Name: Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Poznaj mikrofabrykację nanoporowatych wzorów złota metodą sitodruku i fotolitografii do badań interakcji komórka-materiał. Technika ta umożliwia hodowlę komórek i analizę mikroskopową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O. Kurtulus i D. Dimlioglu są wspierani przez University of California Laboratory Fees Research Program Award 12-LR-237197. P. Daggumati jest wspierany przez University of California Davis Research Investments in the Sciences & Engineering (RISE) Award. C.A. Chapman jest wspierany przez Departament Edukacji Graduate Assistance Areas of National Need Fellowship. Prace te były wspierane przez UC Lab Fees Research Program, UC Davis RISE i fundusze start-upowe UC Davis College of Engineering.

1. Produkcja nanoporowatego złota
<ol>
	<li>Czyste podłoża w roztworze Piranha
	<ol>
		<li>Dodać 25 ml nadtlenku wodoru (30%) do 100 ml kwasu siarkowego (96%) w naczyniu krystalizacyjnym i podgrzać mieszaninę do 65 °C na płycie grzejnej. UWAGA: Płyny są wyjątkowo i należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Zużytego roztworu nie należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku, ponieważ może eksplodować.</li>
		<li>Umieść szkiełka mikroskopowe o wymiarach 1 cal na 3 cale w mieszaninie za pomocą kwasoodpornych kleszczy i czyść je przez 10 minut. Użyj porcelanowej łódki do barwienia immunologicznego do czyszczenia partii małych szkiełek nakrywkowych. Małe szkiełka nakrywkowe należy traktować plazmą powietrzną o mocy 10 W przez 30 sekund przed zanurzeniem w roztworze.</li>
		<li>Oczyszczone próbki opłukać w naczyniach krystalizacyjnych pod bieżącą wodą dejonizowaną (DI) przez 3 minuty. Próbki należy suszyć suszarką pistoletem do azotu na niestrzępiących się ręcznikach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj maskę szablonu (metoda 1: Użyj tego do tworzenia wzorów w skali milimetrowej)
	<ol>
		<li>Przebić arkusze elastomeru silikonowego o grubości 250 μm za pomocą wykraplaczów biopsyjnych i/lub naciąć obszary skalpelem na półtwardej powierzchni z tworzywa sztucznego. Przetworzone arkusze elastomeru oczyścić w 70% izopropanolu i osuszyć pistoletem do azotu.</li>
		<li>Umieść dziurkowany arkusz na niestrzępiącym się ręczniku do pomieszczeń czystych i wyrównaj szkiełka nakrywkowe oczyszczone przez piranie na szablonie z powierzchnią próbki skierowaną w stronę szablonu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fotorezyst do podnoszenia wzoru (Metoda 2: Użyj tego do tworzenia wzorów w skali submilimetrowej)
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko mikroskopowe oczyszczone przez piranie na obracającym się uchwycie i zdmuchnij wszelkie cząstki za pomocą pistoletu do azotu. Dozować 1,5 ml promotora adhezji (heksametylodilazanu) na szkiełko podstawowe za pomocą plastikowej pipety. Rozłóż promotor, obracając suwak kolejno z prędkością 500 obr./min przez 5 sekund i 1 500 obr./min przez 30 sekund. Piecz szkiełko na płycie grzejnej w temperaturze 115 °C przez 7 minut i pozwól mu ostygnąć przez 5 minut.</li>
		<li>Naniej 4 ml fotorezystu na szklane szkiełko (3 cale na 1 cal). Rozprowadź fotorezyst, obracając szkiełko z tym samym protokołem, co w przypadku promotora adhezji. Piecz fotorezystor na płycie grzejnej w temperaturze 115 °C przez 1,5 minuty i pozwól mu ostygnąć przez 10 minut.</li>
		<li>Naświetlić szkiełko pokryte fotorezystem światłem UV (intensywność: 22 mW/cm2) przez przezroczystą maskę przez 15 sekund. Piecz fotorezystor na płycie grzejnej w temperaturze 115 °C przez 1,5 minuty i odczekaj 45 minut. Rozpuść naświetlony fotorezystu w wywoływaczu przez co najmniej 3,5 minut. Dokładnie spłucz wodą DI. Sprawdź opracowane wzory pod mikroskopem optycznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie metali prekursorowych w celu wytworzenia cienkich warstw np-Au
	<ol>
		<li>Załaduj próbki do maszyny do napylania, która może niezależnie osadzać złoto, srebro i chrom. Przed rozpoczęciem osadzania metalu należy napylać próbki przez 90 sekund przy 50 W w atmosferze przetwarzania argonu o temperaturze 25 mTorr.</li>
		<li>Napylanie chromu przez 10 minut przy 300 W pod 10 mTorr argon. Napylaj złoto przez 90 sekund przy 400 W pod 10 mTorr argonu. Współnapylanie złota i srebra przez 10 minut ze srebrem o mocy 200 W i mocy Au o mocy 100 W. Wyłącz źródło napylania złota na około 10 sekund przed wyłączeniem źródła napylania srebra.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskiwanie mikrowzorów metali prekursorowych
	<ol>
		<li>Sonizować próbki pokryte fotorezystem w ~180 ml środka do usuwania fotorezystu przez 10 cykli po 20 sekund sonikacji i 2-minutową przerwę między cyklami. Przepłukać próbki wodą demineralizowaną i osuszyć pistoletem do azotu. Sprawdź metalowe wzory pod mikroskopem.</li>
		<li>Oderwij szablon elastomerowy od próbek niepokrytych fotorezystem za pomocą dwóch pęset, aby odsłonić osadzony metal.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dealloy metal prekursorowy i modyfikacja nanostruktury poprzez obróbkę termiczną
	<ol>
		<li>Napełnić szklaną zlewkę o pojemności 200 ml 170 ml kwasu azotowego (70%) i utrzymywać temperaturę roztworu na płycie grzejnej na poziomie 55 °C. UWAGA: Kwas azotowy jest wyjątkowo i należy się z nim obchodzić przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.</li>
		<li>Małe szkiełka nakrywkowe należy traktować plazmą powietrzną o mocy 10 W przez 30 sekund przed zanurzeniem w kwasie azotowym. Umieść szkiełka mikroskopowe o wymiarach 1 cal na 3 cale w zlewce za pomocą kwasoodpornych kleszczy i odtapiaj je przez 15 minut. Użyj porcelanowej łódki do barwienia immunologicznego do grupowego nakładania małych szkiełek nakrywkowych.</li>
		<li>Przepłukać pobrane próbki, zanurzając je kolejno w dwóch zlewkach wypełnionych trzykrotnie świeżą wodą demineralizowaną. Przechowuj próbki w wodzie demineralizowanej i zastępuj ją świeżą wodą demineralizowaną codziennie przez co najmniej tydzień. Przed użyciem wysuszyć próbki suszarką za pomocą pistoletu do azotu na niestrzępiących się ręcznikach.</li>
		<li>Załaduj próbki na czystą płytkę krzemową w urządzeniu do szybkiej obróbki termicznej. Ustaw temperaturę w zakresie od 200 °C do 450 °C, a szybkość narastania do 10 °C/s. Wystawić próbki na działanie zalecanej temperatury przez 10 minut w otoczeniu azotu. Pozostawić komorę do ostygnięcia (<100 °C) i usunąć próbki. Alternatywnie, powoli umieść próbki na płycie grzejnej w celu obróbki termicznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek np-Au do hodowli komórkowej
	<ol>
		<li>Umieścić próbki np-Au w naczyniach polistyrenowych i poddać działaniu plazmy powietrznej o mocy 10 W przez 30 sekund, a następnie przenieść próbki na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych.</li>
		<li>Dodać 500 μl kompletnej pożywki hodowlanej (zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco z 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) do każdego dołka. Przechowywać w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu wysiewu komórek (<1 godz.).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie, przejście i nasiona komórek
	<ol>
		<li>Utrzymuj interesujące komórki (w tym przypadku fibroblasty 3T3-NIH lub mysie astrocyty) w kolbach T75 z pożywką hodowlaną i pasażem, gdy komórki są w 70% zlewne.</li>
		<li>W celu pasażowania komórek należy usunąć pożywkę z kolby, przemyć dwukrotnie 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), dodać 2 ml 1x Trypsyna / EDTA i inkubować do momentu oderwania komórek (~ 5 min). Dodać 3 ml świeżej pożywki i wirować z prędkością 1 200 obr./min przez 3 min. Odessać supernatant i zawiesić osad w pożywce o objętości 2 ml.</li>
		<li>Usunąć zużyte pożywki z dołków i umieścić komórki na szklanych szkiełkach nakrywkowych o gęstości 25 000 komórek/cm2 z końcową objętością 1 ml. Potrząśnij płytką hodowlaną do przodu i do tyłu i w prawo, aby zapewnić równomierne pokrycie komórek na próbkach. Inkubować komórki do czasu analizy, przeprowadzając codzienną kontrolę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza komórek i materiałów
<ol>
	<li>Barwienie komórek w celu wizualizacji cytoszkieletu i jąder
	<ol>
		<li>Usuń zużyte pożywki ze studzienek i umyj komórki dwukrotnie PBS. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 15 min.</li>
		<li>Przygotować roztwór barwiący 300 nM Alexa Fluor 488 falloidyny w PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS i przepuścić je w 500 μl 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS i przenieś je do czystych studzienek. Na próbki nanieść 50 - 200 μl roztworu barwiącego i przechowywać w ciemności przez 20 minut.</li>
		<li>Myć komórki PBS i barwieć przeciw barwieniu 3 nM DAPI w PBS przez 5 minut.</li>
		<li>Umyj komórki PBS i zanurz w wodzie dejonizowanej przed zamontowaniem na szkiełkach podstawowych z nośnikiem montażowym i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów próbek np-Au i kultur komórkowych na powierzchniach np-Au
	<ol>
		<li>Obrazowanie powierzchni np-Au za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) o powiększeniu 50 000X przy energii elektronów 10 kV za pomocą detektora elektronów wtórnych.</li>
		<li>Uchwyć obrazy komórek kompozytowych w różnych miejscach na próbkach za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przy 10-krotnym powiększeniu z odpowiednimi kostkami filtrującymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie obrazów w celu określenia morfologii porów i komórek
	<ol>
		<li>Otwórz obrazy w ImageJ i podziel je na poszczególne kanały, jeśli to możliwe. Przekonwertuj obrazy na 8-bitowe, odejmij tło i wygładź je przez filtrowanie mediany. Dostosuj próg ręcznie lub za pomocą wbudowanych algorytmów progowania, aby podkreślić pory (puste przestrzenie) i ciała/jądra komórkowe.</li>
		<li>Użyj polecenia zlewiska, aby rozdzielić scalone pory lub komórki. Ustaw parametry analizy cząstek i wykonaj polecenie, aby wyodrębnić liczbę cząstek, średnią powierzchnię i procentowe pokrycie cząstkami. Użyj obrazów komórek barwionych DAPI do zliczania komórek i obrazów komórek barwionych falloidyną do ilościowego określenia procentowego pokrycia komórek.</li>
		<li>Zmodyfikuj dołączone pliki makr, aby przeprowadzić analizę wsadową wielu obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Arico, A. S., Bruce, P., Scrosati, B., Tarascon, J. M., Van Schalkwijk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+materials+for+advanced+energy+conversion+and+storage+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Nanostructured materials for advanced energy conversion and storage devices.</a> Nature Materials. 4, 366-377 (2005).</li>
<li>Roy, S., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure-based+electrical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Nanostructure-based electrical biosensors.</a> Nano Today. 4, 318-334 (2009).</li>
<li>Chen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-decorated+carbon-nanotube-based+chemical+sensors+on+complementary+metal+oxide+semiconductor+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-decorated carbon-nanotube-based chemical sensors on complementary metal oxide semiconductor circuitry.</a> Nanotechnology. 21, 095504(2010).</li>
<li>Lu, J., Rao, M. P., MacDonald, N. C., Khang, D., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+endothelial+cell+adhesion+and+proliferation+on+patterned+titanium+surfaces+with+rationally+designed%2C+micrometer+to+nanometer+features%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Improved endothelial cell adhesion and proliferation on patterned titanium surfaces with rationally designed, micrometer to nanometer features.</a> Acta Biomaterialia. 4, 192-201 (2008).</li>
<li>Wagner, V., Dullaart, A., Bock, A. K., Zweck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+nanomedicine+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The emerging nanomedicine landscape.</a> Nat. Biotechnol. 24, 1211-1218 (2006).</li>
<li>Weissmüller, J., Newman, R., Jin, H., Hodge, A., Kysar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theme+Article+-+Nanoporous+Metals+by+Alloy+Corrosion%3A+Formation+and+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Research+Society+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Theme Article - Nanoporous Metals by Alloy Corrosion: Formation and Mechanical Properties.</a> Materials Research Society Bulletin. 34, 577-586 (2009).</li>
<li>Erlebacher, J., Aziz, M., Karma, A., Dimitrov, N., Sieradzki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+nanoporosity+in+dealloying%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of nanoporosity in dealloying.</a> Nature. 410, 450-453 (2001).</li>
<li>Okman, O., Lee, D., Kysar, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+crack-free+nanoporous+gold+blanket+thin+films+by+potentiostatic+dealloying%5BTitle%5D)+AND+%22Scripta+Mater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of crack-free nanoporous gold blanket thin films by potentiostatic dealloying.</a> Scripta Mater. 63, 1005-1008 (2010).</li>
<li>Seker, E., Reed, M., Begley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+Gold%3A+Fabrication%2C+Characterization%2C+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Nanoporous Gold: Fabrication, Characterization, and Applications.</a> Materials. 2, 2188-2215 (2009).</li>
<li>Biener, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+effects+on+the+mechanical+behavior+of+nanoporous+Au%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Size effects on the mechanical behavior of nanoporous Au.</a> Nano Lett. 6, 2379-2382 (2006).</li>
<li>Senior, N., Newman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+tough+nanoporous+metals+by+controlled+electrolytic+dealloying%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of tough nanoporous metals by controlled electrolytic dealloying.</a> Nanotechnology. 17, 2311-2316 (2006).</li>
<li>Zielasek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+catalysts%3A+Nanoporous+gold+foams%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Gold catalysts: Nanoporous gold foams.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 8241-8244 (2006).</li>
<li>Wittstock, A., Biener, J., Bäumer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+gold%3A+a+new+material+for+catalytic+and+sensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Nanoporous gold: a new material for catalytic and sensor applications.</a> PCCP. 12, 12919-12930 (2010).</li>
<li>Shulga, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+porous+gold+and+its+application+as+a+platform+for+immobilization+of+acetylcholine+esterase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of porous gold and its application as a platform for immobilization of acetylcholine esterase.</a> Chem. Mater. 19, 3902(2007).</li>
<li>Shulga, O., Zhou, D., Demchenko, A., Stine, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+free+prostate+specific+antigen+%28fPSA%29+on+a+nanoporous+gold+platform%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Detection of free prostate specific antigen (fPSA) on a nanoporous gold platform.</a> The Analyst. 133, 319-322 (2008).</li>
<li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fabrication+of+low-impedance+nanoporous+gold+multiple-electrode+arrays+for+neural+electrophysiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The fabrication of low-impedance nanoporous gold multiple-electrode arrays for neural electrophysiology studies.</a> Nanotechnology. 21, 125504(2010).</li>
<li>Seker, E., Berdichevsky, Y., Staley, K. J., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-Compatible+Nanoporous+Gold+Foams+as+Biomaterials+for+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-Compatible Nanoporous Gold Foams as Biomaterials for Drug Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. 1, 172-176 (2012).</li>
<li>Okman, O., Kysar, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+Nanoporous+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoporous+Gold%3A+From+an+Ancient+Technology+to+a+High-Tech+Material%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of Nanoporous Gold.</a> Nanoporous Gold: From an Ancient Technology to a High-Tech Material. 22, 69(2012).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+and+mechanical+properties+of+nanoporous+gold+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Scripta+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfabrication and mechanical properties of nanoporous gold at the nanoscale.</a> Scripta Mater. 56, 437-440 (2007).</li>
<li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+post-fabrication+annealing+on+the+mechanical+properties+of+freestanding+nanoporous+gold+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Mater%22%5BJournal%5D)">The effects of post-fabrication annealing on the mechanical properties of freestanding nanoporous gold structures.</a> Acta Mater. 55, 4593-4602 (2007).</li>
<li>Parida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+change+during+the+formation+of+nanoporous+gold+by+dealloying%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Volume change during the formation of nanoporous gold by dealloying.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 35504-35506 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Demonstrujemy dwie różne techniki mikrotworzenia warstw np-Au w celu rozszerzenia zastosowania tych folii w mikrosystemach i badaniach biologicznych. Napylanie złota i srebra jest wszechstronną metodą tworzenia wzorów np-Au, ponieważ napylanie jest kompatybilne z konwencjonalnymi procesami mikrofabrykacji, a skład i grubość stopu można łatwo kontrolować, zmieniając indywidualne moce pistoletu do napylania (odpowiednio dla złotych i srebrnych celów) oraz czas stapiania. Typowe grubości folii np-Au wahają się od 200 nm do ...

Materiały o cechach nanoskali okazały się obiecujące w ulepszaniu różnych zastosowań, w tym ogniw paliwowych1, czujników2,3 i urządzeń biomedycznych4,5. Stosunkowo nowym materiałem jest nanoporowate złoto (np-Au), które jest wytwarzane w procesie samoorganizacji w skali nano. Prekursorem np-Au jest stop złota, który najczęściej składa się ze srebra w 60% do 80% procentu atomowego. Krótko mówiąc, charakterystyczna nanostruktura o otwartych porach jest wynikiem przegrupowania atomów złota w klastry, gdy srebro jest rozpuszczone przez mocny kwas (np. kwas azotowy 70%) lub pod wpływem potencjału elektrochemicznego6-8. Np-Au korzysta z kilku pożądanych atrybutów, w tym dużej powierzchni efektywnej, wysokiej przewodności elektrycznej, dobrze ugruntowanych technik funkcjonalizacji powierzchni i biokompatybilności9. Mimo że nastąpił szybki rozwój badań nad np-Au, większość z nich koncentruje się na właściwościach mechanicznych np-Au10,11, aktywności katalitycznej12 i wydajności wykrywania biomolekularnego13-15. Podczas gdy pożądane atrybuty są bardzo przydatne w przypadku kilku narzędzi biomedycznych16,17, zastosowania w tej dziedzinie są ograniczone. Jednym z możliwych powodów takiego stanu rzeczy jest to, że w większości badań wykorzystywano głównie próbki w skali makro (np. arkusze, folie i wlewki), a techniki włączania np-Au do zminiaturyzowanych systemów pozostały niewystarczające. W rzeczywistości istnieje tylko kilka przykładów zastosowania konwencjonalnych technik mikrofabrykacji, które wykorzystują folie np-Au16-20. Wraz z pojawieniem się technologii miniaturyzacji i zapotrzebowaniem na nowatorskie narzędzia biomedyczne, kluczowa stała się możliwość integracji nowych materiałów z urządzeniami. Zazwyczaj wymaga to, aby materiały mogły być osadzane i modelowane za pomocą konwencjonalnych technik mikrofabrykacji. Ponadto szybka kwantyfikacja interakcji komórka-materiał jest powszechnie konieczna w celu oceny biokompatybilności nowego materiału. Celem tego artykułu jest zademonstrowanie podstawowych technik mikromodelowania warstw np-Au oraz ilościowe określenie zarówno nanostruktury, jak i interakcji komórka-materiał za pomocą cyfrowego przetwarzania obrazu.

<table><tbody><tr><td>Złoty cel</td><td>Lesker</td><td>EJTAUXX403A2</td><td>Prekursor stopu do produkcji np-Au</td></tr><tr><td>Tarcza Chrome</td><td>Lesker</td><td>EJTCRXX353A2</td><td>Warstwa adhezyjna</td></tr><tr><td>Srebrny cel</td><td>Lesker</td><td>EJTAGXX403A2</td><td>Prekursor stopu do produkcji np-Au</td></tr><tr><td>Łódź porcelanowa</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>Służy do przetwarzania małych próbek</td></tr><tr><td>Kwas azotowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43873</td><td>Używany w 70% do rozdzielania</td></tr><tr><td>kwasu siarkowego</td><td>J.T Baker</td><td>7664-93-9</td><td>Używany w 96% do czyszczenia piranii</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>J.T Baker</td><td>7722-84-1</td><td>Używany w 30% do czyszczenia piranii</td></tr><tr><td>Stemple do biopsji</td><td>Ted Pella</td><td>150xx</td><td>Dostępne w kilku rozmiarach</td></tr><tr><td>Arkusze elastomeru</td><td>silikonowego Rogers Corporation</td><td>HT 6240</td><td>Dostępne w kilku grubościach</td></tr><tr><td>Heksametyldisilazan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191-100ML</td><td>Używany jako promotor przyczepności do dodatniego oporu</td></tr><tr><td>Microposit MF CD26</td><td>Shipley</td><td>38490</td><td>Dodatni wywoływacz fotorezystu</td></tr><tr><td>PRS 3000</td><td>J.T Baker</td><td>JT6403-5</td> Dodatni ściągacz <td>fotorezystu</td></tr><tr><td>Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe (12 mm)</td><td>Ted Pella</td><td>26023</td><td>Używany jako podłoże do wzorów metalowych i hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe (1 x 3 cale)</td><td>Ted Pella</td><td>26007</td><td>Używany jako podłoże do wzorów metalowych</td></tr><tr><td>Taśma poliimidowa kaptonowa</td><td>VWR</td><td>82030-950</td><td>Służy do zabezpieczania elastomeru</td></tr><tr><td>Maski przezroczystości</td><td>Miasto</td><td></td> wyjściowe <td>Używany w fotolitografii <a href="http://www.outputcity.com/" target="_blank">http://www.outputcity.com/ </a></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmowego</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Służy do aktywacji powierzchni szklanych</td></tr><tr><td>Napylarka</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>LAB18</td><td>Służy do osadzania metali</td></tr></tbody></table>

mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Materiały nanostrukturalne o rozmiarach cech rzędu dziesiątek nanometrów poprawiły wydajność kilku technologii, w tym ogniw paliwowych, biosensorów, powłok urządzeń biomedycznych i narzędzi do dostarczania leków. Nanoporowate złoto (np-Au), wytwarzane w procesie samoorganizacji w nanoskali, jest stosunkowo nowym materiałem, który wykazuje dużą efektywną powierzchnię, wysoką przewodność elektryczną i aktywność katalityczną. Te właściwości sprawiły, że np-Au jest atrakcyjnym materiałem dla środowiska naukowego. Większość badań nad np-Au wykorzystuje próbki w skali makro i koncentruje się na podstawowej nauce o materiale oraz jego zastosowaniach katalitycznych i czujnikowych. Próbki w skali makro ograniczają potencjał np-Au w zminiaturyzowanych systemach, w tym urządzeniach biomedycznych. Aby rozwiązać te problemy, na początku opisujemy dwie różne metody mikromodelowania cienkich warstw np-Au na sztywnych podłożach. Pierwsza metoda wykorzystuje ręcznie produkowane maski szablonowe do tworzenia wzorów np-Au w skali milimetrowej, podczas gdy druga metoda wykorzystuje fotolitografię typu lift-off do tworzenia wzorów w skali submilimetrowej. Ponieważ cienkie warstwy np-Au są otrzymywane w procesie napylania, są one kompatybilne z konwencjonalnymi technikami mikrowytwarzania, dzięki czemu można je łatwo zintegrować z mikrosystemami. Systemy te obejmują elektrycznie adresowalne platformy biosensorów, które korzystają z wysokiej efektywnej powierzchni, przewodności elektrycznej i biokoniugacji powierzchni na bazie złota i tiolu. Opisujemy techniki hodowli komórkowej, barwienia immunologicznego i przetwarzania obrazu w celu ilościowego określenia interakcji np-Au z komórkami ssaków, co jest ważnym parametrem wydajności dla niektórych biosensorów. Oczekujemy, że przedstawione tutaj techniki pomogą w integracji np-Au w platformach o różnej długości i w licznych zastosowaniach, w tym w biosensorach, systemach magazynowania energii i katalizatorach.

Rysunek 1 przedstawia główne etapy procedury, w tym tworzenie wzorów np-Au, hodowlę komórek, ilościowe określenie nanostruktury oraz charakterystykę morfologii komórek. Szablon elastomerowy pokazany na Rysunku 2a (góra) jest wykorzystywany do tworzenia wzorów np-Au przedstawionych na poniższych zdjęciach. Rysunek 2b to zdjęcie porcelanowej łódeczki do przetwarzania seryjnego próbek. Rysunek 2c obrazuje zmianę barwy osadzonych wzorów metalicznych przed i ...

Opisujemy techniki mikrotworzenia cienkich warstw nanoporowatego złota za pomocą druku szablonowego i fotolitografii, a także metody hodowli komórek na mikrofabrykowanych wzorach. Ponadto opisano metody analizy obrazu w celu scharakteryzowania morfologii materiału i hodowanych komórek przy użyciu technik skaningowej mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej.

Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie mikrowzorów z nanoporowatego złota oraz wykazanie ich kompatybilności z hodowlą komórkową. Cel ten osiąga się poprzez wstępne stworzenie masek szablonowych lub fotolitograficznych. Drugim krokiem jest współosadzanie złota i srebra metodą rozpylania przez maski w celu uformowania wzoru stopu prekursorowego dla nanoporowatego złota.Następnie wzory ze stopu złota i srebra poddaje się odstopowaniu w kwasie azotowym w celu wytworzenia nanoporowatych powłok złota. Ostatnim krokiem jest hodowla komórek na nanoporowatych mikro-wzorach złota i ich immunobarwienie, po czym wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną i skaningową mikroskopię elektronową w połączeniu z analizą obrazu do ilościowego określenia oddziaływań między komórkami a materiałem. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami tworzenia powłok nanostrukturalnych, takimi jak nanorurki węglowe, jest fakt, że nanoporowate złoto charakteryzuje się kompatybilnością z mikrofabrykacją, wysoką efektywną powierzchnią właściwą, łatwością funkcjonalizacji w oparciu o chemię tioli, przewodnictwem elektrycznym oraz biozgodnością.Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pyt

microfabrication-nanoporous-gold-patterns-for-cell-material

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorców złota dla badań interakcji materiał-komórka

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Poniższe podejście do konfiguracji szczegółowo opisuje pułapkowanie optyczne nanocząstek dielektrycznych o niskiej mocy z wykorzystaniem podwójnego nanootworu w cienkiej warstwie metalu.

Optyczne pułapkowanie nanocząsteczek

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Pokazujemy wytwarzanie okresowych matryc nanokubków złotych za pomocą technik litograficznych koloidalnych i omawiamy znaczenie warstw nanoplazmonowych.

Wytwarzanie okresowych matryc złotych nanokubków przy użyciu litografii koloidalnej

Tutaj prezentujemy protokół dla nanolitografii sond skanujących na dużym obszarze, który jest możliwy dzięki iteracyjnemu dostosowaniu układów sond, a także wykorzystaniu wzorów litograficznych do badań interakcji komórka-powierzchnia.

Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania gradientowych płytek nanowzorcowych za pomocą termicznego nanoimprintingu oraz metodę przesiewowego wykrywania odpowiedzi ludzkich komórek progenitorowych śródbłonka na nanostruktury. Dzięki zastosowaniu opisanej technologii możliwe jest wytworzenie rusztowania, które może manipulować zachowaniem komórki za pomocą bodźców fizycznych.

Wytwarzanie gradientowego nanowzoru za pomocą techniki nanoimprintingu termicznego i badanie przesiewowe odpowiedzi komórek tworzących kolonie śródbłonka

Ten protokół szczegółowo opisuje nowatorską technikę nano-produkcji, która może być wykorzystana do tworzenia kontrolowanych i konfigurowalnych folii nanocząsteczkowych na dużych obszarach, w oparciu o samoorganizację odwilżania zasklepionych folii metalowych.

Nanowytwarzanie nanocząstek złota na dużej powierzchni w oparciu o podłoże poprzez odwilżanie

Nanoporowate złoto o hierarchicznym i bimodalnym rozkładzie wielkości porów może być wytwarzane przez połączenie procesów elektrochemicznych i chemicznych. Skład stopu może być monitorowany za pomocą badania EDS-SEM w miarę postępu procesu sortowania. Nośność materiału można określić, badając adsorpcję białek na materiale.

Wszechstronna technika tworzenia hierarchicznego projektu z nanoporowatego złota

Poznaj mikrofabrykację nanoporowatych wzorów złota metodą sitodruku i fotolitografii do badań interakcji komórka-materiał. Technika ta umożliwia hodowlę komórek i analizę mikroskopową.

Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał

Przeglądaj więcej filmów