Farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie wrażliwości na promieniowanie UV poprzez określenie minimalnej dawki rumienia u myszy o jasnej karnacji, którym podawano cztery skóry. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie skóry grzbietowej myszy do napromieniania przez ścinanie i ablację. Kolejne zabiegi miejscowe forskoliny stosuje się na skórę grzbietową.

Następnie myszy są poddawane różnym dawkom promieniowania UV w celu określenia wpływu czterech pośrednich melonów na stan zapalny wywołany promieniowaniem UV. Uzyskano wyniki, które pokazują, że miejscowo stosowany forline zdecydowanie zwiększa pigmentację skóry i że zwierzęta z farmakologicznie wzmocnionym me są odporne na promieniowanie UV, jak określono przez MED. Są to badania potwierdzające słuszność koncepcji, które pokazują, że możliwe jest farmakologiczne wywołanie opalenizny u osoby niezdolnej do opalania z powodu defektu bardzo ważnego genu melanocytów zwanego receptorem melanokortyny lub MC jeden R W populacjach ludzkich utrata funkcji mc jeden R koreluje z wrażliwością na promieniowanie UV, skłonności do oparzeń słonecznych i niemożność opalania się, a w późniejszym życiu nawet czterokrotne ryzyko czerniaka.

Wybraliśmy cztery czaszki jako lek do tych badań, ponieważ jest ona w stanie ominąć wadliwy szlak sygnałowy receptora melanokortyny i oszukać melanocyty, aby myślały, że mają dobry szlak sygnałowy mc one R, a zatem wytwarzają dużo melaniny, która odkłada się w skórze i chroni zwierzęta przed promieniowaniem UV. Chociaż wiemy, że ta metoda zapewnia wgląd w skórę, która może i jest ponura. Może to być również ważne w profilaktyce raka.

Ponieważ wiemy, że promieniowanie UV jest głównym czynnikiem rakotwórczym dla zdecydowanej większości nowotworów skóry, a wzmocnienie aktywności skóry chroni przed uszkodzeniem UV, Po czterech, wykonuje się iniekcje dootrzewnowe. Należy pamiętać, aby zassać po umieszczeniu igły i przed wstrzyknięciem zawartości, aby upewnić się, że igła nie przebiła się przez naczynie krwionośne, jelita lub pęcherz moczowy, wstrzyknięcia IP należy wykonywać po prawej stronie, aby uniknąć pory roku. Po przygotowaniu ekstraktu z forline i krótkim znieczuleniu myszy izofluorem.

Wdychanie, zgodnie z protokołem tekstowym, podać zwierzęciu dodatkowe znieczulenie z wstrzyknięciem IP ketaminy i ksylazyny. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby zweryfikować sedację. Użyj nożyc elektrycznych wyposażonych w chirurgiczną głowicę przygotowawczą o średnicy 0,25 milimetra, aby obciąć futro grzbietowe.

Użyj kremu do depilacji, aby usunąć zarost. Następnie, aby uniknąć poparzenia lub innego uszkodzenia skóry, natychmiast użyj nasączonych wodą gazików, aby delikatnie przetrzeć skórę grzbietową, aż cały krem zostanie usunięty. Użyj miękkich ręczników papierowych, aby wysuszyć zwierzę przed umieszczeniem go w czystej klatce na podkładce rozgrzewającej, aby się zregenerować.

Ogólnie rzecz biorąc, myszy powinny być krótko znieczulone, aby ułatwić miejscowe podawanie forskoliny lub roztworów kontrolnych za pomocą inhalacji isof fluoru pod wyciągiem. Zacznij od ręcznika papierowego nasyconego fluorem w nasyconym fluorem przezroczystym szklanym słoiku z izofluorem. Po założeniu dopasowanego nylonowego filtra przepuszczającego powietrze znieczuliłem mysz, umieszczając go na filtrze na tyle długo, aby stłumić dobrowolne ruchy mięśni zwierzęcia w stanie uspokojenia na czystej chłonnej podkładce stołowej.

Po wykonaniu uszczypnięcia palca u nogi przenieś 400 mikrolitrów surowego ekstraktu z liny na grzbiet zwierzęcia, kapiąc nim na skórę. Następnie za pomocą boku końcówki rozsmaruj ekstrakt na całej powierzchni odsłoniętej skóry grzbietowej. Umieść mysz z powrotem w klatce i uważnie obserwuj ją, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu, aby zapobiec braku pigmentu.

Cykliczne efekty MP wynikające z mylących eksperymentów z wrażliwością na promieniowanie UV. Przerwij wszystkie zabiegi miejscowe na dwa dni przed ekspozycją na promieniowanie UV, aby przeprowadzić kolorymetrię refleksyjną. Po krótkim znieczuleniu myszy inhalacją z izofluoru.

Skalibruj kolorymetr, umieszczając przenośną głowicę na znormalizowanej białej powierzchni dostarczonej z urządzeniem. Umieść przenośną głowicę pomiarową równo ze skórą grzbietową zwierzęcia, upewniając się, że okrągły otwór o średnicy jednego centymetra kwadratowego jest całkowicie dociśnięty do skóry. Wykonaj co najmniej trzy oddzielne pomiary w różnych obszarach skóry grzbietowej.

Obliczyć średni wynik L, plus lub minus odchylenie standardowe na zwierzę i na grupę badaną. Aby określić minimalną dawkę rumieniową lub MED, każde zwierzę będzie narażone na różne dawki promieniowania UV. Zacznij od przygotowania kawałka taśmy okluzyjnej UV za pomocą wytrzymałego dziurkacza z okrągłym wycięciem o długości jednego centymetra kwadratowego, aby wybić otwory w taśmie nad każdym otworem.

Na taśmie. Nałóż mały, ale łatwo odłączany kawałek taśmy, który można usunąć. W przypadku ekspozycji na promieniowanie UV umieść taśmę na grzbietowej powierzchni znieczulonej myszy.

Jeśli oczy zwierzęcia są otwarte, zastosuj sztuczne łzy, aby zapobiec obrażeniom spowodowanym wysuszeniem i ekspozycją na promieniowanie UV. Włącz źródło UV składające się z dwóch lamp UVB o szczytowej mocy wyjściowej 313 nanometrów i zakresie od 280 do 370 nanometrów. Pozwól jagnięciu zrównoważyć się do stałej mocy UV przed użyciem fotometru UV z czujnikiem UVB w celu sprawdzenia wydajności na podstawie szybkości transmisji UV mierzonej przez fotometr UV, oblicz czas ekspozycji na promieniowanie UV dla każdej żądanej dawki.

Na przykład moc wyjściowa UVB twoich lamp wynosi 2,4 miliwata na centymetr kwadratowy. Dlatego, aby podać pięć kilodżuli na metr kwadratowy, skóra musiałaby być wystawiona na 208 sekund promieniowania UVB, jak obliczono tutaj. Następnie umieść uśpioną powierzchnię brzuszną zwierzęcia w dół, aby zapewnić równomierną ekspozycję na promieniowanie UV, aby sekwencyjnie podawać wybraną dawkę promieniowania.

Usuń małe kawałki taśmy zakrywające otwory w odpowiednim czasie. Przykładowo, jeśli 40 kilodżuli na metr kwadratowy jest największą dawką, mysz będzie pod lampą przez 27 minut i 47 sekund, a otwór na tę dawkę będzie odsłonięty od początku. Jednak w przypadku warunków pięciu kilodżuli na metr kwadratowy taśma zostałaby usunięta po 208 sekundach ekspozycji.

Czas pozostały po ekspozycji na promieniowanie UV, ostrożnie usuń taśmę i umieść zwierzęta w ciepłym, cichym miejscu, aby doszły do siebie po znieczuleniu przed powrotem do klatek. Minimalna dawka rumieniowa lub wartość MED odpowiada minimalnej dawce promieniowania UV, które powoduje stan zapalny zdefiniowany jako rumień i/lub obrzęk całego odsłoniętego kręgu skóry. Monitoruj mysz przez 24 do 48 godzin, aby poszukać dyskretnych obszarów rumienia lub obrzęku w obszarach wystawionych na promieniowanie UV.

Czasami szczątkowy pierwszy zarost zakłóca interpretację testu MED, maskując leżący pod spodem rumień lub obrzęk skóry, zwilżenie skóry 70% etanolem sprawia, że skóra jest znacznie łatwiejsza do interpretacji. Udokumentuj fotograficznie wszelkie ślady skóry, a następnie zwróć myszy do obiektu dla zwierząt. W tych eksperymentach sześć czarnych myszy C 56 zostało wygenerowanych na anodowym lub anodowym tle zawierającym transgen czynnika komórek macierzystych K 14, który pozwala myszom zachować melanocyty w naskórku, aw rezultacie zdeponować melaninę.

W pokazanym tutaj naskórku kohorty myszy o jasnej rozszerzonej skórze były leczone miejscowo przez pięć dni dawkami dwa razy dziennie jednego nośnika lub 40% surowego ekstraktu z korzenia colus fors coly. Wpływ zabiegów miejscowych na pigmentację naskórka określono zarówno na podstawie oględzin, jak i koloru odblaskowego. Zobrazowanie. Stosowanie ekstraktu z korzenia wiązało się z silnym ciemnieniem naskórka na tle transgenicznym K 14 SCF, ale nie u genetycznie dopasowanych zwierząt nietransgenicznych, co sugeruje, że melanocyty naskórka między pęcherzykami muszą być obecne, aby mogła zostać zdeponowana farmakologicznie melanina.

W naskórku, chociaż ekstrakt z korzenia jest głęboko zabarwiony ze względu na obecność fitochemikaliów roślinnych oprócz czterech galin, ciemnienie skóry nie może być spowodowane wyłącznie działaniem umierania przez lek. Ponieważ zwierzęta nietransgeniczne nie wykazują ciemnienia skóry z ekstraktem z korzenia, jak wykazano tutaj, gdy jest stosowany miejscowo dwa razy dziennie, efekty melaniny forskoliny odnotowano w ciągu zaledwie dwóch dni. Chociaż maksymalne ciemnienie było widoczne po kilku kolejnych dniach, pokazane na tym rysunku przez masona czcionki i zabarwienie melaniną grzbietowych odcinków skóry.

Stopień melanii jest zależny od dawki, zwierzęta, które były leczone czterema skórami raz dziennie przez 15 dni lub dwa razy dziennie przez pięć dni, doświadczają podobnego stopnia ciemnienia skóry. Ponadto nie stwierdzono oczywistych skutków toksycznych wynikających z narażenia na działanie czterech substancji przez skórę w żadnej z badanych grup. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że pięciodniowa przyspieszona kuracja promowała bezpieczną meinę skóry grzbietowej tak samo skutecznie, jak standardowa kuracja raz dziennie.

Liczba ta pokazuje, że mierzone za pomocą testów MED, meina naskórka indukowana przez forline powodowała głęboką ochronę przed promieniowaniem UV, podczas gdy średni MED dla myszy z przedłużeniem K 14 SCF leczonych dwa razy dziennie przez pięć dni z podłożem wynosił 5,0 plus minus 0,0 kilodżuli na metr kwadratowy Średni MED dla kohort leczonych miejscowo czterema galinami był większy niż 30,0 plus minus 0,0 kilodżuli na metr kwadratowy. W rzeczywistości dawka 30,0 kilodżuli na metr kwadratowy była niewystarczająca do wytworzenia rumienia. W tym eksperymencie z zastosowaniem dawkowania Glena o standardowej sile średni MED dla leczonych myszy z przedłużeniem K 14 SCF wynosił 50,0 plus minus 7,1 kilodżuli na metr kwadratowy.

Co ważne, wstępne leczenie fours Kline nie wpłynęło na MED zwierząt niezdolnych do spożycia melona ani z powodu braku melanocytów naskórka za pośrednictwem K 14 SCF, ani z powodu niedoboru tyrozynazy. Ponieważ aplikacje czterech Kline zostały przerwane dwa dni przed ekspozycją na promieniowanie UV i nie były kontynuowane po ekspozycji na promieniowanie UV, wnioskujemy, że niepigmentowe efekty CAMP nie odgrywały roli w wynikach MED. Dane sugerują raczej, że meina naskórkowa była mechanizmem, za pomocą którego forline indukował ochronę przed promieniowaniem UV w tym modelu.

Po opanowaniu technika ta umożliwia łatwą i powtarzalną ocenę reakcji pigmentacyjnej skóry i wrażliwości na promieniowanie ultrafioletowe. W modelach zwierzęcych aplikacja forlanda zajmuje tylko kilka minut dziennie, a większość czasu eksperymentalnego poświęca się na promieniowanie UV i testy MED. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać, że skóra stopniowo wraca do swojej wyjściowej jasnej karnacji farmakologicznej.

Indukcja melaniny jest bardzo podobna do odpowiedzi nain, ponieważ skóra pozostanie ciemna tak długo, jak długo będzie stymulowana, ale potem opalenizna wydostaje się ze skóry w ciągu następnych kilku tygodni, gdy bodziec zostanie usunięty.