Nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej?

Ogólnym celem jest stworzenie nanostrukturalnej platformy umożliwiającej zastosowanie uniwersalnego protokołu syntezy leków spersonalizowanych w oparciu o profil genetyczny choroby pacjenta, w szczególności w przypadku nowotworów. W pierwszej kolejności należy wytworzyć i oczyścić kwas polimalonowy z mikroorganizmu frum polycephalum, a następnie chemicznie aktywować oczyszczony PMLA w obrębie jego bocznych grup karboksylowych. Następnie należy przyłączyć małe grupy funkcyjne oraz łącznik MEA poprzez substytucję grup aktywowanych, a nieużyte grupy aktywowane przywrócić do postaci grup karboksylowych w procesie hydrolizy.

Następnie należy dołączyć przeciwciała i cząsteczki antysensowne poprzez grupy sulfhydrylowe łącznika, MEA oraz czapeczki. Niewykorzystany łącznik, poprzez reakcję z PDP po zakończeniu procesu, pozwala zweryfikować skład oraz funkcję nanoleku. Wyniki działania nanoleku uzyskano na modelu zwierzęcym, takim jak myszy z agresywnym nowotworem ludzkim.

Dwa dodatnie wyniki HER w raku piersi mogą określać skuteczność leczenia, a także to, czy terapia przebiega bez niepożądanych skutków ubocznych. Główną zaletą bioprodukcji w porównaniu z istniejącymi metodami syntetycznymi, takimi jak polimeryzacja otwierająca pierścień, jest fakt, że biopolimer zachowuje pełną czystość optyczną i nie jest zanieczyszczony produktami ubocznymi. Ta rodzina nanoleków PolyPhen może być kierowana do dowolnego typu komórek na podstawie specyficznego targetowania i regulować ekspresję białek.

Ogólnie rzecz biorąc, leczenie nowotworów za pomocą nanoleków PHE jest bardzo skuteczne w kilku modelach zwierzęcych, zwłaszcza w przypadku pierwotnych nowotworów mózgu i piersi. Początkowo nasza koncepcja tej metody opierała się na blokowaniu syntezy specyficznej dla glejaka wielopostaciowego lamininy w formach izo, a następnie udowodniliśmy, że celowanie i hamowanie białek HER2 oraz białek w potrójnie ujemnym raku piersi zapobiega wzrostowi guza. Zastosowania tej techniki rozciągają się na diagnostykę nowotworów z wykorzystaniem obrazowania optycznego i rezonansu magnetycznego.

Polimerowe nanoleki mogą dostarczyć cennych informacji na temat dostarczania leków w leczeniu nowotworów. Mogą one być również stosowane w innych stanach patologicznych, takich jak choroby zakaźne, uśmierzanie bólu oraz zaburzenia neurologiczne. Po wyhodowaniu kultury zarodnika plazmodium z pętli na świdrze, zaszczepić 100 milliliters podstawowego medium hodowlanego i inkubować kulturę w temperaturze 25 degrees Celsius.

Inkubator termostatyczny służy do produkcji grawitacyjnie upakowanego podłoża mikroplazmowego w warunkach braku dostępu światła. Aby zapobiec sporulacji w 10 litrowym zbiorniku bioreaktora, należy rozpuścić 80 g węglanu wapnia w ośmiu litrach podłoża podstawowego, a następnie przenieść upakowane podłoże mikroplazmowe do zamontowanego naczynia reakcyjnego i ustawić bioproces na 75 godzin. Proces należy prowadzić w temperaturze 25 °C, przy przepływie filtrowanego powietrza wynoszącym 10 l/min oraz mieszaniu za pomocą mieszadła segmentowego z prędkością 150 RPM.

Gdy pH pożywki osiągnie wartość 4.8, należy przerwać hodowlę w celu pomiaru produkcji kwasu polimaleinowego. Następnie schłodzić pożywkę do 17 °C, pozwolić komórkom opaść pod wpływem grawitacji i usunąć nadsącz z reaktora. Dostosować pH do wartości 7.5.

Następnie przepompuj supernatant od dołu przez kolumnę DEAE-celulozy o pojemności 1,5 litra, równoważoną 20 mM Tris-HCl o pH 7,5 w temperaturze 5 °C. Następnie przepuść trzy objętości kolumny buforu piorącego zawierającego 0,3 M NaCl od dołu do góry kolumny i eluuj PMLA w obecności 0,7 M NaCl. Dostosuj frakcję eluowanego PMLA do stężenia 0,1 M CaCl₂ i dodaj 80% lodowatego etanolu, aby wytrącić sole wapniowe PMLA; następnie przeprowadź frakcjonowanie sole wapniowe PMLA przy użyciu Sephadex G-25 i wody.

Na koniec każdą frakcję przepuść przez kolumnę z bursztynowym światłem, a następnie natychmiast zamroź przepływ przez kwas polimalonowy w ciekłym azocie i liofilizuj przed przechowywaniem w temperaturze -20 °C. Aby aktywować grupy karboksylowe PMLA, zmieszaj 1 mmol jednostek malonowych PMLA-H w 1 ml bezwodnego acetonu oraz po 1 mmol hydroksycynnamidu i cykloheksylokarbodiimidu w 2 ml dimetyloformamidu; po mieszaniu w temperaturze 20 °C przez trzy godziny dodaj 0,05 mmol metylo-PEG-aminy w 1 ml DMF, a następnie 0,05 mmol trietyloaminy.

Następnie kroplami dodać 0,4 millimoli leucyny etyloesteru, a po godzinie sprawdzić zakończenie reakcji za pomocą cienkowarstwowej chromatografii, szukając negatywnej odpowiedzi hyn. W podobny sposób dodać 0,1 millimoli two me capto, jeden etylaminę oraz 0,5 millimoli TEA. Pozostały ester NHS usunąć poprzez spontaniczną hydrolizę w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.

Przeprowadź odsolenie na kolumnie PD 10, a następnie liofilizuj, aby otrzymać biały proszek; przechowuj ten prekoniugat w stanie suchym w temperaturze -20 °C. Następnie dodaj 30 mg przeciwciała do 4,5 ml 150 mM NaCl w 100 mM fosforanie sodu o pH 5,5. Zredukuj mostki dwusiarczkowe za pomocą 5 mM chlorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny i oczyść na kolumnie PD 10.

Następnie rozpuść IDE PEG IDE w dwóch mililitrach powyższego buforu, jednak o pH 6,3. Dodaj zredukowane przeciwciało i mieszaj w temperaturze 20 °C przez jedną godzinę. Skoncentruj do 2,5 ml przy użyciu AVEVA spin 20 z granicą odcięcia 30 kDa, a następnie oczyść na kolumnie cidex G 75.

Następnie należy zweryfikować produkt za pomocą SEC HPLC. Zmierz ilość przy 280 nanometrach i potwierdź brak zanieczyszczeń przy innych długościach fal. Następnie zmieszaj 50 miligramów koniugatu wstępnego z 200 MLEs przeciwciała sprzężonego z PEG IDE w pięciu mililitrach buforu o pH 6,3.

Dostosuj stężenie grup sulfhydrylowych do 2 mM i inkubuj w temperaturze 20 °C przez trzy godziny. Aby uzyskać wydajność 98%, rozpuść oligosomowy antysensowny oligonukleotyd (AON) z aminą 3' i przereaguj go z jedną objętością SPDP, oczyść AON-PDP na kolumnie Sephadex LH 20 w metanolu, następnie odparuj metanol, rozpuść produkt w wodzie i liofilizuj. Teraz inkubuj 800 nM aktywowanych AON z przeciwciałem sprzężonym z PEG i MEA-SH przez noc. Po zakończeniu reakcji wymiany dwusiarczkowej wprowadź blok fluorescencyjny, zablokuj nadmiar grup sulfhydrylowych za pomocą PDP i oczyść na kolumnie Sephadex G 75.

Gotowy nanolek na bazie kwasu polimaleinowego należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby określić zawartość kwasu polimaleinowego podczas produkcji, należy postępować w następujący sposób: do 320 µL próbki dodać 160 µL 10% chlorku hydroksyloamoniu oraz 160 µL 10% wodorotlenku sodu. Po 10 do 15 minutach zmieszać z 160 µL 5% roztworem chlorku żelaza(III) i zaobserwować powstanie ciemnofioletowego zabarwienia przy 540 nm. Następnie nanolek należy poddać hydrolizie przez noc w 2 M kwasie solnym w temperaturze 110 °C w zamkniętej ampułce, a następnie oznaczyć kwas maleinowy za pomocą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej.

Zastosowano próbki wzbogacone wzorcami kwasu maleinowego. Następnie nanolek poddano rozszczepieniu przy użyciu 100 mM ditiotreitolu, a zawartość antysensownych oligonukleotydów morpholino oznaczono ilościowo za pomocą odwróconej fazy HPLC względem wzorców morpholino ON. Wykorzystując rozszczepiony nanolek, oznaczono zawartość przeciwciał za pomocą zestawu do analizy białek w celu ilościowego określenia zawartości Maleik-PEG.

Najpierw przeprowadzić reakcję z tiocyjanianem amonu, następnie wyekstrahować chloroformem i zmierzyć absorbancję przy 510 nanometrach. Przetestować aktywność przeciwciał oraz ko-ligację za pomocą testu ELISA, stosując 5 µL nanoleku na dołek oraz 0,5 µg na dołek antygenu HER2 do powlekania płytki. Na koniec obliczyć osiągnięty procent dla oligonukleotydu antysensownego, EG i przeciwciała w stosunku do kwasu maleinowego.

Porównaj z wartością procentową zamierzoną w projekcie leku. To bimodalne strategiczne podejście do nanoleku wykorzystuje Herceptin do hamowania szlaku sygnałowego HER2 oraz specyficzny dla HER2 antysens w celu zablokowania transkrypcji receptora HER2; przeciwciała ułatwiają transcytozę poprzez endotelialny TFR naczyniowy guza. Platforma nanokoniugatu z kwasu polimaleinowego została wytworzona z hodowli mikroplazmy i oczyszczona, a aktywacja grup karboksylowych PMLA ułatwiła syntezę rusztowania prekoniugatu.

I na koniec, wiodący nanokoniugat. Testy ELISA wykazały zachowanie aktywności przeciwciał monoklonalnych w trakcie syntezy nanoleku. Po połączeniu obu przeciwciał na tej samej platformie polimerowej, za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej śledzono pobór komórkowy nanoleku.

Nałożone na siebie obrazy z godziny zero i trzeciej przeanalizowano wraz z oznakowanymi endosomami. Współczynniki korelacji Pearsona dla kolokalizacji wskazują na uwalnianie nanoleku z endosomów do cytoplazmy oraz dysocjację ON od nanoleku w wyniku zależnego od glutationu rozszczepienia wiązań dwusiarczkowych w cytoplazmie. In vitro główny kandydat na nanolek najskuteczniej hamował wzrost w linii komórkowej z nadekspresją HER2.

Eksperymenty in vivo na myszach z przeszczepem ludzkiego raka piersi BT 4 74, wykazującego nadekspresję HER2, wykazały ponad 95% zahamowania wzrostu guza po zastosowaniu wiodącego nanoleku zawierającego Herceptin oraz specyficzny dla HER2 A ON. Analiza ex vivo metodą Western blotting wskazała na zahamowanie zarówno syntezy HER2, jak i fosforylacji AKT, natomiast rozszczepienie PARP świadczyło o apoptozie. Regresja guza w odpowiedzi na leczenie została potwierdzona poprzez zmniejszenie rozmiaru guza oraz ubytek komórek nowotworowych w badaniu histologicznym.

Powinni Państwo posiadać teraz dobrą wiedzę na temat wykorzystania biokompatybilnej nanoplatformy w celu przeprowadzenia skutecznego leczenia spersonalizowanego bez efektów ubocznych oraz otrzymania nanoleku o kontrolowanym składzie i zweryfikowanej aktywności funkcjonalnej. Po opanowaniu tej metody, czujniki te mogą być wykonywane z wysoką powtarzalnością po ich opracowaniu. Technika ta, wykorzystująca nanoplatformę z kwasu poliakrylowego do ukierunkowanego dostarczania oligonukleotydów antysensownych, otwiera przed badaczami w dziedzinie spersonalizowanej nanomedycyny drogę do eksploracji leczenia nowotworów celującego w specyficzne molekularne markery nowotworowe zidentyfikowane w drodze spersonalizowanej analizy genetycznej. Farmakologicznie czynne substancje i komórki mogą być niezwykle niebezpieczne.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie maseczki i rękawiczek.