Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ogólnym celem tej procedury jest określenie zakresu aktywacji stanu zapalnego komórek śródbłonka mikronaczyniowego poprzez ilościowe określenie względnej liczby neutrofili, które przylegają do komórek śródbłonka in vitro w warunkach statycznych. Osiąga się to poprzez traktowanie najpierw zdrowych, zlewających się monowarstw komórek śródbłonka mikronaczyniowego pożądanym bodźcem eksperymentalnym w drugim etapie. Neutrofile od zdrowych ochotników są izolowane, a następnie znakowane wapniem.

Następnie znakowane neutrofile dodaje się do komórek śródbłonka i pozostawia do przylegania przez 20 minut, w tym czasie uzyskuje się pomiar przed płukaniem za pomocą geometrii spektrometrii fluorescencji. W ostatnim etapie nieprzylegające neutrofile są wypłukiwane, po czym uzyskuje się pomiar po praniu. Ostatecznie można określić procent i względne przyleganie neutrofili znakowanych wapniem do monowarstw komórek śródbłonka w każdych warunkach leczenia.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii stanów zapalnych człowieka, ponieważ może określić względny zakres aktywacji stanu zapalnego śródbłonka mikronaczyniowego w różnych warunkach. Ponadto test ten może być potencjalnie wykorzystany jako narzędzie do badania procesów chorobowych opartych na śródbłonku człowieka, które obejmują wiązanie leukocytów ze śródbłonkiem mikronaczyniowym W dniu testu. Użyj mikroskopii z kontrastem fazowym, aby potwierdzić, że komórki wykazują zdrowy wygląd kostki brukowej z niewielkimi resztkami komórek i że są w 100% zlewne.

Gdy monowarstwy HM VEC są gotowe do leczenia, przemyj komórki raz HBSS, a następnie dodaj 0,3 mililitra świeżej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka mikronaczyniowego z agonistą stanu zapalnego lub bez niego do odpowiednich studzienek. Tutaj płuca HM VEC są leczone TNF alfa przez trzy godziny w celu wyizolowania neutrofili Używając najpierw przygotowania polimorficznego, doprowadź roztwór gradientu gęstości do temperatury pokojowej. Następnie, po pobraniu 30 mililitrów krwi pełnej od zdrowego ochotnika w obecności warstwy antykoagulantu, pięć mililitrów krwi na pięć mililitrów preparatu Polymorph w 15-mililitrowej stożkowej probówce.

Oddziel krew pełną przez 30 minut w temperaturze 450 razy G i od 18 do 22 stopni Celsjusza z odłamaniem, upewniając się, że probówki są dobrze wyważone. Następnie odessać żółtą plazmę i warstwy zawierające PBMC, aby zapobiec zanieczyszczeniu nieprzezroczystej różowej warstwy neutrofili. Aby usunąć neutrofile, należy odessać warstwę neutrofili za pomocą pipety serologicznej o pojemności od jednego do dwóch mililitrów, powoli obracając pipetę i rurkę.

Wyciągnij neutrofile z wielu probówek do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 30 mililitrów PBS wolnego od wapnia i magnezu. Zwiększ objętość do 50 mililitrów z większą ilością PBS bez wapnia i magnezu. Po odwirowaniu komórek odessać snat, a następnie zreusować.

Zawieś neutrofile w ośmiu mililitrach sterylnej wody, aby po 30 sekundach wprowadzić z czerwonych krwinek. Szybko dodaj osiem mililitrów zawiesiny komórkowej do dwóch mililitrów pięciokrotnie wolnego od wapnia i magnezu PBS, a następnie delikatnie wymieszaj. Po odwirowaniu komórek, ponownie, umyj komórki raz w PBS wolnym od wapnia i magnezu, a następnie ponownie zawieś osad w 10 mililitrach RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej i policz żywe komórki przez wykluczenie błękitu trianowego.

Po zliczeniu przenieś zawieszone komórki do 50-mililitrowej stożkowej rurki i rozcieńcz neutrofile z dwoma do 4 milionami komórek na mililitr za pomocą RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej. Następnie dodaj do komórek świeżo przygotowany roztwór roboczy wapnia o stężeniu trzech mikromolów. Wymieszaj zawiesinę komórkową, delikatnie odwracając probówkę kilka razy, a następnie inkubuj probówkę pokrytą folią w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 30 minutach odwirować oznakowane neutrofile, a następnie dwukrotnie umyć osad w 10 mililitrach 37 stopni Celsjusza. RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej, przepuszczając zawiesinę komórek przez sterylny filtr o wielkości 40 mikronów w celu usunięcia wszelkich grudek przed drugim odwirowaniem. Ponownie zawiesić neutrofile w 10 mililitrach 37 stopni Celsjusza.

Bez czerwieni fenolowej RP MI 1640. A następnie po ponownym policzeniu komórek rozcieńcz je do 2 milionów komórek na mililitr. Teraz umyj monowarstwy HM vec trzykrotnie 0,5 mililitra filtra 0,22 mikrona, wysterylizuj RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej zawierającej 3% BSA na studzienkę po trzecim płukaniu, odessać pożywkę i dodać 600 000 neutrofili znakowanych wapniem w 0,3 mililitra zawiesiny komórkowej lub 0,3 mililitra wolnego od czerwieni fenolowej RPMI 1640 bez neutrofili do odpowiednich studzienek płytki 48-dołkowej, a następnie inkubować kultury CO przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, a następnie tuż przed końcem okresu inkubacji zmierzyć intensywność fluorescencji każdej studzienki w spektrofotometrze przy długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i długości fali emisji 520 nanometrów.

Następnie odwróć płytkę, aby usunąć nośnik i delikatnie wyściełaj ręczniki papierowe, aby usunąć pozostały płyn. Umyj studzienki zawierające monowarstwy hm ve i neutrofile pięciokrotnie po 0,5 milimetra na każdą studzienkę PBS z wapniem i magnezem. Usuwanie PBS za każdym razem w ten sam sposób.

Odśwież studzienki za pomocą 0,3 mililitra wolnego od czerwieni fenolowej RPMI 1640 na studzienkę, a następnie zmierz intensywność fluorescencji każdej studzienki, jak właśnie pokazano. Wreszcie, korzystając z tych wzorów, określ procentową adherencję i względną adherencję na studzienkę w celu uzyskania wiarygodnych, powtarzalnych wyników za pomocą testu wiązania neutrofili, ważne jest, aby zdrowie i płynność mikronaczyniowa komórek śródbłonka były optymalne w dniu testu. Zwróć uwagę na wygląd kostki brukowej i całkowitą fluencję monowarstw na spektrofotometrze Optima Fluor star.

Na przykład zauważ, że fluorescencja OD 520 nanometrów mieści się w zakresie liniowym, gdy analizowanych jest od 10 000 do 1 miliona znakowanych neutrofili. Co ciekawe, im więcej neutrofili jest dodawanych do monowarstw płuc HM VEC leczonych agonistą stanu zapalnego, procentowe przyleganie wzrasta. Wcześniej wykazano, że kinaza mapy P 38 jest niezbędna do ekspresji selektyny e.

W TNF ludzkie komórki śródbłonka traktowane alfa i jego hamowanie zmniejsza liczbę przylegających neutrofili, aby wykazać, że liczba neutrofili dodawanych do studzienek jest dowolna, o ile liczba użytych komórek mieści się w liniowym zakresie spektrofotometru. Tutaj pokazano test adhezji neutrofili z komórkami płuc HM VEC traktowanymi TN F alfa przy braku lub obecności inhibitora kinazy P 38 map B IRB 7 96. Wyniki te pokazują, że względny spadek wiązania neutrofili po zahamowaniu mapk P 38 jest podobny.

Niezależnie od liczby neutrofili w studzince, lektyna ulega ekspresji na powierzchni komórki śródbłonka po potraktowaniu TNF alfa i wychwytuje neutrofile z układu krwionośnego poprzez oddziaływania elektrostatyczne z cząsteczkami glikofilu obecnymi na powierzchni neutrofili. Jak pokazano na tym wykresie, wstępna inkubacja komórek śródbłonka aktywowanych TNF alfa z przeciwciałem przeciwko selektynie E powoduje około 75% zmniejszenie ich zdolności do wiązania neutrofili. Wykazanie, że test ten przede wszystkim ocenia bardzo początkowe zdarzenia kaskady adhezji neutrofili na tych obrazach, neutrofile znakowane wapniem związane z monowarstwami płuc HM VEC nieleczonymi i TN ffat wstępnie inkubowanymi z kontrolną selektyną IgG lub E.

Przeciwciała poliklonalne są pokazane, obrazy z mikroskopii światła półprzezroczystego są pokazane w tej kolumnie, podczas gdy obrazy fluorescencyjne o tym samym polu odniesienia przy użyciu zestawu filtrów fluoresceinowych znajdują się tutaj w tych studzienkach. Reprezentatywne obrazy całkowitej fluorescencji neutrofili przed myciem PBS, jak właśnie wykazano, są pokazane w tych studzienkach. Pokazano reprezentatywne obrazy przylegającej fluorescencji neutrofili po przemyciu PBS, jak właśnie pokazano.

Należy zauważyć, że wzrost przestrzegania zaleceń lekarskich po leczeniu TN FFA, który zmniejsza się w obecności przeciwciała poliklonalnego selektyny. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby użyć zdrowych komórek śródbłonka o niskiej liczbie pasaży oraz użyć krwi pełnej i wyizolowanych neutrofili w ciągu dwóch godzin od pobrania.