Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie nanoporowatych mikrowzorów złota i wykazanie ich kompatybilności z hodowlą komórkową. Osiąga się to poprzez tworzenie najpierw szablonowych lub fotograficznych masek litograficznych. Drugim krokiem jest współrozpylanie złota i srebra przez maski w celu wymodelowania stopu prekursora dla nanoporowatego złota.

Następnie wzory stopów złota i srebra są stapiane w kwasie azotowym w celu wytworzenia nanoporowatych powłok złota. Ostatnim krokiem jest hodowla komórek na nanoporowatych mikrowzorcach złota i ich barwienie immunologiczne, ostatecznie fluorescencyjna i skaningowa mikroskopia elektronowa w połączeniu z analizą obrazu są wykorzystywane do ilościowego określenia interakcji materiału komórkowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami tworzenia powłok nanostrukturalnych, takich jak nanorurki węglowe, jest to, że nanoporowate złoto korzysta z kompatybilności mikrofabrykacji, wysokiej efektywnej powierzchni, łatwości funkcjonalizacji za pomocą chemii opartej na płytkach, przewodności elektrycznej i biokompatybilności.

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie materiałoznawstwa i bioinżynierii, takie jak wpływ nanostruktury materiału na właściwości elektryczne, mechaniczne, biologiczne i chemiczne. Chociaż ta metoda zapewnia wgląd w wpływ nanostruktury na morfologię komórki. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak rozwój bioczujników, systemów dostarczania leków i platform magazynowania energii.

Rozpocznij tę procedurę od oczyszczenia szkiełek mikroskopowych o wymiarach jeden cal na trzy cale i małych szkiełek nakrywkowych roztworem piranii, załaduj małe szkiełka nakrywkowe do porcelanowej łodzi do barwienia immunologicznego i zanurz łódź i szkiełko mikroskopowe w roztworze piranii. Szczegółowe informacje na temat procedury czyszczenia można znaleźć w protokole tekstowym. Po oczyszczeniu przenieść próbki do naczyń krystalizacyjnych i płukać je wodą przez trzy minuty.

Umieść próbki na niestrzępiących się ręcznikach i wysusz je suszarką za pomocą pistoletu do azotu, aby utworzyć wzory w skali milimetrowej. Dziurkować arkusze elastomeru silikonowego o grubości 250 mikronów za pomocą stempla do biopsji. Przetworzone arkusze elastomeru należy oczyścić, zanurzając je w 70% izopropanolu, a następnie wysuszyć pistoletem do azotu.

Następnie umieść arkusz dziurkacza na niestrzępiącym się ręczniku i wyrównaj oczyszczone szkiełka okładki na szablonie z powierzchnią próbki skierowaną w stronę szablonu. Przenieś szablon z szkiełkami okładki na płytkę nośną, aby utworzyć wzory w skali submilimetrowej. Umieść oczyszczony mikroskop, wsuń na obracający się uchwyt i zdmuchnij wszelkie cząstki za pomocą pistoletu do azotu.

Dozuj 1,5 mililitra hexa methylodilane na szklane szkiełko. Za pomocą plastikowej pipety rozprowadzić heksa metylodilan obracając szkiełko kolejno z prędkością 500 obr./min przez pięć sekund i z prędkością 1500 obr./min przez 30 sekund. Po zakończeniu piecz szkiełko na gorącej płycie w temperaturze 115 stopni Celsjusza przez siedem minut, a następnie pozwól mu ostygnąć przez pięć minut.

Następnie dozuj cztery mililitry pozytywowego zdjęcia. Oprzyj się na szklanym szkiełku. Rozłóż fotorezystancję, obracając zjeżdżalnię w warunkach opisanych wcześniej.

Piecz szkiełko na gorącej płycie w temperaturze 115 stopni Celsjusza przez 1,5 minuty i wyjmij je po wystawieniu na działanie promieni UV i upieczeniu. Rozpuścić naświetlone zdjęcie. Oprzyj się, zanurzając zjeżdżalnię w pozytywnym zdjęciu.

Oprzyj się programiście przez co najmniej 3,5 minuty. Po zakończeniu dokładnie spłucz szkiełko wodą DI i sprawdź opracowane wzory pod mikroskopem optycznym. Następnie załaduj próbki do maszyny do rozpylania, która może niezależnie osadzać napylanie złota, srebra i chromu.

Czyść próbki przez 90 sekund przy mocy 50 watów w atmosferze przetwarzania Argonne o mocy 25 militorów przed rozpoczęciem osadzania metalu pod 10-militorowym chromem Argonne przez 10 minut przy mocy 300 watów. Następnie napylaj złoto przez 90 sekund o mocy 400 watów, a następnie napylaj złoto i srebro przez 10 minut ze srebrem o mocy 200 watów i złotem o mocy 100 watów. Wyłącz źródło napylania złota na około 10 sekund przed wyłączeniem źródła napylania srebra.

Usuń próbki z maszyny do rozpylania po wyjęciu próbek z rozpylarki. Poddaj je sonizacji w około 180 mililitrach pozytywowego zdjęcia. Resist stripper przez 10 cykli 22. sonikacji z dwuminutowymi przerwami między cyklami.

Po zakończeniu przepłukać próbki wodą i osuszyć je pistoletem do azotu. Sprawdź metalowe wzory pod mikroskopem. Następnie oderwij szablon elastomerowy od próbek pokrytych powłoką niefotorezystancyjną za pomocą dwóch pęset, aby odsłonić osadzony metal.

Małe szkiełka nakrywkowe należy traktować plazmą powietrzną o mocy 10 watów przez 30 sekund przed zanurzeniem ich w kwasie azotowym. Stopić szkiełka mikroskopowe, zanurzając je w zlewce z 70% kwasem azotowym w temperaturze 55 stopni Celsjusza na 15 minut. Po zakończeniu stapiania należy przepłukać próbki, zanurzając je kolejno w zlewkach z wodą po trzy razy każda.

Umieść próbki na niestrzępiących się ręcznikach i wysusz je suszarką za pomocą pistoletu do azotu. Dostosuj temperaturę płyty grzejnej do zakresu od 150 do 300 stopni Celsjusza. Następnie powoli opuść próbki na gorącą powierzchnię, aby zminimalizować nagłą zmianę temperatury.

Po pięciu minutach wyjmij próbki z płyty grzejnej do ostygnięcia. Umieść nanoporowate próbki złota w naczyniach polistyrenowych i potraktuj je plazmą powietrzną o mocy 10 watów przez 30 sekund. Następnie przenieś próbki na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych.

Dodaj 500 mikrolitrów kompletnych pożywek hodowlanych do każdego. Dobrze przechowuj płytki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 do momentu wysiewu komórek. Utrzymuj mysie komórki astrocytów w kolbach T 75 z pożywką hodowlaną.

Gdy komórki zlewają się w 70%, przejdź przez nie, usuwając najpierw stare podłoże i myjąc komórki PBS. Szczegółowe informacje na temat warunków passeng można znaleźć w protokole tekstowym. Po wyjęciu płytek hodowlanych z inkubatora należy odessać zużytą pożywkę z dołków i wysiać komórki na szkle.

Szkiełka nakrywkowe o gęstości 25 000 komórek na centymetr kwadratowy o końcowej objętości jednego mililitra. Wstrząsnąć płytką hodowlaną, aby zapewnić jednolitą powłokę komórek na próbkach i umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze, gdy komórki są gotowe do analizy. Usuń zużyte media z dołków i umyj je dwukrotnie PBS.

Po utrwaleniu komórek w 4% para formaldehydzie w PBS i dwukrotnym umyciu, poddaj je w 500 mikrolitrach 0,1% Triton X 100 w PBS przez pięć minut. Powtórz płukanie PBS dwa razy i przenieś komórki do czystych studzienek. Wlać 80 mikrolitrów roztworu barwiącego na próbki i przechowywać je przykryte folią aluminiową przez 20 minut.

Po kolejnym płukaniu PBS przeciwbarwić komórki trzema nanomolami DPI w PBS przez pięć minut. Ponownie umyj komórki PBS i zanurz je w di, a następnie zamontuj komórki na szkle. Przykryj szkiełka nośnikami montażowymi i uszczelnij je przezroczystym obrazem lakieru do paznokci.

Nanoporowate złote powierzchnie za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego o powiększeniu 50 000 x przy energii elektronów 10 kilowoltów przy użyciu wtórnego detektora elektronów. Następnie należy wykonać złożone obrazy komórek w różnych miejscach na próbkach za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przy 10-krotnym powiększeniu z odpowiednimi kostkami filtrującymi. Otwórz obrazy na obrazie J.Podziel obrazy na poszczególne kanały.

Zamień je na osiem ofert. Odejmij tło i wygładź je za pomocą filtrowania mediany. Następnie ręcznie dostosuj próg, aby podświetlić pory, ciała komórek i jądra.

Użyj polecenia zlewiska, aby rozdzielić scalone pory lub komórki. Ustaw parametry analizy cząstek i wykonaj polecenie, aby wyodrębnić liczbę cząstek, średnią powierzchnię i procentowe pokrycie cząstkami. Na koniec zmodyfikuj dołączone pliki makr, aby przeprowadzić analizę wsadową wielu obrazów.

W tym miejscu wyświetlana jest zmiana koloru osadzonych wzorów metalu przed i po stopowaniu d. Srebrzyste wykończenie wynika z zawartości stopu bogatego w srebro w stopie. Film nabiera widocznie pomarańczowo-brązowego odcienia.

Pokazane są tutaj drobniejsze cechy uzyskane przez litografię fotograficzną. Wzór metalu. Różne słabe morfologie można uzyskać poprzez obróbkę termiczną nanoporowatych warstw złota.

Obraz przekroju poprzecznego pokazuje, czy folie są równomiernie stopione przez grubość folii. Obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego można podzielić na obrazy binarne w celu określenia rozmiaru i procentowego pokrycia przez puste przestrzenie. Kod do generowania tych danych wyjściowych można pobrać ze strony internetowej JoVE.

Reprezentatywny obraz fluorescencyjny przylegających mysich komórek astrocytów hodowanych na nanoporowatej powierzchni złota jest pokazany tutaj. Poszczególne kanały obrazu można dzielić i segmentować w celu uzyskania obrazów binarnych do analizy interakcji materiału komórkowego. Segmentowane obrazy cytoszkieletu można wykorzystać do ilościowego określenia obszaru komórki i pokrycia powierzchni.

Podczas gdy segmentowane obrazy jądra komórkowego są przydatne do zliczania komórek. Kody do generowania tych wyników można pobrać ze strony internetowej JoVE. Pokazano tutaj wizualne podsumowanie niepowodzeń w wytwarzaniu nanoporowatych struktur złota, w tym przyczepność folii PO, brak porowatości i nadmierną obróbkę termiczną.

Po tej procedurze inne metody sugerują, że można przeprowadzić charakterystykę elektrochemiczną pod mikroskopią leśną, lizę komórek i PCR, aby uzyskać dalsze odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ adhezji komórek nanostrukturalnych i ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać złote wzory nanoporów i określać ilościowo ich interakcje z komórkami za pomocą cyfrowej analizy obrazu pod mikroskopią. Wyniki. Nie zapominaj, że praca z kwasem azotowym, kwasem siarkowym i nadtlenkiem wodoru może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, w tym środki ochrony osobistej.