Name: Farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Poznaj metodę indukcji melaniny w skórze myszy za pomocą forskoliny w celu ochrony przed promieniowaniem UV. Badanie pokazuje, że farmakologicznie wzmocniona pigmentacja zwiększa odporność na uszkodzenia słoneczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Malindzie Spry za pomoc techniczną. Wymieniamy również obecne i przeszłe źródła finansowania: National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), Wendy Will Case Cancer Research Fund, Markey Cancer Foundation, Children's Miracle Network oraz Jennifer and David Dickens Melanoma Research Foundation.

1. Przygotowanie forskoliny do podania miejscowego z surowego ekstraktu z korzenia rośliny Plectranthus barbatus (Coleus forskohlii)
<ol>
	<li>Protokoły dla eksperymentów na myszach były zgodne z wytycznymi dotyczącymi etycznego postępowania w opiece nad zwierzętami i ich wykorzystywania oraz zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt na Uniwersytecie w Kentucky (Protokół nr 00768M2004). Ekstrakt z korzenia przygotowano w stężeniu 40% masa/objętość w standardowej bazie dermatologicznej składającej się z 70% etanolu i 30% glikolu propylenowego.</li>
	<li>Odważyć 200 g surowego ekstraktu z korzenia forskolinii i przenieść go do zlewki. Aby przygotować 500 ml 40% (m/v) roztworu, resuspender 200 g surowego ekstraktu z korzenia forskolinii, dodając większość, ale nie całość objętości nośnika (70% etanolu, 30% glikolu propylenowego), tak aby objętość roztworu wyniosła około 450 ml.</li>
	<li>Mieszać przez godzinę w temperaturze pokojowej. Roztwór będzie dość lepki i może wymagać ręcznego wytrząsania, aby „wprowadzić” ekstrakt do roztworu, zanim mieszadło magnetyczne będzie mogło przejąć proces.</li>
	<li>Po godzinie mieszania przelać mieszaninę do cylindra miarowego i uzupełnić objętość do 500 ml, używając nośnika do „wypłukania” zlewki, w której mieszano zawiesinę (aby zmaksymalizować odzysk forskoliny ze zlewki).</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do polipropylenowych probówek wiriówek o pojemności 50 ml. Wirować (1,500 ×g, temperatura pokojowa, 15 min) przy użyciu wirówki stołowej. Na tym etapie materiał nierozpuszczalny zostanie mocno zagęszczony, co pozwoli na łatwe odlanie supernatantu.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez membranę z octanu celulozy o wielkości porów 0,22 μm, aby usunąć wszelkie pozostałości nierozpuszczalnego materiału z ekstraktu. Stosujemy system filtracji na butelkę przeznaczony do hodowli komórkowych, korzystając z dołączonych do urządzenia filtrów wstępnych, aby zapobiec przedwczesnemu zapychaniu membrany przez nierozpuszczalne składniki ekstraktu z korzenia. Przy przygotowywaniu dużych objętości ekstraktu filtrować około 100 ml na raz, wymieniając filtr wstępny po każdej dodanej objętości.</li>
	<li>Przechowywany w temperaturze pokojowej ekstrakt zachowuje aktywność biologiczną przez okres do jednego roku.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy C57Bl/6 K14-Scf do zabiegów miejscowych
<ol>
	<li>Usuń sierść z grzbietu zwierząt za pomocą strzyżarki elektrycznej. Podaj zwierzętom krótkotrwałe znieczulenie wziewne izofluranem, aby ułatwić strzyżenie grzbietu strzyżarką elektryczną wyposażoną w głowicę chirurgiczną 0,25 mm (Fisher Scientific). W celu zminimalizowania ryzyka przedawkowania środków znieczulających zaleca się stosowanie tylko jednego rodzaju anestezji (np. ketamina/ksylazyna). Nasycona komora inhalacyjna stwarza ryzyko zawodowe przy użytkowaniu poza wyciągiem i dostarcza zwierzętom nieznane ilości środka znieczulającego. W idealnym przypadku należy użyć precyzyjnego parownika.</li>
	<li>Aby usunąć pozostałe kikutowe włosy, poddaj zwierzęta działaniu chemicznego depilatora. Podaj zwierzęciu znieczulenie poprzez wtryskiwanie d.o. ketaminy w dawce 40 mg/kg oraz ksylazyny w dawce 4 mg/kg.</li>
	<li>Gdy zwierzęta zostaną odpowiednio znieczulone (co należy ocenić za pomocą testu uszczypnięcia palca), nałóż ilość kremu do depilacji wielkości opuszka palca na ostrzyżoną skórę grzbietu, używając palca w rękawiczce. Wcieraj krem w skórę przez 30-60 s lub do momentu, gdy włosy staną się wyraźnie widoczne w kremie podczas jego rozprowadzania. Pozostaw krem na skórze tylko przez minimalny czas wymagany do usunięcia włosów, ponieważ przedłużona ekspozycja prowadzi do oparzeń chemicznych skóry, uszkodzenia naskórka i śmierci w wyniku utraty ciągłości bariery naskórkowej.</li>
	<li>Wycieraj skórę grzbietu namoczonymi w wodzie gazikami wielokrotnie, aż do całkowitego usunięcia kremu. Osusz zwierzęta za pomocą miękkich ręczników papierowych i pozwól im dojść do siebie w ciepłym, oddzielnym miejscu (np. w czystych klatkach umieszczonych na macie grzewczej). Depiluj zwierzęta pojedynczo i ściśle monitoruj je przez cały czas trwania procedury.</li>
</ol>
3. Miejscowe podanie forskoliny lub kontroli nośnika
<ol>
	<li>Zwierzęta należy traktować pojedynczo. Krótko znieczulić wdychaniem izofluranu, umieszczając mysz na dopasowanym nylonowym filtrze przepuszczającym powietrze, pod którym w zamkniętym szklanym słoiku w dygestorium umieszczono nasączony izofluranem ręcznik papierowy. Narażać mysz na działanie izofluranu przez czas wystarczający do zahamowania ruchów mięśniowych, ale przy zachowaniu spontanicznego oddychania (zazwyczaj 10-20 sec). Zbyt długie przebywanie zwierzęcia w izofluranie doprowadzi do depresji oddechowej i śmierci. Lepiej zastosować dawkę mniejszą i w razie potrzeby krótko ponownie podać izofluran, niż przedawkować lek i ryzykować śmierć zwierzęcia.</li>
	<li>Wyjąć zwierzę z komory z izofluranem i położyć na czystej, chłonnej podkładce laboratoryjnej.</li>
	<li>Używając mikropipety 1 000 μl z jednorazową końcówką z polipropylenu, pobrać 400 μl 40% surowego ekstraktu z forskoliny (zwierzęta z grupy kontrolnej otrzymają samą mieszaninę 70% etanolu i 30% glikolu propylenowego).</li>
	<li>Nanieść ekstrakt na grzbiet zwierzęcia, kapiąc go na skórę, a następnie, używając boku końcówki pipety, rozprowadzić ekstrakt po skórze grzbietowej, aż zostanie ona całkowicie pokryta. Po aplikacji nie ma potrzeby osuszania skóry.</li>
	<li>Wrócić mysz do klatki i uważnie obserwować ją aż do momentu wybudzenia z narkozy.</li>
	<li>Aby efekty działania cAMP niezwiązane z pigmentem nie zakłócały eksperymentów nad wrażliwością na UV, należy przerwać wszystkie zabiegi miejscowe 2 dni przed ekspozycją na UV (efekt pigmentacyjny utrzymuje się przez kilka dni po ostatnim zabiegu miejscowym).</li>
</ol>
4. Pomiar koloru skóry metodą kolorymetrii refleksyjnej
<ol>
	<li>Krótkotrwale znieczul mysz za pomocą wziewnego izofluranu (patrz powyżej).</li>
	<li>Skalibruj kolorymetr Minolta, umieszczając przenośną głowicę na zestandaryzowanej białej powierzchni dostarczonej wraz z urządzeniem.</li>
	<li>Przyłóż przenośną głowicę pomiarową kolorymetru bezpośrednio do skóry grzbietowej zwierzęcia, upewniając się, że okrągły otwór o powierzchni 1 cm2 jest całkowicie dociśnięty do skóry. Wykonaj co najmniej trzy oddzielne pomiary w różnych obszarach skóry grzbietowej.</li>
	<li>Oblicz średnią wartość L* ± SD dla każdego zwierzęcia oraz dla każdej grupy badawczej. Kolorymetria refleksyjna może być przeprowadzana na dowolnym etapie eksperymentu.</li>
</ol>
5. Określanie wrażliwości na promieniowanie UV poprzez obliczenie „minimalnej dawki rumieniotwórczej” (MED)
<ol>
	<li>Użyć zwierząt, które zostały uprzednio poddane działaniu nośnika lub forskoliny, zgodnie z powyższym opisem. Znieczulić zwierzęta poprzez dostrzyczynowe wstrzyknięcie standardowej mieszaniny ketaminy i ksylazyny (patrz wyżej).</li>
	<li>Przygotować fragment taśmy blokującej promieniowanie UV do testów MED. Aby wykonać otwory w taśmie, należy użyć wzmocnionego dziurkacza z okrągłym wycięciem o powierzchni 1 cm2 (Rysunki 2A i B). Otwory o określonej wielkości i symetrycznym rozmieszczeniu w taśmie ułatwiają rozpoznawanie zmian skórnych po napromieniowaniu. Nad każdym otworem w taśmie należy nakleić mały, ale łatwo odczepialny kawałek taśmy, który można usunąć w określonych momentach podczas ekspozycji na UV, aby umożliwić podanie różnych dawek UV.</li>
	<li>Po odpowiednim uspokojeniu zwierząt, nałożyć taśmę na powierzchnię grzbietową. Podczas znieczulenia należy zawsze stosować środek nawilżający do oczu.</li>
	<li>Włączyć źródło UV składające się z dwóch lamp Westinghouse F15T8UV-B z szczytową emisją przy 313 nm i zakresem 280-370 nm. Pozostawić lampę do czasu ustabilizowania stałej mocy wyjściowej UV, mierzonej fotometrem UV z czujnikiem UVB (rozgrzanie się lamp zazwyczaj zajmuje kilka minut).</li>
	<li>Na podstawie szybkości transmisji UV zmierzonej fotometrem UV obliczyć czas ekspozycji na UV dla każdej pożądanej dawki. Na przykład, moc wyjściowa UVB naszej lampy wynosi 2,4 mW/cm2. Zatem, aby podać dawkę 5 kJ/m2, skóra musiałaby być wystawiona na promieniowanie UVB przez 208 s (co stanowi 3 min i 28 s), zgodnie z obliczeniami poniżej: 
	<img alt="Równania konwersji energii; formuła obliczania sekund przy użyciu kilodżuli, metrów, watów i konwersji cm." fo:src="/files/ftp_upload/50670/50670eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50670/50670eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Umieścić znieczulone zwierzęta (każde z nałożoną taśmą blokującą) stroną brzuszną do dołu, aby zapewnić równomierną ekspozycję na UV. Aby podać wybrane dawki promieniowania UV, należy sekwencyjnie usuwać małe taśmy blokujące zakrywające otwory, odsłaniając obszary skóry o powierzchni 1 cm2 na odpowiednie dawki promieniowania. Korzystając z powyższego przykładu, jeśli 40 kJ/m2 jest największą dawką w eksperymencie, zwierzę przebywałoby pod lampą łącznie przez 27 min i 47 s, a skóra w warunkach 40 kJ/m2 nie byłaby przykryta taśmą przez cały ten czas. Natomiast taśma przykrywająca obszar dla dawki 5 kJ/m2 powinna zostać usunięta, gdy do końca ekspozycji pozostanie 208 s. Moment usuwania taśm należy zaplanować tak, aby każda z warunków zakończyła się jednocześnie.</li>
	<li>Po ekspozycji na UV ostrożnie odkleić taśmę ze skóry grzbietowej, uważając, aby nie przerwać skóry gwałtownymi lub zbyt silnymi ruchami. Umieścić zwierzęta w ciepłym, cichym miejscu, aby umożliwić wybudzenie z narkozy.</li>
	<li>Monitorować myszy przez 24-48 h w celu wykrycia wyraźnych obszarów rumienia (zaczerwienienia) lub obrzęku w miejscach anatomicznych wystawionych na konkretną dawkę napromieniowania UV. Dokumentować znaleziska skórne fotograficznie.</li>
	<li>Wartość MED odpowiada minimalnej dawce UV, która wywołuje stan zapalny definiowany jako rumień i/lub obrzęk całego wystawionego na działanie promieniowania koła skóry. Należy pamiętać, że pigmentacja skóry może utrudniać wyznaczenie MED, jednak rumień i obrzęk zazwyczaj nadal można dokładnie ocenić, częściowo dzięki zdefiniowanemu kształtowi otworów w taśmie podczas ekspozycji na UV.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
Analizę danych między grupami myszy wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Bonferroniego (Graph Pad PRISM). Wartości p &lt;0.05 uznano za istotne statystycznie.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Korzystając ze zwierzęcego modelu człowieka o jasnej karnacji, stwierdzamy, że miejscowe stosowanie surowego ekstraktu z korzenia bogatego w forskolinę silnie przyciemnia naskórek poprzez stymulację produkcji melaniny w skórze. Melanizacja naskórka zależy od ekspresji czynnika komórek macierzystych w naskórku podstawnym, co ma miejsce w skórze ludzkiej, ale nie w genetycznie niezmodyfikowanej skórze myszy. Skóra grzbietowa niezmodyfikowanych genetycznie myszy nie ma wystarczającej liczby melanocytów międzypęcherzykowych,...

Częstość występowania czerniaka, najbardziej śmiertelnej formy raka skóry, dramatycznie wzrosła w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat w Stanach Zjednoczonych, szczególnie wśród osób o jasnej karnacji. Silne dowody molekularne i epidemiologiczne wskazują, że promieniowanie UV jest głównym czynnikiem sprawczym środowiskowym 2-5. Zwiększona ekspozycja na promieniowanie UV w postaci ekspozycji na słońce i korzystania z solarium może być odpowiedzialna za znaczny wzrost zachorowalności na czerniaka 6-7. Ryzyko czerniaka wydaje się być szczególnie związane z oparzeniami słonecznymi 8, zwłaszcza tymi we wczesnym okresie życia 9-10. Ryzyko oparzeń słonecznych jest związane nie tylko z dawką i intensywnością ekspozycji na promieniowanie UV, ale także z dziedzicznymi czynnikami wpływającymi na reakcję skóry na promieniowanie UV. Pigmentacja skóry jest jednym z najważniejszych czynników wpływających na wrażliwość na promieniowanie UV, ryzyko oparzeń słonecznych i ryzyko zachorowania na raka. Czerniak występuje około dwadzieścia razy częściej u osób o jasnej karnacji w porównaniu z osobami o ciemnej karnacji w wieku 11-13 lat.
	Melanina, pigment wytwarzany przez melanocyty w naskórku, jest głównym wyznacznikiem cery. Melanina występuje w dwóch głównych odmianach: (1) eumelanina, ciemnobrązowy/pigment skutecznie pochłaniający energię promieniowania UV oraz (2) feomelanina, czerwonawy/blond pigment mniej skuteczny w zapobieganiu przenikaniu fotonów UV do skóry. Kolor skóry, wrażliwość na promieniowanie UV i ryzyko czerniaka są w dużej mierze determinowane przez zawartość eumelaniny w naskórku 14-15. Im więcej eumelaniny w naskórku, tym mniej fotonów UV może wniknąć w skórę. Ze względu na niski wrodzony poziom eumelaniny, osoby o jasnej karnacji są znacznie bardziej podatne na ostre i przewlekłe skutki promieniowania UV 16-18.	
	Pigmentacja skóry, ryzyko czerniaka i zdolność do "opalania" po ekspozycji na promieniowanie UV korelują ze zdolnością sygnalizacyjną receptora melanokortyny 1 (Mc1r), sprzężonego z Gs siedmioma transbłonowymi receptorami powierzchniowymi na melanocytach 19-22. Kiedy Mc1r wiąże swój pokrewny ligand o wysokim powinowactwie, hormon stymulujący α-melanocyty (α-MSH), następuje aktywacja cyklazy adenylowej i produkcja drugiego przekaźnika cAMP 23. Normalna reakcja fizjologiczna skóry po ekspozycji na promieniowanie UV obejmuje naskórkowe wytwarzanie α-MSH przez keratynocyty 24-29. My i inni stawiamy hipotezę, że α-MSH pochodzący z keratynocytów wiąże się z Mc1r na melanocytach naskórka, inicjując dalszą produkcję drugiego przekaźnika cAMP poprzez aktywację cyklazy adenylowej 30. Poziomy cAMP kontrolują wiele aspektów różnicowania melanocytów, w tym szlaki przeżycia, naprawę DNA i syntezę pigmentu. Sygnalizacja Mc1r i cAMP wyraźnie indukują poziom enzymów pigmentowych i produkcję eumelaniny. Gdy sygnalizacja Mc1r jest nienaruszona, a poziom melanocytarnego cAMP jest solidny, wytwarzana jest eumelanina, a skóra ciemnieje. Jeśli jednak sygnalizacja Mc1r jest uszkodzona, a poziomy cAMP w cytoplazmie pozostają niskie, zamiast tego wytwarzana jest feomelanina 1. Synteza eumelaniny może być stymulowana farmakologicznie przez środki podnoszące poziom cAMP 1,14,31-35.	
	Ponieważ białko Mc1r jest głównym regulatorem ryzyka czerniaka u ludzi 36-46, jesteśmy zainteresowani mechanizmami, dzięki którym Mc1r chroni melanocyty przed kancerogenezą wywołaną promieniowaniem UV. Jako podstawę naszych badań wygenerowaliśmy transgeniczny mysi model wariantu Mc1r na czystym tle genetycznym C57BL/6 1. W tym modelu czynnik komórek macierzystych (Scf) ulega konstytutywnej ekspresji w naskórku podstawnym, a melanocyty międzypęcherzykowe naskórka są zatrzymywane w skórze przez całe życie 47, w przeciwieństwie do myszy nietransgenicznych, u których melanocyty lokalizują się w skórze właściwej w mieszkach włosowych. Po włączeniu transgenu K14-Scf naskórek staje się pigmentowany szczególnymi pigmentami melaniny charakterystycznymi dla szczepu pigmentowego zwierzęcia 1. Myszy K14-Scf na tle genetycznym C57BL / 6 z sygnalizacją MC1r typu dzikiego mają kruczoczarną skórę charakteryzującą się bardzo wysokim poziomem pigmentu eumelaniny. Nic dziwnego, że zwierzęta te są bardzo odporne na promieniowanie UV. W przeciwieństwie do tego, genetycznie dopasowane zwierzęta K14-Scf C57BL/6, które są nosicielami zmutowanego nieaktywnego Mc1r, prawie nie mają eumelaniny w naskórku. Zamiast tego te zwierzęta "przedłużające" (Mc1re / e) mają jasną karnację skóry spowodowaną odkładaniem się pigmentu feomelaniny (ryc. 1A) i są znacznie bardziej wrażliwe na promieniowanie UV 48-49.	
	<>jove_contentWykazano, że związki farmakologiczne o właściwościach chemicznych umożliwiających przenikanie do skóry silnie indukują eumelaninę w modelu zwierzęcym K14-Scf przedłużającym (Mc1re/e) poprzez bezpośrednie manipulowanie poziomem cAMP w melanocytach naskórka w skórze. Regulacja w górę melaniny w tym modelu została zgłoszona przez aktywację cyklazy adenylowej 1, a także hamowanie fosfodiesterazy 4 35. W tym artykule pokazujemy przygotowanie i miejscowe stosowanie forskoliny w rozszerzeniu (Mc1re/e) K14-Scf zwierząt, które modelują człowieka o jasnej karnacji wrażliwego na promieniowanie UV. Wykazaliśmy, że stosowanie leku dwa razy dziennie sprzyja przyspieszonej melanizacji, że ciemnienie skóry jest spowodowane naskórkowym odkładaniem się pigmentu melaniny i że indukowana melanina naskórka chroni przed oparzeniami słonecznymi wywołanymi promieniowaniem UV poprzez pomiar "minimalnej dawki rumieniowej" (MED) 48.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>Coleus Forskoli ekstrakt 20%</td><td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>nie dotyczy</td><td>Princeton, NJ</td></tr><tr><td>Isothesia, Isofluran , USP</td><td>Butler Schein</td><td>NCD 11695-6776-1</td><td>Dublin, OH, USA</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Anazyna do wstrzykiwań</td><td>LA04612</td><td>Shenandoah, Iowa, USA</td></tr><tr><td>Ketamina HCl, USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>St. Joseph, MO, USA</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>Glikol propylenowy</td><td>Adesco</td><td>05751L</td><td>Solon, OH, Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Krem do depilacji, Nair</td><td>Church Dwight</td><td>JF-11 4381322</td><td>Priceton, NJ</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Bakteriobójcza lampa Hg UV-B</td><td>Westinghouse</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>Radiometr fotometr</td><td>Światło międzynarodowe</td><td>1LT400A</td><td>Peabody, MA, Stany Zjednoczone</td></tr><tr><td>Chromametr</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr><tr><td>Procesor danych dla chromametru CR-400</td><td>Konica Monilta</td><td>DR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr></tbody></table>

farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Czystość skóry, wrażliwość na promieniowanie UV i ryzyko raka skóry korelują z fizjologiczną funkcją receptora melanokortyny 1, białka sygnalizacyjnego sprzężonego z GS znajdującego się na powierzchni melanocytów. Mc1r stymuluje cyklazę adenylową i produkcję cAMP, co z kolei zwiększa produkcję melaniny w melanocytach w skórze. W celu zbadania mechanizmów, za pomocą których sygnalizacja Mc1r chroni skórę przed uszkodzeniem UV, badanie to opiera się na modelu mysim z "humanizowaną skórą" opartą na naskórkowej ekspresji czynnika komórek macierzystych (Scf). Transgeniczne myszy K14-Scf zatrzymują melanocyty w naskórku, a zatem mają zdolność odkładania melaniny w naskórku. W tym modelu zwierzęcym status MC1r typu dzikiego skutkuje silnym osadzaniem się czarnego pigmentu eumelaniny i fenotypem chronionym przed promieniowaniem UV. Natomiast zwierzęta K14-Scf z wadliwą zdolnością sygnalizacyjną Mc1r wykazują czerwono-blond pigmentację, bardzo mało eumelaniny w skórze i fenotyp wrażliwy na promieniowanie UV. Rozumując, że odkładanie się eumelaniny może być wzmocnione przez środki miejscowe, które naśladują sygnalizację Mc1r, stwierdziliśmy, że bezpośrednie zastosowanie ekstraktu z forskoliny na skórę myszy o jasnej karnacji z wadami Mc1r spowodowało silną indukcję eumelaniny i ochronę przed promieniowaniem UV 1. Tutaj opisujemy metodę przygotowania i stosowania naturalnego ekstraktu z korzenia zawierającego forskolinę u myszy o jasnej karnacji K14-Scf i przedstawiamy metodę pomiaru wrażliwości na promieniowanie UV poprzez określenie minimalnej dawki rumieniowej (MED). Korzystając z tego modelu zwierzęcego, można zbadać, w jaki sposób indukcja cAMP naskórka i melanizacja skóry wpływają na reakcje fizjologiczne na ekspozycję na promieniowanie UV.

Myszy C57BL/6 z genem K14-Scf uzyskano na tłach eumelanistycznych, feomelanistycznych lub amelanistycznych, zgodnie z opisem (Rysunek 1A). Kohorty myszy o jasnej skórze (rozszerzenie Mc1re/e, Tyr+/+) poddawano miejscowemu leczeniu, stosując dwukrotne dawki dobowe nośnika (70% etanol, 30% glikolu propylenowego) lub 40% surowego ekstraktu z korzenia Coleus forskohlii (80 μM na dawkę) przez 5 dni (Rysunek 2B). Wpływ leczenia miejscowego na pigmentację...

Melanina naskórkowa jest indukowana przez miejscowe stosowanie forskoliny w mysim modelu człowieka o jasnej karnacji, wrażliwego na promieniowanie UV. Farmakologiczna manipulacja poziomami cAMP w skórze i ciemnienie naskórka silnie chronią przed stanem zapalnym o podłożu UV (oparzenia słoneczne), mierzonym za pomocą testu minimalnej dawki rumieniowej (MED).

Farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest pomiar wrażliwości na promieniowanie UV poprzez określenie minimalnej dawki rumieniowej u myszy o jasnej skórze poddanych wstępnemu traktowaniu czterema preparatami skórnymi. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie skóry grzbietowej myszy do naświetlania poprzez strzyżenie i ablację. Następnie na skórę grzbietową nanosi się miejscowo preparaty z forskoliną.Następnie myszy poddano działaniu różnych dawek promieniowania UV, aby określić wpływ ekstraktu z melona na zapalenie wywołane przez UV. Uzyskane wyniki wykazują, że miejscowe zastosowanie forline znacząco zwiększa pigmentację skóry, a zwierzęta z farmakologicznie zwiększoną ilością melaniny są odporne na UV, co określono za pomocą MED. Są to badania typu proof of concept, które wykazują, że możliwe jest farmakologiczne wywołanie opalenizny u osobnika niezdolnego do opalania z powodu defektu w bardzo ważnym genie melanocytów zwanym receptorem melanokortyny 1 lub MC1R. W populacjach ludzkich utrata funkcji MC1R koreluje z nadwrażliwością na UV, skłonnością do poparzeń słonecznych oraz niezdolnością do opalania, a w późniejszym życiu z nawet czterokrotnie wyższym ryzykiem czerniaka.W badaniach tych wybraliśmy scullinę 4 jako lek, ponieważ jest ona w stanie ominąć wadliwą ścieżkę sygnalizacyjną receptora melanokortyny i oszukać melanocyty, sugerując, że posiadają one sprawną ścieżkę sygnalizacyjną mc1R, co prowadzi do produkcji dużej ilości melaniny, która odkłada się w skórze i chroni zwierzęta przed promieniowaniem UV. Choć wiemy, że metoda ta dostarcza wiedzy na temat skóry, która może ulec przebarwieniu, może być ona również istotna w profilaktyce nowotworowej.Ponieważ wiadomo, że promieniowanie UV jest głównym kancerogenem w przypadku zdecydowanej większości nowotworów skóry, a zwiększenie stosowania ochrony skóry zapobiega uszkodzeniom wywołanym przez UV, należy wykonać iniekcje dosytroniczne. Należy pamiętać o aspiracji po wprowadzeniu igły i przed wstrzyknięciem zawartości, aby upewnić się, że igła nie przebiła naczynia krwionośnego, jelit ani pęcherza moczowego. Iniekcje IP powinny być podawane po prawej stronie, aby uniknąć narządów. Po przygotowaniu ekstraktu z forline i krótkim znieczuleniu myszy izofluranem.Zgodnie z protokołem tekstowym dotyczącym inhalacji, należy podać zwierzęciu dodatkowe znieczulenie poprzez wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny drogą IP. Wykonać uszczypnięcie palca, aby zweryfikować stopień sedacji. Do wystrzyżenia futra z grzbietu użyć strzyżarki elektrycznej wyposażonej w chirurgijną końcówkę przygotowawczą o rozmiarze 0,25 mm.Użyj kremu do depilacji, aby usunąć zarost. Następnie, aby uniknąć oparzeń lub innego uszkodzenia skóry, natychmiast użyj nasączonych wodą gazików, aby delikatnie przetrzeć skórę grzbietową, aż do całkowitego usunięcia kremu. Użyj miękkich ręczników papierowych, aby osuszyć zwierzę przed umieszczeniem go w czystej klatce na podkładce grzewczej w celu rekonwalescencji.Generalnie myszy należy krótko znieczulić, aby ułatwić miejscowe podanie forskoliny lub roztworów kontrolnych, stosując izofluran drogą wziewną pod dygestorium. Należy rozpocząć od przygotowania ręcznika papierowego nasączonego izofluranem w przykrytym, przezroczystym szklanym słoiku, również nasączonym izofluranem. Po zamocowaniu dopasowanego, przepuszczalnego dla powietrza filtra nylonowego, należy znieczulić mysz, kładąc ją na filtrze na czas wystarczający do zahamowania ruchów mięśniowych, a następnie umieścić uspokojone zwierzę na czystym, chłonnym podkładzie laboratoryjnym.Po wykonaniu ucisku palca nanieś 400 µL surowego ekstraktu z forlin na grzbiet zwierzęcia, kapiąc go na skórę. Następnie, używając boku końcówki, rozetrzyj ekstrakt po całej powierzchni odsłoniętej skóry grzbietowej. Włóż mysz z powrotem do klatki i uważnie obserwuj ją aż do wybudzenia z narkozy, aby zapobiec niepożądanym skutkom.Wpływ cyklicznego AMP na zakłócenie eksperymentów dotyczących wrażliwości na UV. Przerwać wszystkie zabiegi miejscowe dwa dni przed ekspozycją na UV w celu przeprowadzenia kolorymetrii refleksyjnej. Po krótkim znieczuleniu myszy poprzez inhalację izofluranem.Zkalibruj kolorymetr, umieszczając przenośną głowicę na dostarczonej z urządzeniem wzorcowej białej powierzchni. Przyłóż przenośną głowicę pomiarową płasko do skóry grzbietowej zwierzęcia, upewniając się, że okrągły otwór o powierzchni jednego centymetra kwadratowego jest całkowicie dociśnięty do skóry. Wykonaj co najmniej trzy oddzielne pomiary w różnych obszarach skóry grzbietowej.Oblicz średnią wartość wskaźnika L wraz z odchyleniem standardowym dla każdego zwierzęcia i grupy terapeutycznej. W celu wyznaczenia minimalnej dawki rumieniotwórczej (MED), każde zwierzę zostanie poddane działaniu różnych dawek UV. Rozpocznij od przygotowania kawałka taśmy okluzyjnej do UV, używając wzmocnionego dziurkacza z wycięciem okrągłym o powierzchni jednego centymetra kwadratowego do wykonania otworów w taśmie nad każdym punktem.W przypadku taśmy: naklej mały, ale łatwo odczepialny kawałek taśmy, który można będzie usunąć. W celu naświetlania promieniami UV, umieść taśmę na powierzchni grzbietowej znieczurzonej myszy.Jeśli oczy zwierzęcia są otwarte, należy zastosować sztuczne łzy, aby zapobiec uszkodzeniom wynikającym z wysychania i ekspozycji na promieniowanie UV. Włącz źródło UV składające się z dwóch lamp UVB o szczytowej emisji 313 nanometrów i zakresie od 280 do 370 nanometrów. Pozostaw jagnię do czasu ustabilizowania się stałej emisji UV, a następnie użyj fotometru UV z czujnikiem UVB, aby zweryfikować emisję; na podstawie zmierzonej przez fotometr szybkości transmisji UV oblicz czas ekspozycji na UV dla każdej pożądanej dawki.Na przykład, jeśli moc wyjściowa lampy UVB wynosi 2,4 mW/cm², to w celu podania dawki 5 kJ/m² skóra musi być eksponowana na promieniowanie UVB przez 208 s, zgodnie z obliczeniami przedstawionymi tutaj. Następnie uśpione zwierzę należy ułożyć powierzchnią brzuszną do dołu, aby zapewnić równomierną ekspozycję na promieniowanie UV podczas sekwencyjnego podawania wybranej dawki.W odpowiednim momencie usuń małe kawałki taśmy zakrywające otwory. Na przykład, jeśli największa dawka wynosi 40 kJ/m², mysz powinna przebywać pod lampą przez 27 minut i 47 sekund, a otwór dla tej dawki należy odsłonić od samego początku. Natomiast w przypadku warunku 5 kJ/m², taśmę należy usunąć, gdy pozostało 208 sekund ekspozycji.Po upływie czasu ekspozycji na promieniowanie UV należy ostrożnie usunąć taśmę i umieścić zwierzęta w ciepłym, cichym miejscu, aby mogły dojść do siebie po znieczuleniu przed powrotem do klatek. Minimalna dawka rumieniowa, czyli wartość MED, odpowiada minimalnej dawce UV wywołującej stan zapalny, definiowany jako rumień i/lub obrzęk całego wystawionego na działanie promieniowania okręgu skóry. Myszy należy obserwować przez 24 do 48 godzin w celu wykrycia dyskretnych obszarów rumienia lub obrzęku w miejscach poddanych działaniu UV.Czasami pozostałości pierwszego zarostu utrudniają interpretację testów MED, maskując podstawowy rumień lub obrzęk skóry; zwilżenie skóry 70% etanolem znacznie ułatwia jej ocenę. Wszystkie zmiany skórne należy udokumentować fotograficznie, a następnie przekazać myszy z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt. W tych eksperymentach wykorzystano myszy C57BL/6 na tle genetycznym anodic, zawierającym transgen czynnika stymulującego komórki macierzyste K14, co pozwala myszom zachować melanocyty w naskórku, a w konsekwencji odkładać melaninę.W przedstawionym tutaj naskórku grupy myszy z rozszerzonymi obszarami jasnej skóry były leczone miejscowo przez pięć dni, przyjmując dwa razy dziennie dawki nośnika lub 40% surowego ekstraktu z korzenia colus fors coly. Wpływ leczenia miejscowego na pigmentację naskórka określono zarówno poprzez ocenę wizualną, jak i obrazowanie koloru refleksyjnego. Zastosowanie ekstraktu z korzenia wiązało się z silnym ściemnieniem naskórka w tle transgenicznym K 14 SCF, ale nie u genetycznie dopasowanych zwierząt nietransgenicznych, co sugeruje, że obecność międzyfolikularnych melanocytów naskórka jest niezbędna do odłożenia indukowanej farmakologicznie melaniny.W naskórku, mimo że ekstrakt z korzenia ma głęboki kolor ze względu na obecność fitochemikaliów roślinnych poza czterema galinami, ciemnienie skóry nie może wynikać wyłącznie z efektu barwiącego leku. Ponieważ zwierzęta nietransgeniczne nie wykazują ciemnienia skóry po dwukrotnym dziennym stosowaniu miejscowym ekstraktu z korzenia, jak wykazano w niniejszym opracowaniu, efekty działania forskoliny na melaninę zauważono już po dwóch dniach. Choć maksymalne ściemnienie było widoczne po kilku kolejnych dniach, co przedstawiono na tej rycinie za pomocą font mason oraz barwienia melaniną przekrojów skóry grzbietowej.Stopień melanizacji jest zależny od dawki; zwierzęta, którym podawano forskin raz dziennie przez 15 dni lub dwa razy dziennie przez pięć dni, wykazały podobny stopień ciemnienia skóry. Ponadto w żadnej z grup badawczych nie zaobserwowano wyraźnych efektów toksycznych po ekspozycji na forskin. W związku z tym wyciągnięto wniosek, że przyspieszone leczenie trwające pięć dni stymulowało bezpieczną melanizację skóry grzbietowej równie skutecznie, co standardowa terapia raz dziennie.Rysunek ten pokazuje, że zgodnie z pomiarami testu MED, indukowana przez forgalin ochrona naskórka zapewniła głęboką ochronę przed promieniowaniem UV, podczas gdy średnia wartość MED dla myszy z nadekspresją K14 SCF, leczonych dwukrotnie dziennie przez pięć dni nośnikiem, wynosiła 5,0 ± 0,0 kJ/m². Średnia wartość MED dla grup leczonych miejscowo forgalinem była wyższa niż 30,0 ± 0,0 kJ/m². W rzeczywistości dawka 30,0 kJ/m² była niewystarczająca do wywołania rumienia. W tym eksperymencie, przy zastosowaniu standardowego dawkowania forgalinu, średnia wartość MED dla leczonych myszy z nadekspresją K14 SCF wynosiła 50,0 ± 7,1 kJ/m².Co istotne, wstępne opracowanie forskoliną nie wpłynęło na MED zwierząt niezdolnych do produkcji melaniny, zarówno z powodu braku epidermanych melanocytów zależnych od K 14 SCF, jak i z powodu niedoboru tyrozynazy. Ponieważ aplikacje forskoliny przerwano na dwa dni przed ekspozycją na UV i nie kontynuowano ich po ekspozycji, wyciągamy wniosek, że niepigmentacyjne efekty cAMP nie odegrały roli w wynikach MED. Zamiast tego dane sugerują, że epidermana melanina była mechanizmem, dzięki któremu forskolina indukowała ochronę przed UV w tym modelu.Po opanowaniu, technika ta umożliwia łatwą i powtarzalną ocenę odpowiedzi pigmentacyjnej skóry oraz wrażliwości na promieniowanie ultrafioletowe. W modelu zwierzęcym aplikacja preparatu zajmuje tylko kilka minut dziennie, a większość czasu eksperymentalnego poświęca się na naświetlanie UV i wyznaczanie MED. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że skóra stopniowo powraca do swojej bazowej, jasnej karnacji.Indukcja melaniny jest bardzo podobna do reakcji na naznaczanie, w tym sensie, że skóra pozostaje ciemna tak długo, jak długo jest stymulowana, lecz następnie opalenizna znika ze skóry w ciągu kolejnych kilku tygodni po usunięciu bodźca.

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Farmakologiczne indukowanie melaniny naskórkowej i ochrona przed oparzeniem słonecznym w zhumanizowanym modelu myszym

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Ten film opisuje procedurę wywoływania dwuetapowej kancerogenezy skóry w celu zbadania inicjacji guza poprzez miejscowe stosowanie chemikaliów. W pierwszym etapie na skórę modelu mysiego nakłada się mutagen, DMBA, który inicjuje powstawanie nowotworu poprzez powodowanie mutacji w komórkach macierzystych, a następnie stosuje się stymulator wzrostu, TPA, który przyspiesza powstawanie brodawczaka skóry.

Indukowany chemicznie dwuetapowy model kancerogenezy skóry: eksperymentalny mysi model raka skóry in vivo

Ten film opisuje metodę pomiaru wrażliwości na promieniowanie UV w humanizowanym modelu myszy - modelu myszy, który naśladuje ludzką skórę. Określamy minimalną dawkę rumieniową (MED) promieniowania UV, które może powodować rumień lub obrzęk skóry. Metoda może pomóc w ustaleniu skuteczności leków stosowanych w celu zmniejszenia wrażliwości na promieniowanie UV.

Test minimalnej dawki rumieniowej: metoda pomiaru wrażliwości na promieniowanie UV w modelach mysich

Opisujemy trzy eksperymentalne metody oceny hipopigmentacyjnej aktywności substancji chemicznych in vitro: kwantyfikacja 1) komórkowej aktywności tyrozynazy i 2) zawartości melaniny, oraz 3) pomiar melaniny za pomocą barwienia melaniny komórkowej i analizy obrazu.

Kwantyfikacja aktywności hipopigmentacyjnej in vitro

Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Dwuetapowa kancerogeneza skóry jest indukowana przez dwie miejscowo stosowane substancje chemiczne. Mutagen 7,12-dimetylobenzantracen) powoduje mutacje w komórkach naskórka, a ciągłe stosowanie ogólnego stymulatora wzrostu octanu 12-O-tetradekanoiloforbol-13 przyspiesza powstawanie brodawczaków skóry.

Model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie z wykorzystaniem dimetylobenz[a]antracenu i octanu 12-O-tetradekanoilu forbolu-13 (DMBA-TPA)

Celem tego protokołu jest wywołanie przejściowej produkcji in vivo nieśmiertelnych poziomów reaktywnych form tlenu (ROS) w skórze myszy, co dodatkowo promuje reakcje fizjologiczne w tkance.

Stymulacja nisz komórek macierzystych i regeneracji tkanek w skórze myszy za pomocą przełączanej fotogeneracji reaktywnych form tlenu in situ zależnej od protoporfiryny IX

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Protokół opisuje badanie ogólnoustrojowych i miejscowych skutków skórnych ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe B u myszy.

Badanie przewlekłej ekspozycji myszy na promieniowanie ultrafioletowe B

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Zstandaryzowany protokół indukowania przedwczesnego starzenia się w HNM z użyciem tBHP, zstandaryzowane protokoły do analizy kluczowych markerów starzenia się, w tym zatrzymania wzrostu, aktywności SA-β-galaktozydazy i czynników SASP.

Znormalizowany protokół wywoływania starzenia się przedwczesnego wywołanego stresem w pierwotnych ludzkich melanocytach z użyciem hydronadtlenku tert-butylu

Poznaj metodę indukcji melaniny w skórze myszy za pomocą forskoliny w celu ochrony przed promieniowaniem UV. Badanie pokazuje, że farmakologicznie wzmocniona pigmentacja zwiększa odporność na uszkodzenia słoneczne.

Farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy

Przeglądaj więcej filmów