The Front-End Requirements for Personalized Medicine.</a> J. Oncology. , (2013).</li>
<li>Ljubimova, J. Y., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+nanopolymers%3A+the+next+generation+of+breast+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicine%2C+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Biocompatible nanopolymers: the next generation of breast cancer treatment.</a> Future Medicine, Nanomedicine. 7, 1-4 (2012).</li>
<li>Lee, B. -S., Vert, M., Holler, E. Water-soluble aiphatic polyesters: poly(malic acid)s. Biopolymers 3a. Steinbüchel, A. , Wiley VCH. Weinheim (Bergstrasse). 75-103 (2002).</li>
<li>Lee, B. -S., Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycefin%2C+a+new+prototype+of+multifunctional+nanoconjugate+based+on+poly%28beta-L-malic+acid%29+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Polycefin, a new prototype of multifunctional nanoconjugate based on poly(beta-L-malic acid) for drug delivery.</a> Bioconjugate Chem. 17, 317-326 (2006).</li>
<li>Nag, A., Mitra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+for+estimation+of+polyethylene+glycol+and+polyethylene+glycolated+protein+using+ammonium+ferrothiocyanate%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochem%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethylene glycolated protein using ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochem. 237, 224-231 (1996).</li>
<li>Ding, H., Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+brain+tumor+growth+by+intravenous+poly%28beta-L-malic%29+acid+nanobioconjugate+with+pH-dependent+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly(beta-L-malic) acid nanobioconjugate with pH-dependent drug release.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 18143-18148 (2010).</li>
<li>Inoue, S., Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobioconjugate+inhibition+of+HER2%2Fneu+signaling+and+synthesis+provides+efficient+mouse+breast+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Nanobioconjugate inhibition of HER2/neu signaling and synthesis provides efficient mouse breast cancer treatment.</a> Cancer Research. 71, 1454-1464 (2011).</li>
<li>Maeda, H., Sawa, T., Konno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tumor-targeted+delivery+of+macromolecular+drugs%2C+including+the+EPR+effect+in+solid+tumor+and+clinical+overview+of+the+prototype+polymeric+drug+SMANS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANS.</a> J. Control. Release. 74, 47-61 (2001).</li>
<li>Ljubimova, J. Y., Fujita, M., Ljubimov, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28malic+acid%29+nanoconjugates+containing+various+antibodies+and+oligonucleotides+for+multitargeting+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomed%22%5BJournal%5D)">Poly(malic acid) nanoconjugates containing various antibodies and oligonucleotides for multitargeting drug delivery.</a> Nanomed. 3, 247-265 (2008).</li>
<li>Inoue, S., Patil, R., Portilla-Arias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+nanobioconjugate+inhibiting+EGFR+expression+in+triple+negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel nanobioconjugate inhibiting EGFR expression in triple negative breast cancer.</a> PLoS One. 7, 1-9 (2012).</li>
<li>Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Delivery+of+Doxorubicin+via+pH-Controlled+Hydrazone+Linkage+Using+Multifunctional+Nano+Vehicle+Based+on+Poly%28%CE%B2-L-malic+Acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(β-L-malic Acid).</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 11681-11693 (2012).</li>
<li>Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide+delivery+to+tumor+cells+by+a+multifunctional+nano+vehicle+based+on+poly%28%CE%B2-L-malic+acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Temozolomide delivery to tumor cells by a multifunctional nano vehicle based on poly(β-L-malic acid).</a> Pharm. Res. 27, 2317-2329 (2010).</li>
<li>Ljubimova, J. Y., Portilla-Arias, J., Patil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+and+efficacy+evaluation+of+multiple+targeted+polymalic+acid+conjugates+for+triple-negative+breast+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Drug+Target%22%5BJournal%5D)">Toxicity and efficacy evaluation of multiple targeted polymalic acid conjugates for triple-negative breast cancer treatment.</a> J. Drug Target. 21, 956-967 (2013).</li>
</ol>

Autorzy: Julia Y. Ljubimova, Keith L. Black i Eggehard Holler są udziałowcami Arrogene Technology Inc.

Przedstawiono eksperymentalną drogę otrzymywania nanoleków z biodegradowalnego polimeru naturalnego, które mogą być wykorzystane w syntezie medycyny spersonalizowanej. Opis rozpoczyna się od kontrolowanej produkcji i oczyszczania kwasu polimalowego, który jest wszechstronną platformą do syntezy nanoleków. Stosując powtarzalne techniki, polimer jest otrzymywany o wysokiej masie cząsteczkowej i ekstremalnej czystości odpowiedniej do syntez farmaceutycznych. Synteza została opisana dla nanoleku, który, jak wykazano, skutecznie leczy HER2-dodatniego raka piersi. Opis ten można przełożyć na syntezy większości innych nanoleków stosowanych w leczeniu raka. Celowanie obejmuje przeciwciała, takie jak Herceptin, które wiążą antygen specyficzny dla nowotworu, taki jak białko HER2 lub dowolny inny marker nowotworowy, który jest skutecznie internalizowany. Nanolek dostarcza szereg oligonukleotydów antysensownych i chemioterapeutyków, które skutecznie hamują wzrost leczonego nowotworu. W tym przykładzie wiązanie Herceptyny z HER2 i swoiste wyżarzanie oligonukleotydów antysensownych z mRNA kodującym HER2 spowodowało trwałe zablokowanie sygnalizacji HER2 i poważne zmniejszenie HER2-dodatniego raka piersi. Opierając się na podstawowej zasadzie celowania w nowotwór i hamowania ekspresji genów przez oligonukleotydy antysensowne, do tej pory zsyntetyzowaliśmy kilka innych nanoleków i skutecznie zahamowaliśmy przedklinicznego glejaka ludzkiego i potrójnie ujemnego raka piersi11,14-18.
Prace syntetyczne rozpoczynają się od przygotowania wysoko oczyszczonej platformy nanolekowej, którą jest kwas polimalowy z supernatantu kultury Physarum polycephalum (gatunek z rodziny "śluzowców"). Preparat kładzie nacisk na wysoką masę cząsteczkową polimeru, w zasadzie umożliwiając przyłączanie licznych przeciwciał, peptydów, oligonukleotydów i innych cząsteczek pełniących rolę w aktywnym dostarczaniu leków i hamowaniu wzrostu guza. Po kontrolowanym wyhodowaniu i oczyszczeniu uzyskano powtarzalną jakość polimeru w przewidywalnych plonach. Polimer jest przechowywany w dogodnych warunkach przez dowolny czas.
Synteza nanokoniugatów PMLA rozpoczynająca się od chemicznej aktywacji karboksylanów polimerowo-wiszących odbywa się w kilku syntetycznych etapach. Pomiędzy etapami synteza może być opcjonalnie wstrzymana, co pozwala na przygotowanie dowolnych ilości produktów pośrednich, a tym samym może być wykorzystana w skalowaniu w górę. Postęp syntezy jest śledzony przez TLC i sec-HPLC, a zarówno skład, jak i aktywność nanoleku są kontrolowane za pomocą ilościowych testów chemicznych specyficznych dla grupy, ELISA i różnych pomiarów fizycznych. Z naszego doświadczenia wynika, że syntezy te przebiegały płynnie i powtarzalnie, z doskonałymi plonami i czystością. Wybierając specyficzność oligonukleotydów przeciwciał i antysensownych, każdy wariant nanoleku jest korzystnie syntetyzowany w zależności od potrzeb w medycynie spersonalizowanej.
Metody skutecznego leczenia ludzkiego HER2-dodatniego raka piersi są ważnymi przedstawicielami w przygotowywaniu mysich modeli raka, stosowaniu nanoleków, obrazowaniu i analizie wzrostu guza. Wyniki badań żywotności in vitro są przydatne w wyborze linii komórkowej i wiodącego leku, który ma być użyty w doświadczeniu na zwierzętach. In vivo (in vivo) Obrazowanie ksenogenowe potwierdza, że nanolek jest rzeczywiście dostarczany do guza. Wyniki western blottingu ujawniają, czy poziom niektórych białek zareagował w przewidywany sposób podczas leczenia raka. Pomiar wielkości guza informuje o powodzeniu leczenia, czyli o zahamowaniu, recesji lub regresji. Opisany przykład odzwierciedla nasze doświadczenia z innymi nanolekami na bazie kwasu polimalowego, wskazując na wysoki stopień przewidywalności, odtwarzalności i braku zauważalnej toksyczności. Ostatnie wyniki dotyczące toksyczności i skuteczności wielu celowanych koniugatów kwasu polimalowego w leczeniu potrójnie ujemnego raka piersi silnie wspierają ten pogląd18. Kluczową cechą jest to, że nasz nanolek jest w stanie przenikać przez bariery biologiczne: barierę śródbłonkową przez wynaczynienie do śródmiąższu guza, błonę komórek nowotworowych przez wychwyt endosomów oraz rozerwanie błony endosomów przez działanie grup etyloestru leucyny lub trileucyny. Wynaczynienie i wychwyt endosomów są niezawodnie realizowane przez specyficzne przeciwciała przyłączone do nanoleku. Przeciwciało przeciwko mysiemu receptorowi transferyny pośredniczy w skutecznym napływie do guza przez transcytozę, prawdopodobnie dlatego, że receptor ulega nadekspresji na większości naczyń krwionośnych guza. Inne przeciwciało przyłączone do tej samej cząsteczki sprzężonej nano działa w specyficznym kierowaniu nanoleku do komórki nowotworowej biorcy. Obecność obu przeciwciał, jednego odpowiedzialnego za transcytozę, a drugiego za wychwyt endosomów, jest niezbędna do optymalnego funkcjonowania. Analiza ilościowa kwasu jabłkowego i przeciwciał jest wysoce zalecana w celu kontrolowania optymalnego składu nanoleku. Na koniec należy zauważyć, że kowalencyjny nanolek typu "wszystko w jednym" dostarcza lek w postaci przyłączonej chemicznie w drodze przez układ krwionośny gospodarza do komórki nowotworowej biorcy. Przyłączenie chemiczne sprawia, że większość leków jest nieaktywna (proleków), dopóki nie zostaną one odtworzone jako wolne leki przez rozszczepienie z platformy nano sprzężonej w miejscu docelowym. Jest to ważne, ponieważ metoda reaktywacji zapewnia wysoki stopień bezpieczeństwa podczas porodu i minimalną szansę na wywołanie szkodliwych skutków ubocznych. Wszechstronność, skuteczność i bezpieczeństwo to nieodzowne atrybuty dobrej medycyny spersonalizowanej.

W erze postgenomicznej, kiedy genomy raka zostały rozwikłane (National Center for Biotechnology i The Cancer Genome Atlas), przyszłe leczenie raka będzie uwzględniać różnorodność genetyczną guzów często w obrębie tego samego guza1-4. Bioinformatyka i szybkie, niedrogie sekwencjonowanie DNA pozwala na pozyskiwanie złośliwych genów/mutacji na poziomie osobistym2,4,5. Po zidentyfikowaniu genów pacjenci będą leczeni medycyną spersonalizowaną w celu zmodyfikowania lub wyciszenia ekspresji złośliwych genów6. Potrzeba celowania w komórki nowotworowe i dostarczania leków do tych komórek wymaga wielofunkcyjnych systemów dostarczania. Oczywiście, nanoleki mogą spełnić ten wymóg7.
W fali odkryć nanocząsteczki okazały się odpowiednie do dostarczania ładunków leków chemoterapeutycznych, białek i/lub materiału genetycznie aktywnego do komórek rakowych. Nadal jednak należy zająć się niekorzystnymi skutkami. Jedna z nich, związana z brakiem biodegradowalności, może powodować odkładanie się materiału w zdrowych tkankach i narządach z prawdopodobieństwem wywołania chorób. Aby zminimalizować osadzanie się, wprowadziliśmy nietoksyczny i nieimmunogenny kwas polimalowy, który jest pochodzenia mikrobiologicznego i ulega biodegradacji doH2OiCO28. Używamy polimeru do syntezy kowalencyjnego typu nanoleku typu "wszystko w jednym". Zawiera chemicznie przyłączone chemioterapeutyki, takie jak temozolomid, doksorubicyna lub oligonukleotydy antysensowne i grupy funkcyjne służące do wynaczynienia, celowania w tkanki, dostarczania endosomolitycznego. Leki są wewnętrznie odcinane od nanoplatformy, gdy docierają do docelowej komórki nowotworowej, regenerując w ten sposób ich pełną aktywność farmaceutyczną.
Opisujemy metodę mikrobiologicznej produkcji nano platformy polimerowej, jej oczyszczanie i syntezę chemiczną nano leku, który zawiera trastuzumab (Herceptin) do zwalczania raka i oligonukleotyd antysensowny do hamowania nadprodukcji HER2. Stosując nanolek do ksenogenicznego ludzkiego Her2-dodatniego raka piersi na nagich myszach, wykazujemy wysoką skuteczność leczenia raka. Wprowadzone tutaj zasady celowania w nowotwór i wyciszania genów dla nanoleków kwasu polimalowego mogą być stosowane w leczeniu innych przypadków raka.

<table><tbody><tr><td>2-merkapto-1-etyloamina (cysteamina; 2MEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30078-25G</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Vector Laboratories, Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>90-dniowe uwalnianie 17&beta;-estradiol w granulkach&nbsp;</td><td>Innowacyjne badania Ameryki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 C2 maleimid</td><td>Invitrogen</td><td>A20344</td><td></td></tr><tr><td>Amberlite IR 120H</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6428</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwpieniąca emulsja Y-30</td><td>Sigam-Aldrich</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Łańcuch anty-lamininy-411 Santa</td><td>Cruz</td><td>SC-59980</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pAkt</td><td>mAb Sygnalizacja komórkowa</td><td>9271S</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PARB mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>556494</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko czynnikowi von Willebranda&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży Bacto</td><td>Bacto, Dickinson / Sparks, MD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>beta-aktyny</td><td>3700</td><td></td></tr><tr><td>BT-474&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-20</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Alfa Aesar</td><td>36337</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania proliferacji komórek</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>PR-G3580</td><td></td></tr><tr><td>Centriplus 100&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>4414</td><td></td></tr><tr><td>Dicykloheksylokarbodimid</td><td>Fluka</td><td>36650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna</td><td>Cardinal Health</td><td>S7439-4</td><td></td></tr><tr><td>Galardyna (inhibitory MMP)&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-994</td><td></td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa GAPDH</td><td>&nbsp;</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilin</td><td>Cardinal Health</td><td>S7439-3</td><td></td></tr><tr><td>Hemin ze świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>Herceptin</td><td>Genentech</td><td>15534</td><td></td></tr><tr><td>Herceptin (Western blotting)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2165S</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a-kappa mysia malignoma</td><td>Sigma</td><td>M77695X5m</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Star AP Pakiet substratów</td><td>Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet substratów Immun-StarTM AP&nbsp;</td><td>Odczynnik do wody Biorad</td><td>170-5012</td><td></td></tr><tr><td>LAL&nbsp;</td><td>Lonza, MD</td><td>W50-1000</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-411 mAbs</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ester etylowy leucyny (LOEt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61850-10G-F</td><td></td></tr><tr><td>Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 Testy</td><td>Cambrex BioScience</td><td>N384</td><td></td></tr><tr><td>Lissamin-Morpholino AON</td><td>Gene Tools</td><td>Wykonany</td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>kwas L-jabłkowy&nbsp;</td>Dehydrogenaza jabłczanowa <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6413</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2634</td><td></td></tr><tr><td>Mal-PEG-Mal</td><td>Laysan</td><td>mal-PEG-mal-3400</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>Mleko beztłuszczowe w proszku&nbsp;</td><td>Proteomika</td><td>M203-10G</td><td></td></tr><tr><td>Morfoliinooligonukleotydy&nbsp;</td><td>GeneTools</td><td>na</td><td></td>zamówienie</tr><tr><td>mPEG5000</td><td>Lysan</td><td>mPEG-NH2-5000</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimd (NHS)&nbsp;</td><td>ACROS Organics</td><td>15727100</td><td></td></tr><tr><td>Ninhydrin</td><td>Merck</td><td>1.06762.0100</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna z membraną nitrocelulozową Sandwich</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Kanapka z bibułą filtracyjną z membraną nitrocelulozową, 0,45 i mikro; m&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Novex &reg; Bufor transferowy Tris-Glycine (25x)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>Nagie myszy [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm]&nbsp;</td><td>Taconic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 10x</td><td>Gibco</td><td>10010-49</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 1x</td> Kolumny odsalające <td>Gibco</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851</td><td></td></tr><tr><td>Physarum polycephalum M3CVII</td><td>ATCC</td><td>204388</td><td></td></tr><tr><td>Test białka Pierce BCA&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>1.18362E+11</td><td></td></tr><tr><td>Detektor białek Zestaw ELISA KPL</td><td></td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 superfine</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0031</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex-LH20&nbsp;</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>17-0090</td><td></td></tr><tr><td>SKBR-3&nbsp;</td><td>Proteochem ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>SPDP</td><td>&nbsp;</td><td>C1116</td><td></td></tr><tr><td>Streamline-DEAE</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0994</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień styrylowa FM 1-43&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>T-3163</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>TLC, arkusze tlenku glinu pokrytego krzemionką</td><td>Merck, Darmstadt, DE</td><td>60F254</td><td></td></tr><tr><td>Trileucyna (LLL)</td><td>Bachem</td><td>H-3915</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X114</td><td></td></tr><tr><td>Tween&reg; 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20&nbsp;</td><td>VWR</td><td>14005-302</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deksmedetomidyna</td>, <td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Atipamezol</td><td>, Pfizer</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Carprofen</td>, <td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Betadine</td><td>, Foster and Smith, Wisconsin</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej?

Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Guzy o podobnym stopniu i morfologii często różnie reagują na to samo leczenie z powodu różnic w profilowaniu molekularnym. Aby uwzględnić tę różnorodność, opracowano medycynę spersonalizowaną w celu wyciszania genów związanych z nowotworami złośliwymi. Nanoleki odpowiadają na te potrzeby, celując w nowotwór i dostarczając oligonukleotydy antysensowne do wyciszania genów. Ponieważ leki stosowane w leczeniu są często podawane wielokrotnie, pożądany jest brak toksyczności i znikoma odpowiedź immunologiczna. W przedstawionym przykładzie nanolek jest syntetyzowany z biodegradowalnej, nietoksycznej i nieimmunogennej platformy kwasu polimalowego poprzez kontrolowaną ligację chemiczną oligonukleotydów antysensownych i cząsteczek ukierunkowanych na nowotwór. Synteza i leczenie są przykładem ludzkiego Her2-dodatniego raka piersi przy użyciu eksperymentalnego modelu mysiego. Przypadek można przełożyć na syntezę i leczenie innych nowotworów.

Przedstawiono przykład nanoleku opartego na kwasie polimalowym w kierunku racjonalnego projektowania medycyny spersonalizowanej, która ma zastosowanie w leczeniu raka. Opisuje syntezę nanoleku do leczenia Her2-dodatniego ludzkiego raka piersi u nagiej myszy.

Nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

Ogólnym celem jest stworzenie nanostrukturalnej platformy umożliwiającej zastosowanie uniwersalnego protokołu syntezy leków spersonalizowanych w oparciu o profil genetyczny choroby pacjenta, w szczególności w przypadku nowotworów. W pierwszej kolejności należy wytworzyć i oczyścić kwas polimalonowy z mikroorganizmu frum polycephalum, a następnie chemicznie aktywować oczyszczony PMLA w obrębie jego bocznych grup karboksylowych. Następnie należy przyłączyć małe grupy funkcyjne oraz łącznik MEA poprzez substytucję grup aktywowanych, a nieużyte grupy aktywowane przywrócić do postaci grup karboksylowych w procesie hydrolizy.Następnie należy dołączyć przeciwciała i cząsteczki antysensowne poprzez grupy sulfhydrylowe łącznika, MEA oraz czapeczki. Niewykorzystany łącznik, poprzez reakcję z PDP po zakończeniu procesu, pozwala zweryfikować skład oraz funkcję nanoleku. Wyniki działania nanoleku uzyskano na modelu zwierzęcym, takim jak myszy z agresywnym nowotworem ludzkim.Dwa dodatnie wyniki HER w raku piersi mogą określać skuteczność leczenia, a także to, czy terapia przebiega bez niepożądanych skutków ubocznych. Główną zaletą bioprodukcji w porównaniu z istniejącymi metodami syntetycznymi, takimi jak polimeryzacja otwierająca pierścień, jest fakt, że biopolimer zachowuje pełną czystość optyczną i nie jest zanieczyszczony produktami ubocznymi. Ta rodzina nanoleków PolyPhen może być kierowana do dowolnego typu komórek na podstawie specyficznego targetowania i regulować ekspresję białek.Ogólnie rzecz biorąc, leczenie nowotworów za pomocą nanoleków PHE jest bardzo skuteczne w kilku modelach zwierzęcych, zwłaszcza w przypadku pierwotnych nowotworów mózgu i piersi. Początkowo nasza koncepcja tej metody opierała się na blokowaniu syntezy specyficznej dla glejaka wielopostaciowego lamininy w formach izo, a następnie udowodniliśmy, że celowanie i hamowanie białek HER2 oraz białek w potrójnie ujemnym raku piersi zapobiega wzrostowi guza. Zastosowania tej techniki rozciągają się na diagnostykę nowotworów z wykorzystaniem obrazowania optycznego i rezonansu magnetycznego.Polimerowe nanoleki mogą dostarczyć cennych informacji na temat dostarczania leków w leczeniu nowotworów. Mogą one być również stosowane w innych stanach patologicznych, takich jak choroby zakaźne, uśmierzanie bólu oraz zaburzenia neurologiczne. Po wyhodowaniu kultury zarodnika plazmodium z pętli na świdrze, zaszczepić 100 milliliters podstawowego medium hodowlanego i inkubować kulturę w temperaturze 25 degrees Celsius.Inkubator termostatyczny służy do produkcji grawitacyjnie upakowanego podłoża mikroplazmowego w warunkach braku dostępu światła. Aby zapobiec sporulacji w 10 litrowym zbiorniku bioreaktora, należy rozpuścić 80 g węglanu wapnia w ośmiu litrach podłoża podstawowego, a następnie przenieść upakowane podłoże mikroplazmowe do zamontowanego naczynia reakcyjnego i ustawić bioproces na 75 godzin. Proces należy prowadzić w temperaturze 25 °C, przy przepływie filtrowanego powietrza wynoszącym 10 l/min oraz mieszaniu za pomocą mieszadła segmentowego z prędkością 150 RPM.Gdy pH pożywki osiągnie wartość 4.8, należy przerwać hodowlę w celu pomiaru produkcji kwasu polimaleinowego. Następnie schłodzić pożywkę do 17 °C, pozwolić komórkom opaść pod wpływem grawitacji i usunąć nadsącz z reaktora. Dostosować pH do wartości 7.5.Następnie przepompuj supernatant od dołu przez kolumnę DEAE-celulozy o pojemności 1,5 litra, równoważoną 20 mM Tris-HCl o pH 7,5 w temperaturze 5 °C. Następnie przepuść trzy objętości kolumny buforu piorącego zawierającego 0,3 M NaCl od dołu do góry kolumny i eluuj PMLA w obecności 0,7 M NaCl. Dostosuj frakcję eluowanego PMLA do stężenia 0,1 M CaCl₂ i dodaj 80% lodowatego etanolu, aby wytrącić sole wapniowe PMLA; następnie przeprowadź frakcjonowanie sole wapniowe PMLA przy użyciu Sephadex G-25 i wody.Na koniec każdą frakcję przepuść przez kolumnę z bursztynowym światłem, a następnie natychmiast zamroź przepływ przez kwas polimalonowy w ciekłym azocie i liofilizuj przed przechowywaniem w temperaturze -20 °C. Aby aktywować grupy karboksylowe PMLA, zmieszaj 1 mmol jednostek malonowych PMLA-H w 1 ml bezwodnego acetonu oraz po 1 mmol hydroksycynnamidu i cykloheksylokarbodiimidu w 2 ml dimetyloformamidu; po mieszaniu w temperaturze 20 °C przez trzy godziny dodaj 0,05 mmol metylo-PEG-aminy w 1 ml DMF, a następnie 0,05 mmol trietyloaminy.Następnie kroplami dodać 0,4 millimoli leucyny etyloesteru, a po godzinie sprawdzić zakończenie reakcji za pomocą cienkowarstwowej chromatografii, szukając negatywnej odpowiedzi hyn. W podobny sposób dodać 0,1 millimoli two me capto, jeden etylaminę oraz 0,5 millimoli TEA. Pozostały ester NHS usunąć poprzez spontaniczną hydrolizę w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.Przeprowadź odsolenie na kolumnie PD 10, a następnie liofilizuj, aby otrzymać biały proszek; przechowuj ten prekoniugat w stanie suchym w temperaturze -20 °C. Następnie dodaj 30 mg przeciwciała do 4,5 ml 150 mM NaCl w 100 mM fosforanie sodu o pH 5,5. Zredukuj mostki dwusiarczkowe za pomocą 5 mM chlorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny i oczyść na kolumnie PD 10.Następnie rozpuść IDE PEG IDE w dwóch mililitrach powyższego buforu, jednak o pH 6,3. Dodaj zredukowane przeciwciało i mieszaj w temperaturze 20 °C przez jedną godzinę. Skoncentruj do 2,5 ml przy użyciu AVEVA spin 20 z granicą odcięcia 30 kDa, a następnie oczyść na kolumnie cidex G 75.Następnie należy zweryfikować produkt za pomocą SEC HPLC. Zmierz ilość przy 280 nanometrach i potwierdź brak zanieczyszczeń przy innych długościach fal. Następnie zmieszaj 50 miligramów koniugatu wstępnego z 200 MLEs przeciwciała sprzężonego z PEG IDE w pięciu mililitrach buforu o pH 6,3.Dostosuj stężenie grup sulfhydrylowych do 2 mM i inkubuj w temperaturze 20 °C przez trzy godziny. Aby uzyskać wydajność 98%, rozpuść oligosomowy antysensowny oligonukleotyd (AON) z aminą 3' i przereaguj go z jedną objętością SPDP, oczyść AON-PDP na kolumnie Sephadex LH 20 w metanolu, następnie odparuj metanol, rozpuść produkt w wodzie i liofilizuj. Teraz inkubuj 800 nM aktywowanych AON z przeciwciałem sprzężonym z PEG i MEA-SH przez noc. Po zakończeniu reakcji wymiany dwusiarczkowej wprowadź blok fluorescencyjny, zablokuj nadmiar grup sulfhydrylowych za pomocą PDP i oczyść na kolumnie Sephadex G 75.Gotowy nanolek na bazie kwasu polimaleinowego należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby określić zawartość kwasu polimaleinowego podczas produkcji, należy postępować w następujący sposób: do 320 µL próbki dodać 160 µL 10% chlorku hydroksyloamoniu oraz 160 µL 10% wodorotlenku sodu. Po 10 do 15 minutach zmieszać z 160 µL 5% roztworem chlorku żelaza(III) i zaobserwować powstanie ciemnofioletowego zabarwienia przy 540 nm. Następnie nanolek należy poddać hydrolizie przez noc w 2 M kwasie solnym w temperaturze 110 °C w zamkniętej ampułce, a następnie oznaczyć kwas maleinowy za pomocą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej.Zastosowano próbki wzbogacone wzorcami kwasu maleinowego. Następnie nanolek poddano rozszczepieniu przy użyciu 100 mM ditiotreitolu, a zawartość antysensownych oligonukleotydów morpholino oznaczono ilościowo za pomocą odwróconej fazy HPLC względem wzorców morpholino ON. Wykorzystując rozszczepiony nanolek, oznaczono zawartość przeciwciał za pomocą zestawu do analizy białek w celu ilościowego określenia zawartości Maleik-PEG.Najpierw przeprowadzić reakcję z tiocyjanianem amonu, następnie wyekstrahować chloroformem i zmierzyć absorbancję przy 510 nanometrach. Przetestować aktywność przeciwciał oraz ko-ligację za pomocą testu ELISA, stosując 5 µL nanoleku na dołek oraz 0,5 µg na dołek antygenu HER2 do powlekania płytki. Na koniec obliczyć osiągnięty procent dla oligonukleotydu antysensownego, EG i przeciwciała w stosunku do kwasu maleinowego.Porównaj z wartością procentową zamierzoną w projekcie leku. To bimodalne strategiczne podejście do nanoleku wykorzystuje Herceptin do hamowania szlaku sygnałowego HER2 oraz specyficzny dla HER2 antysens w celu zablokowania transkrypcji receptora HER2; przeciwciała ułatwiają transcytozę poprzez endotelialny TFR naczyniowy guza. Platforma nanokoniugatu z kwasu polimaleinowego została wytworzona z hodowli mikroplazmy i oczyszczona, a aktywacja grup karboksylowych PMLA ułatwiła syntezę rusztowania prekoniugatu.I na koniec, wiodący nanokoniugat. Testy ELISA wykazały zachowanie aktywności przeciwciał monoklonalnych w trakcie syntezy nanoleku. Po połączeniu obu przeciwciał na tej samej platformie polimerowej, za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej śledzono pobór komórkowy nanoleku.Nałożone na siebie obrazy z godziny zero i trzeciej przeanalizowano wraz z oznakowanymi endosomami. Współczynniki korelacji Pearsona dla kolokalizacji wskazują na uwalnianie nanoleku z endosomów do cytoplazmy oraz dysocjację ON od nanoleku w wyniku zależnego od glutationu rozszczepienia wiązań dwusiarczkowych w cytoplazmie. In vitro główny kandydat na nanolek najskuteczniej hamował wzrost w linii komórkowej z nadekspresją HER2.Eksperymenty in vivo na myszach z przeszczepem ludzkiego raka piersi BT 4 74, wykazującego nadekspresję HER2, wykazały ponad 95% zahamowania wzrostu guza po zastosowaniu wiodącego nanoleku zawierającego Herceptin oraz specyficzny dla HER2 A ON. Analiza ex vivo metodą Western blotting wskazała na zahamowanie zarówno syntezy HER2, jak i fosforylacji AKT, natomiast rozszczepienie PARP świadczyło o apoptozie. Regresja guza w odpowiedzi na leczenie została potwierdzona poprzez zmniejszenie rozmiaru guza oraz ubytek komórek nowotworowych w badaniu histologicznym.Powinni Państwo posiadać teraz dobrą wiedzę na temat wykorzystania biokompatybilnej nanoplatformy w celu przeprowadzenia skutecznego leczenia spersonalizowanego bez efektów ubocznych oraz otrzymania nanoleku o kontrolowanym składzie i zweryfikowanej aktywności funkcjonalnej. Po opanowaniu tej metody, czujniki te mogą być wykonywane z wysoką powtarzalnością po ich opracowaniu. Technika ta, wykorzystująca nanoplatformę z kwasu poliakrylowego do ukierunkowanego dostarczania oligonukleotydów antysensownych, otwiera przed badaczami w dziedzinie spersonalizowanej nanomedycyny drogę do eksploracji leczenia nowotworów celującego w specyficzne molekularne markery nowotworowe zidentyfikowane w drodze spersonalizowanej analizy genetycznej. Farmakologicznie czynne substancje i komórki mogą być niezwykle niebezpieczne.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie maseczki i rękawiczek.

polymalic-acid-based-nano-biopolymers-for-targeting-multiple-tumor

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Polimalowe kwasowe nanobiopolimery przeznaczone do atakowania wielu markerów nowotkowych: Szansa dla medycyny spersonalizowanej?

Celem tego protokołu jest opisanie przygotowania i charakterystyki fizycznie uwięzionych, słabo rozpuszczalnych w wodzie leków w systemach dostarczania leków micelarnych składających się z amfifilowych kopolimerów blokowych.

Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

Tutaj prezentujemy protokół syntezy łożyskowych nanocząstek lipidowo-polimerowych skojarzonych z peptydem wiążącym siarczan chondroityny A (plCSA-BP) za pomocą jednoetapowej techniki sonikacji i biokoniugatu. Cząstki te stanowią nowatorskie narzędzie do ukierunkowanego dostarczania leków do większości ludzkich nowotworów i trofoblastów łożyska w leczeniu nowotworów i zaburzeń łożyska.

Synteza i charakterystyka nanocząstek lipidowo-polimerowych siarczanu chondroityny A (plCSA) ukierunkowanych na łożysko

Rak jajnika tworzy przerzuty w całej jamie otrzewnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół tworzenia i stosowania nanosond rozpraszających Ramana z rezonansem wzmocnionym powierzchniowo, ukierunkowanych na receptor kwasu foliowego, które ujawniają te zmiany z wysoką swoistością za pomocą obrazowania ratiometrycznego. Nanosondy podaje się dootrzewnowo żywym myszom, a uzyskane obrazy dobrze korelują z histologią.

Nanosonda rezonansowa o zwiększonym rezonansie powierzchniowym i nanosonda rozpraszania Ramana do wykrywania mikroskopijnego raka jajnika poprzez celowanie w receptor kwasu foliowego

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

W tym protokole, nanocząstki złota modyfikowane doksorubicyną AS1411-g-PEI-g-PEG są syntetyzowane w trzyetapowych reakcjach amidowych. Następnie doksorubicyna jest ładowana i dostarczana do docelowych komórek rakowych w celu terapii przeciwnowotworowej.

Synteza nanocząstek złota modyfikowanych aptamerem-PEI-g-PEG obciążonych doksorubicyną w celu celowanego dostarczania leków

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Schematy syntezy w celu przygotowania wysoce stabilnych nanocząsteczek włochatych na bazie włókien drzewnych i funkcjonalnych biopolimerów na bazie celulozy zostały szczegółowo opisane.

Wysoce stabilne, funkcjonalne włochate nanocząstki i biopolimery z włókien drzewnych: w kierunku zrównoważonej nanotechnologii

Poznaj syntezę nanoleków na bazie kwasu polimalowego do celowanej terapii nowotworowej. Metoda bioprodukcji z Physarum polycephalum umożliwia personalizowane leczenie raka piersi Her2+ z wysoką czystością optyczną.

Nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej?

Przeglądaj więcej filmów