Name: Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj ilościowy test adhezji neutrofili do aktywowanych komórek śródbłonka mikronaczyniowego człowieka w warunkach statycznych. Ta metoda fluorescencyjna pozwala mierzyć aktywację zapalną in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Wydział Anestezjologii i Opieki Okołooperacyjnej UCSF.

1. Poszycie i utrzymanie mikronaczyniowych komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Rozmrozić i wyhodować komórki śródbłonka mikronaczyniowego zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. W tym protokole komórki hodowano w pożywce EGM-2 MV (Lonza) i zaleca się, aby wszystkie eksperymenty były wykonywane w ciągu dwóch tygodni od rozmrożenia, aby zminimalizować wszelkie zmiany spowodowane liczbą pasaży. Nasze eksperymenty z HMVEC-Lung są przeprowadzane między przejściami od 4 do 9.</li>
	<li>Dzień 1: Gdy komórki osiągną 80-90% zbieżności, trypsynizuj i ponownie zawieś w 120 000 komórek na ml. Umieść 36 000 komórek (0,3 ml) na studzience na 48-dołkowej płytce (płytkach) do hodowli tkanki polistyrenowej. Uwzględnij studzienki HMVEC, które nie będą inkubowane z neutrofilami, w celu uzyskania odczytu fluorescencji tła. O ile nie używa się 48-dołkowych płytek specjalnie zaprojektowanych do testów fluorescencyjnych, naprzemienne rzędy lub kolumny zminimalizują wszelkie zanieczyszczenie światłem z sąsiednich studzienek. UWAGA: Studzienki mogą być wstępnie pokryte polilizyną, kolagenem lub fibronektyną.</li>
	<li>Dzień 2: Dodaj świeże nośniki.</li>
	<li>Dzień 3: Za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego potwierdź, że komórki są zdrowe (tj. wygląd "bruku" i małe resztki komórek) i są w 100% zlewające się (ryc. 1). Jeśli komórki nie są w 100% zlewające się, zmieniaj podłoże codziennie, aż będą gotowe.</li>
	<li>Gdy monowarstwy HMVEC są gotowe do leczenia, przemyj komórki raz zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) i dodaj 0,3 ml świeżej pożywki EGM-2 MV lub pożywki zawierającej agonistę stanu zapalnego do odpowiednich studzienek. W tym protokole HMVEC-Lung były leczone TNFα (100 ng / ml) (PeproTech, New Jersey) przez 3 godziny, ponieważ jest to dobrze opisany aktywator EC 21. UWAGA: Zaleca się zaplanowanie eksperymentu tak, aby aktywowane komórki HMVEC (Krok 4.1) i neutrofile znakowane kalceiną AM (Krok 3.5) były gotowe do użycia w tym samym czasie. Wyizolowanie i znakowanie neutrofili zajmuje nam około 2,5 godziny.</li>
</ol>
2. Izolacja neutrofili za pomocą Polymorphprep
<ol>
	<li>Wyizolować neutrofile, jak opisano wcześniej, 22 lub za pomocą gotowego roztworu gradientu gęstości, aby wyizolować granulocyty wielojądrzaste z krwi pełnej. Zastosowanie Polymorphprep zgodnie z protokołem Nuzzi i wsp. 2007 daje wydajność około 2-3 x 106 neutrofili na ml krwi pełnej 23. UWAGA: Aby uniknąć nadmiernej lizy erytrocytów, przed wirowaniem w gradiacji gęstości można przeprowadzić sedymentację dekstranu w celu usunięcia czerwonych krwinek 24.</li>
	<li>Przenieś rozwiązanie gradientu gęstości Polymorphprep do RT.</li>
	<li>Zbierz 30 ml pełnej krwi od zdrowego ochotnika w obecności antykoagulantu, takiego jak heparyna, cytrynian lub EDTA. Krew należy zużyć w ciągu 2 godzin i przechowywać w temperaturze 18-22 °C.</li>
	<li>Umieścić 5 ml krwi pełnej na 5 ml roztworu gradientu gęstości w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (ryc. 2A). Należy unikać zmiany objętości krwi i roztworu gradientu gęstości, ponieważ może to zmienić warunki późniejszego wirowania.</li>
	<li>Wirować przy 450 x g przez 30 minut w temperaturze 18-22 °C. Upewnij się, że powoli przyspieszasz wirówkę w górę i w dół (tj. wyłącz hamulec wirówki) i dobrze wyważ probówki, aby zapobiec wibracjom, aby zmniejszyć aktywację neutrofili i zapobiec mieszaniu się warstw. Dłuższy czas wirowania lub większa siła odśrodkowa spowodują, że dolna warstwa leukocytów, która zawiera neutrofile, będzie migrować dalej w dół w kierunku granulowanych czerwonych krwinek.</li>
	<li>Odessać osocze i górne pasmo leukocytów zawierające PBMC, aby zapobiec zanieczyszczeniu warstwy zawierającej neutrofile (Figura 2B).</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 1-2 ml usunąć dolną warstwę leukocytów zawierającą neutrofile. Połączyć warstwy neutrofili w 30 ml PBS (bez Ca2+ i Mg2+) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Doprowadzić objętość do 50 ml za pomocą PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i odwirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 18-22 °C.</li>
</ol>
Uwaga: Kroki 2.9 i 2.10 są opcjonalne, ale wysoce zalecane.
<ol start="9">
	<li>Odessać supernatant. Zawiesić neutrofile w 8 ml sterylnej wody na 30 sekund w celu lizy czerwonych krwinek, natychmiast dodać zawiesinę komórkową do 2 ml 5x PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i delikatnie wymieszać ręcznie. NIE INKUBUJ komórek w wodzie dłużej niż 30 sekund, ponieważ może dojść do znacznej śmierci neutrofili</li>.
	<li>Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 18-22 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki raz 10 ml PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i ponownie odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 18-22 °C.</li>
	<li>Zawiesić neutrofile w 10 ml RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej) i policzyć żywe komórki metodą wykluczania barwnika błękitu trypanowego. Należy unikać długotrwałych okresów zagęszczenia komórek większego niż 5 x 106 na ml, ponieważ może to spowodować aktywację neutrofili.</li>
</ol>
3. Znakowanie neutrofili za pomocą Calcein AM
<ol>
	<li>6 x 105 neutrofili stosuje się na dołek 48-dołkowej płytki.</li>
	<li>Po zliczeniu przenieś zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńcz neutrofile do 2-4 x 106 komórek na ml za pomocą RPMI-1640 wolnego od czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Dodać roztwór podstawowy kalceiny AM do 3 μM (tj. 2,98 μl bulionu kalceiny AM (1 mg/ml) na ml pożywki) i dobrze wymieszać, delikatnie przesuwając probówkę. Większa niż 5 μM kalceiny AM spowoduje wyciek z neutrofili. nuta: Niefluorescencyjna kalceina AM jest rozszczepiana w komórkach przez endogenne esterazy w celu wytworzenia wysoce fluorescencyjnej cząsteczki kalceiny (tj. martwe komórki nie będą fluoryzować).</li>
	<li>Przykryć probówkę folią aluminiową i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. nuta: Dłuższy czas inkubacji może spowodować uwolnienie większej ilości kalceiny z neutrofili w trakcie testu adhezji.</li>
	<li>Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 18-22 °C i przemyć neutrofile 2x 10 ml RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej; wstępnie podgrzane do 37 °C). Po ponownym zawieszeniu komórek do drugiego płukania, najpierw przepuść neutrofile przez sterylny filtr 40 μM w celu usunięcia grudek, a następnie ponownie odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 18-22 °C.</li>
	<li>Zawiesić neutrofile w RPMI 1640 (bez czerwieni fenolowej; wstępnie podgrzane do 37 °C) przy stężeniu 2 x 106 neutrofili na ml.</li>
</ol>
4. Test wiązania neutrofili
<ol>
	<li>Umyj monowarstwy HMVEC 3x 0,5 ml sterylizowanego filtrem (0,22 μm) RPMI 1640 (bez czerwieni fenolowej) zawierającego 3% BSA na studzienkę.</li>
	<li>Odessać pożywkę i dodać 6 x 105 neutrofili znakowanych kalceiną (0,3 ml zawiesiny komórek) lub 0,3 ml RPMI 1640 (bez czerwieni fenolowej) bez neutrofili do odpowiednich dołków płytki 48-dołkowej. nuta: Jest to odpowiednik 8 x 105 neutrofili nacm2.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Całkowita fluorescencja neutrofili (płukanie PRE): Zmierzyć intensywność fluorescencji każdej studzienki o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 520 nm (zestaw filtrów fluoresceinowych) w spektrofotometrze FLUOstar lub równoważnym. Wykonaj ten krok tuż przed punktem końcowym inkubacji. nuta: W tym protokole wzbudzenie kalceiny i detekcja emitowanego światła przeprowadzono z góry odkrytych studni; Jednak oba można również wykonać z dna studni.</li>
	<li>Przemyć studzienki zawierające monowarstwy HMVEC i neutrofile 5x 0,5 ml na studzienkę PBS (z Ca2+ i Mg2+). Wyjmij media i płyny, odwracając talerz i delikatnie wklepując w ręczniki papierowe, aby usunąć pozostały płyn.</li>
	<li>Dodać z powrotem 0,3 ml RPMI 1640 (bez czerwieni fenolowej) do dołka.</li>
	<li>Przylegająca fluorescencja neutrofili (PO myciu): Zmierz intensywność fluorescencji każdego studzienki, jak w kroku 4.4.</li>
	<li>Określ procentową adherencję i względną adherencję na studzienkę:</li>
</ol>
Uwaga: Na tym etapie, obrazy neutrofili znakowanych kalceiną można uzyskać za pomocą mikroskopu zdolnego do fluorescencji, wyposażonego w standardowe filtry fluoresceinowe. Obrazy na rysunku 4 uzyskano za pomocą mikroskopu odwróconego Olympus IX51 wyposażonego w kamerę Retiga 2000R (Q Imaging) przy użyciu oprogramowania Q-Capture Pro7 (Q Imaging).

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Collins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+endothelial+cell+adhesion+molecules%3A+NF-kappa+B+and+cytokine-inducible+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Middleton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+and+surface+presentation+of+IL-8+by+venular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells.</a> Cell. 91, 385-395 (1997).</li>
<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+binding+of+NAP-1%2FIL-8%3A+role+in+neutrophil+emigration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration.</a> Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).</li>
<li>Detmers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-activating+protein+1%2Finterleukin+8+stimulates+the+binding+activity+of+the+leukocyte+adhesion+receptor+CD11b%2FCD18+on+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils.</a> J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).</li>
<li>Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+integrin+activation+by+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte integrin activation by chemokines.</a> Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).</li>
<li>Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+tethering+on+E-selectin+activates+beta+2+integrin+binding+to+ICAM-1+through+a+mitogen-activated+protein+kinase+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway.</a> J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+neutrophil+interaction+with+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).</li>
<li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte transendothelial migration.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330, 362-366 (2010).</li>
<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li>
<li>Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+neutrophil-mediated+monocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment.</a> Blood. 114, 4613-4623 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+endothelial+TLR2+by+bacterial+lipoprotein+upregulates+proteins+specific+for+the+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response.</a> Innate Immun. 18, 602-616 (2012).</li>
<li>Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labelling+Technologies%22">The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies</a>. , 10, (2005).</li>
<li>Shin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipoprotein+TLR2+agonists+broadly+modulate+endothelial+function+and+coagulation+pathways+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK5+protein+promotes%2C+whereas+MEK1+protein+differentially+regulates%2C+the+Toll-like+receptor+2+protein-dependent+activation+of+human+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes.</a> J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).</li>
<li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745(2008).</li>
<li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+to+detect+nuclear+factor+activation+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (74), e50410(2013).</li>
<li>Kuma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIRB796+inhibits+all+p38+MAPK+isoforms+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).</li>
<li>Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+production+and+E-selectin+expression+in+activated+endothelial+cells+are+inhibited+by+p38+MAPK+%28mitogen+activated+protein+kinase%29+inhibitor+RWJ+67657%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657.</a> International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).</li>
<li>Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+polymorphonuclear+cells+to+human+endothelial+cells.+Adhesion-molecule-dependent%2C+and+Fc+receptor-mediated+adhesion-molecule-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms.</a> Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).</li>
<li>Akeson, A. L., Woods, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorometric+assay+for+the+quantitation+of+cell+adherence+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells.</a> Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).</li>
<li>De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+dyes+in+the+determination+of+adherence+of+human+leucocytes+to+endothelial+cells+and+the+effect+of+fluorochromes+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function.</a> Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).</li>
<li>Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+acts+on+cultured+human+vascular+endothelium+to+increase+the+adhesion+of+polymorphonuclear+leukocytes%2C+monocytes%2C+and+related+leukocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines.</a> The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).</li>
<li>Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+vascular+endothelial+cells+acquire+adhesiveness+for+neutrophils+after+stimulation+with+interleukin+1%2C+endotoxin%2C+and+tumor-promoting+phorbol+diesters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters.</a> J. Immunol. 136, 649-654 (1986).</li>
<li>Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+adherence+of+neutrophils+to+umbilical+vein+endothelium+by+human+recombinant+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).</li>
<li>Braut-Boucher, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-isotopic%2C+highly+sensitive%2C+fluorimetric%2C+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).</li>
<li>Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelium%3A+physiological+functions+and+role+in+microcirculatory+failure+during+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).</li>
<li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+Toll-like+receptor-4+is+the+key+molecule+in+LPS-induced+neutrophil+sequestration+into+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+endothelial+cell+platelet-activating+factor+production+and+inflammatory+cell+adherence+are+increased+in+response+to+cigarette+smoke+component+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).</li>
<li>Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathogenic+roles+of+microvasculature+in+inflammatory+bowel+disease%3A+a+Jack+of+all+trades%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).</li>
<li>Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Wegener%26%2339%3Bs+granulomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+de+Medecine+Interne%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Wegener&#39;s granulomatosis.</a> Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+inflammatory+cell+involvement+in+brain+arteriovenous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations.</a> Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).</li>
<li>Martens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+which+bind+to+E-selectin+and+block+neutrophil+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.</a> J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszymi etapami udanego testu adhezji neutrofili / mikronaczyń śródbłonka są: 1) Użycie niskiej liczby pasażów (<9), zdrowych komórek śródbłonka; 2) Utrzymanie wyizolowanych neutrofili w niskiej gęstości (tj. <5 x 106 komórek/ml) i wykorzystanie ich w ciągu dwóch godzin od izolacji; oraz 3) Skrupulatne mycie neutrofili znakowanych kalceiną AM i stosowanie neutrofili znakowanych kalceiną AM w odpowiednim czasie, aby zminimalizować odpowiednio zanieczyszczenie EC i utratę kalceiny z neutrofili.<...

Ponieważ śródbłonek naczyniowy jest w bezpośrednim kontakcie z krążącą krwią, jest wyjątkowo usytuowany do inicjowania szybkiej reakcji zapalnej podczas infekcji lub urazu. Komórki śródbłonka (EC) wyrażają receptory rozpoznawania wzorców, które rozpoznają różne konserwatywne składniki bakteryjne i cząsteczki niebezpieczne, a także receptory dla mediatorów stanu zapalnego gospodarza, takich jak TNFα. Aktywacja tych receptorów indukuje EC do wydzielania cytokin (np. IL-6, IL-8, CXCL1 i CCL2) oraz do zwiększania poziomu cząsteczek adhezyjnych (np. E/P-selektyny, VCAM-1 i ICAM-1) na powierzchni komórki 1,2. Wszystkie te cząsteczki ułatwiają lokalizację leukocytów w miejscach infekcji i urazów w celu usunięcia gospodarza z czynników zakaźnych i zainicjowania naprawy tkanek 3,4. Odpowiedź neutrofili na zakażenie obejmuje dobrze skoordynowaną interakcję między śródbłonkiem naczyniowym a reagującymi neutrofilami. Po aktywacji EC IL-8 jest wydzielana i tworzy wewnątrznaczyniowy gradient na śródbłonku, który umożliwia neutrofilom dotarcie do miejsca infekcji lub urazu 5,6. Selektyny E / P pośredniczą w wychwytywaniu neutrofili i przetaczaniu się przez stosunkowo słabe powiązania z glikocząsteczkami na powierzchni komórki neutrofilowej. Interakcje te, wraz z wiązaniem IL-8 z pokrewnymi receptorami, ułatwiają silne, pośredniczące integryny przyłączanie i ostateczne zatrzymanie neutrofili na powierzchni komórki śródbłonka 7-10. Po zatrzymaniu neutrofile mogą migrować z układu krwionośnego do określonych miejsc infekcji, aby bezpośrednio wyeliminować patogeny, wytworzyć zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się patogenów, przyspieszyć gojenie się ran i uwolnić dodatkowe czynniki, które rekrutują inne leukocyty, takie jak monocyty, makrofagi i komórki dendrytyczne 11-17.
Opisana w tym raporcie jest metoda in vitro do ilościowego oznaczania przylegania neutrofili do mikronaczyniowych EC po aktywacji przez mediator stanu zapalnego gospodarza TNFα. Ten test ma na celu ocenę aktywacji EC, a nie neutrofili. Pierwotne ludzkie neutrofile są najpierw izolowane za pomocą separacji w gradimencie gęstości, a następnie znakowane acetoksymetylem kalceiny (AM). Esterazy w żywych komórkach hydrolizują kalceinę AM do wysoce fluorescencyjnej cząsteczki kalceiny o wzbudzeniu 492-495 nm i emisji 513-516 nm 18. Neutrofile znakowane fluorescencyjnie są następnie inkubowane z monowarstwami EC, a następnie usuwane są neutrofile, które nie przylegają. Fluorescencja pozostałych, związanych neutrofili jest następnie mierzona za pomocą spektrofotometru fluorescencji i obliczana jako procent całkowitej fluorescencji neutrofili na studzienkę. Metoda ta ma dodatkową zaletę, że związane neutrofile znakowane kalceiną stosowane w spektrofotometrii mogą być bezpośrednio wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby uzyskać bardziej jakościowy odczyt aktywacji EC. Ponieważ test ten jest wykonywany w warunkach statycznych, oceniane będą tylko bardzo początkowe zdarzenia, które występują w kaskadzie adhezji neutrofili. Zostało to potwierdzone w niniejszym raporcie, w którym zastosowano przeciwciała blokujące selektynę E, aby pokazać, że przyleganie neutrofili do monowarstw mikronaczyniowych EC płuc (HMVEC-Lung) leczonych TNFα jest drastycznie zmniejszone, gdy interakcja z selektyną E jest zakłócona.
Oprócz TNFα, z powodzeniem użyliśmy tego testu do określenia zakresu aktywacji EC ludzkiej żyły pępowinowej (HUVEC) przez agonistów receptora Toll-like 1/2 związanych z peptydoglikanem lipoprotein (PAL), lipoproteiny mureiny (MLP) i Pam3Cys oraz aktywacji HMVEC-Lung przez Pam3Cys 19,20. Ponadto z powodzeniem zastosowaliśmy ten test z inhibitorami kinaz i po nokaucie białek powierzchniowych i cytoplazmatycznych za pośrednictwem RNAi w HMVEC-Lung, co sugeruje, że ta metodologia jest zgodna z różnymi testami biochemicznymi i przesiewowymi 20. Podsumowując, test ten zapewnia łatwy w użyciu, powtarzalny i bardziej funkcjonalny sposób uzyskania dostępu do zakresu aktywacji EC przez mediatory stanu zapalnego in vitro.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>Można zastąpić dowolnym dostawcą</td></tr><tr><td>48-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (bez czerwieni fenolowej)</td> <td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL001</td><td>Można zastąpić dowolnym dostawcą</td></tr><tr><td>D-PBS (bez Ca2+ i Mg2+ i czerwieni fenolowej)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003</td><td>Można zastąpić dowolnym dostawcą</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (bez czerwieni fenolowej)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>kalceina AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099</td> <td>(0,995 mM) kolba soln</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M filtry</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Można zastąpić dowolnym dostawcą</td></tr><tr><td>Spektrofotometr FLUOstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH-</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Śródbłonek naczyniowy odgrywa integralną rolę w reakcji zapalnej. Podczas ostrej fazy zapalenia komórki śródbłonka (EC) są aktywowane przez mediatory gospodarza lub bezpośrednio przez konserwatywne składniki mikrobiologiczne lub cząsteczki niebezpieczeństwa pochodzące od gospodarza. Aktywowane EC wyrażają cytokiny, chemokiny i cząsteczki adhezyjne, które mobilizują, aktywują i zatrzymują leukocyty w miejscu infekcji lub urazu. Neutrofile są pierwszymi leukocytami, które docierają i przylegają do śródbłonka poprzez różne cząsteczki adhezyjne obecne na powierzchni obu komórek. Główne funkcje neutrofili to bezpośrednie eliminowanie zagrożeń mikrobiologicznych, wspomaganie rekrutacji innych leukocytów poprzez uwalnianie dodatkowych czynników oraz inicjowanie gojenia się ran. Dlatego ich rekrutacja i przywiązanie do śródbłonka jest krytycznym krokiem w inicjacji odpowiedzi zapalnej. W niniejszym raporcie opisujemy test adhezji neutrofili in vitro przy użyciu pierwotnych ludzkich neutrofili znakowanych kalceiną AM w celu ilościowego określenia zakresu aktywacji komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych. Metoda ta ma tę dodatkową zaletę, że te same próbki oznaczone ilościowo za pomocą spektrofotometrii fluorescencyjnej mogą być również wizualizowane bezpośrednio za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu bardziej jakościowej oceny wiązania neutrofili.

Aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne wyniki w teście wiązania neutrofili, niezbędne jest, aby stan zdrowia i stopień konfluencji mikro naczyniowych komórek śródbłonka były optymalne w dniu przeprowadzania analizy, co zilustrowano na przykładzie HMVEC-Lung na Rysunku 1. Ponadto konieczne jest stosowanie mikro naczyniowych komórek śródbłonka o niskim numerze pasażu (t.j. poniżej 9 pasażu), w związku z czym zalecamy przeprowadzanie wszystkich eksperymentów w ciągu dwóch tygodni od rozmrożenia. Kluc...

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie stopnia zapalnej aktywacji komórek śródbłonka mikrokrążenia poprzez ilościowe oznaczenie względnej liczby neutrofili przylegających do komórek śródbłonka in vitro w warunkach statycznych. Jest to realizowane poprzez uprzednie poddanie zdrowych, konfluencyjnych monowarstw komórek śródbłonka mikrokrążenia odpowiednim bodźcem eksperymentalnym w drugim kroku. Neutrofile od zdrowych ochotników są izolowane, a następnie znakowane kalcyum am.Następnie znakowane neutrofile dodaje się do komórek śródbłonka i pozostawia do adhezji na 20 minut, podczas których za pomocą spektrogeometrii fluorescencyjnej wykonuje się pomiar przed przemyciem. W ostatnim kroku nieprzyległe neutrofile zostają wypłukane, po czym wykonuje się pomiar po przemyciu. Ostatecznie można określić procentową i względną adhezję znakowanych wapniem neutrofili do monowarstw komórek śródbłonka dla każdego z warunków traktowania.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii stanów zapalnych u ludzi, ponieważ pozwala określić względny zakres aktywacji zapalnej śródbłonka mikro naczyniowego w różnych warunkach. Ponadto test ten ma potencjał, aby służyć jako narzędzie do badania procesów chorobowych śródbłonka u ludzi, w których zachodzi wiązanie leukocytów z śródbłonkiem mikro naczyniowym. W dniu przeprowadzenia testu należy wykorzystać mikroskopię kontrastową, aby potwierdzić, że komórki wykazują zdrowy wygląd przypominający brukowaną nawierzchnię, z niewielką ilością debris komórkowych oraz że osiągnęły 100% konfluencji.Gdy monowarstwy HM VEC będą gotowe do opracowania, wypłucz komórki raz za pomocą HBSS, a następnie dodaj do odpowiednich studzienek 0,3 mililitra świeżej pożywki do wzrostu mikro naczyniowych komórek śródbłonka z agonistą stanu zapalnego lub bez niego. W tym przypadku HM VEC płuc są traktowane TNF alpha przez trzy godziny w celu izolacji neutrofili. Korzystając z Polymorph prep, doprowadź najpierw roztwór gradientu gęstości do temperatury pokojowej. Następnie, po pobraniu 30 mililitrów krwi pełnej od zdrowego ochotnika w obecności antykoagulanta, nanieś warstwą pięć mililitrów krwi na pięć mililitrów Polymorph prep w 15-mililitrowej probówce stożkowej.Odwirować krew pełną przez 30 minut przy 450 ×g i temperaturze od 18 do 22 °C z wyłączoną funkcją hamowania, upewniając się, że probówki są odpowiednio zbilansowane. Następnie pobrać żółtą plazmę oraz warstwę zawierającą PBMC, aby zapobiec zanieczyszczeniu nieprzezroczystej różowej warstwy neutrofili. W celu usunięcia neutrofili, pobrać warstwę neutrofili za pomocą pipety serologicznej o pojemności od 1 do 2 ml, powoli obracając pipetą oraz probówką.Przenieś neutrofile z wielu probówek do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml PBS pozbawionego wapnia i magnezu. Uzupełnij objętość do 50 ml, dodając więcej PBS pozbawionego wapnia i magnezu. Po odwirowaniu komórek odessaj nadsącz, a następnie resuspenduj.Zawieś neutrofile w ośmiu mililitrach sterylnej wody, aby zlizować erytrocyty, po 30 sekundach. Szybko dodaj osiem mililitrów zawiesiny komórkowej do dwóch mililitrów 5x PBS pozbawionego wapnia i magnezu, a następnie delikatnie wymieszaj. Po ponownym odwirowaniu komórki, przemyj je raz w PBS pozbawionym wapnia i magnezu, a następnie zawieś osad w 10 mililitrach pożywki RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej i policz żywe komórki metodą wykluczania błękitu trypanu.Po przeliczeniu przenieść resuspenderowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńczyć neutrofile do stężenia od 2 do 4 milionów komórek na ml za pomocą pożywki RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej. Następnie dodać do komórek świeżo przygotowany roztwór roboczy wapnia do uzyskania stężenia 3 µM. Wymieszać zawiesinę komórkową, delikatnie odwracając probówkę kilka razy, a następnie inkubować probówkę osłoniętą folią w temperaturze 37 °C.Po 30 minutach odwiruj oznakowane neutrofile, a następnie dwukrotnie przemyj osad w 10 mililitrach RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej w temperaturze 37 °C, przepuszczając zawiesinę komórkową przez sterylny filtr o rozmiarze 40 µm w celu usunięcia grudek przed drugą centryfugacją. Resuspenduj neutrofile w 10 mililitrach w temperaturze 37 °C.RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej. Następnie po ponownym przeliczeniu komórek, rozcieńczyć je do stężenia 2 milionów komórek na mililitr. Teraz przemyć monowarstwy HM vec trzy razy 0,5 mililitrami sterylizowanego przez filtr 0,22 mikrona RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej zawierającego 3% BSA na dołek; po trzecim przemyciu odpisać pożywkę i dodać 600 000 znakowanych wapniem neutrofili w 0,3 mililitrach zawiesiny komórkowej lub 0,3 mililitrów RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej bez neutrofili do odpowiednich dołków płytki 48-dołkowej. Następnie inkubować kokultury przez 20 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, a tuż przed zakończeniem okresu inkubacji zmierzyć intensywność fluorescencji w każdym dołku za pomocą spektrofotometru przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 520 nm.Następnie odwróć płytkę, aby usunąć medium, i delikatnie osusz ją ręcznikami papierowymi, aby usunąć pozostałą ciecz. Przemyj studnie zawierające monowarstwy hm ve i neutrofile pięć razy, używając 0,5 ml na studnię PBS z wapniem i magnezem. Za każdym razem usuwaj PBS w ten sam sposób.Odśwież studzienki, dodając 0,3 ml RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej do każdej studzienki, a następnie zmierz intensywność fluorescencji każdej studzienki w sposób przedstawiony powyżej. Na koniec, korzystając z tych wzorów, wyznacz procent adhezji oraz względną adhezję na studzienkę. Aby uzyskać wiarygodne i powtarzalne wyniki w teście wiązania neutrofili, niezbędne jest, aby stan zdrowotny i konfluencja mikro naczyniowych komórek śródbłonka były optymalne w dniu przeprowadzenia testu. Zwróć uwagę na brukowany wygląd oraz całkowitą konfluencję monowarstw na spektrofotometrze Fluor star Optima.Na przykład należy zauważyć, że gęstość optyczna (OD) fluorescencji przy 520 nanometrach mieści się w zakresie liniowym podczas analizy od 10 000 do 1 miliona znakowanych neutrofilów. Co ciekawe, wraz z dodaniem większej liczby neutrofilów do monowarstw HM VEC płuc traktowanych agonistą zapalnym, procent przylegania wzrasta. Wcześniej wykazano, że kinaza p38 MAPK jest niezbędna do ekspresji selektyny E.W ludzkich komórkach śródbłonka traktowanych TNF alfa oraz po jego inhibicji liczba adherentnych neutrofili ulega zmniejszeniu, co wykazuje, że liczba neutrofili dodawanych do dołków jest dowolna, o ile liczba wykorzystanych komórek mieści się w zakresie liniowym spektrofotometru. Tutaj przedstawiono test adhezji neutrofili z wykorzystaniem komórek płucnych HM VEC traktowanych TNF alfa w obecności lub przy braku inhibitora kinazy MAPK P38, BIRB 796. Wyniki te pokazują, że względny spadek wiązania neutrofili po inhibicji MAPK P38 jest podobny.Niezależnie od liczby neutrofili w dołku, lektyna jest ekspresowana na powierzchni komórek śródbłonka po traktowaniu TNF alpha i wychwytuje neutrofile z naczyń krwionośnych poprzez oddziaływania elektrostatyczne z glikomolekułami obecnymi na powierzchni neutrofili. Jak pokazano na tym wykresie, preinkubacja aktywowanych TNF alpha komórek śródbłonka przeciwciałem przeciwko E-selektynie skutkuje około 75% redukcją ich zdolności do wiązania neutrofili. Aby wykazać, że test ten ocenia przede wszystkim najwcześniejsze zdarzenia kaskady adhezji neutrofili, na tych obrazach przedstawiono znakowane wapniem neutrofile związane z nietraktowanymi i traktowanymi TNF alpha monowarstwami HM VEC płuc, które poddano preinkubacji z kontrolnym IgG lub przeciwciałem przeciwko E-selektynie.W tej kolumnie przedstawiono obrazy z mikroskopii świetlnej w polu prześwietlanym dla przeciwciał poliklonalnych, natomiast w tych studzienkach znajdują się obrazy fluorescencyjne tego samego pola odniesienia uzyskane przy użyciu zestawu filtrów fluoresceinowych. W tych studzienkach pokazano reprezentatywne obrazy całkowitej fluorescencji neutrofili przed płukaniem w PBS, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Przedstawiono również reprezentatywne obrazy fluorescencji przylegających neutrofili po płukaniu w PBS, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Należy zauważyć, że wzrost adhezji po traktowaniu TN FFA ulega zmniejszeniu w obecności poliklonalnego przeciwciała przeciwko selektynie s. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zastosowanie zdrowych komórek śródbłonka o niskim numerze pasażu oraz wykorzystanie krwi pełnej i wyizolowanych neutrofili w ciągu dwóch godzin od pobrania.

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowa in vitro metoda pomiaru przyczepności neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyń pod warunkami statycznymi

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

W tym filmie demonstrujemy test wykorzystujący mikroskopię fluorescencyjną do wykrywania adhezji komórek rakowych do pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). W studzienkach testowych obserwuje się znaczny wzrost liczby znakowanych fluorescencyjnie komórek rakowych przylegających do NET, podczas gdy studzienki potraktowane DNazą wykazują zmniejszoną adhezję komórek rakowych do NET.

Test adhezji in vitro w celu wykrycia przylegania komórek rakowych do zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych

Migracja trans-nabłonkowa neutrofili w odpowiedzi na infekcję bakteryjną błony śluzowej przyczynia się do uszkodzenia nabłonka i choroby klinicznej. Opracowano model in vitro, który łączy patogen, ludzkie neutrofile i spolaryzowane warstwy ludzkich komórek nabłonkowych hodowanych na filtrach transwell, aby ułatwić badania nad rozwikłaniem mechanizmów molekularnych kierujących tym zjawiskiem.

Metody in vitro Test kokultury w celu oceny migracji transnabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem

Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.

Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Poznaj ilościowy test adhezji neutrofili do aktywowanych komórek śródbłonka mikronaczyniowego człowieka w warunkach statycznych. Ta metoda fluorescencyjna pozwala mierzyć aktywację zapalną in vitro.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Przeglądaj więcej filmów