Wykorzystanie zautomatyzowanego systemu śledzenia 3D do rejestrowania osobników i ławic dorosłych ryb pręgowanego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie trójwymiarowych wzorców ruchu danio pręgowanych lub innych zwierząt wodnych oraz analiza ich charakterystyki kinematycznej, przestrzennej i społecznej. Pozwala to na wykrycie zaburzeń behawioralnych wynikających z mutacji genetycznych lub czynników chemicznych i środowiskowych. Cel ten osiąga się poprzez uprzednią kalibrację systemu, która koryguje również znaczne zniekształcenia obrazu wywołane refrakcją.

Drugim krokiem jest rejestracja klatek wideo z relatywnie wysoką rozdzielczością czasową z co najmniej dwóch różnych kątów jednocześnie. Następnie oprogramowanie rekonstruuje trajektorie ryb. Stosowane są zaawansowane algorytmy w celu zredukowania wpływu szumów oraz określenia pozycji ryby w przypadku wystąpienia przesłonięcia lub grupowania się osobników.

Ostatnim krokiem jest analiza danych oraz przeprowadzenie analizy statystycznej przyspieszenia prędkości, kąta skrętu, rozkładu poziomego i pionowego w pojemniku obserwacyjnym, odległości między osobnikami oraz innych interesujących parametrów. W ostateczności, skalibrowany trójwymiarowy tracking o wysokiej rozdzielczości czasowej jest przydatny do badania deficytów behawioralnych u mutantów zebrafish oraz wpływu leków na różnorodne systemy behawioralne. W kontekście poszukiwania nowych leków, jedną z zalet systemu jest możliwość badania zachowania ryb w 3D.

Jest to istotne, ponieważ ryby naturalnie poruszają się w trzech wymiarach, a podczas jednoczesnego rejestrowania wielu osobników zapis 2D może być bardzo mylący przy badaniu konfiguracji przestrzennych grupy. Inną zaletą systemu jest to, że koryguje on refrakcję światła, która w przypadku braku korekty może prowadzić do znacznych błędów pomiarowych w obecnej konfiguracji. Pojemnik obserwacyjny z danio przebrany zostaje umieszczony w komorze obserwacyjnej.

Komora zawiera również kamerę, lustro zawieszone pod kątem około 45 stopni nad pojemnikiem oraz listwy oświetleniowe LED. Przed rozpoczęciem nagrywania należy skalibrować system, aby określić położenie ścianek pojemnika i powierzchni wody oraz współczynnik skalowania rejestrowanych klatek; należy również skorygować błąd wynikający z refrakcji światła przy przejściu z wody do powietrza. Po zakończeniu kalibracji należy przeprowadzić uruchomienie próbne z wykorzystaniem sztucznej ryby.

Rekalibrację należy przeprowadzić, jeśli pozycje lustra lub kamery są przesunięte lub w przypadku problemów z śledzeniem. Aby rozpocząć sesję nagrywania, należy umieścić w komorze obserwacyjnej pojemnik obserwacyjny wypełniony wodą do odpowiednich oznaczeń. Nóżki pojemnika powinny zostać wprowadzone do otworów wyrównujących.

Ustaw pojemniki w taki sposób, aby półprzezroczyste lub nieprzezroczyste ścianki były skierowane w stronę przeciwległą oraz w prawo z perspektywy kamery. Następnie włącz oświetlenie w komorze, umieść rybę w pojemniku i zasłoń zasłony. Otwórz moduł rejestracji, po czym na ekranie pojawi się obraz widoku przedniego i górnego pojemnika.

Początkowo uzyskany obraz może nie być idealny, w związku z czym może wymagać pewnych korekt w celu uzyskania odpowiedniego kontrastu między rybą a tłem. Aby dostosować obraz, wybierz sterowanie kamerą, a następnie w otwieranym oknie ustawień ogólnych odznacz widoczne tutaj pola i dostosuj czas naświetlania oraz wzmocnienie w taki sposób, aby obraz nie był prześwietlony. Następnie, po lewej stronie okna sterowania kamerą, wybierz balans bieli, a w nowym oknie odznacz pole automatyczne i dostosuj wartości czerwieni i niebieskiego, aby uzyskać najlepszy kontrast kolorystyczny zarówno w widoku z przodu, jak i z góry.

Po zakończeniu regulacji może być konieczne przeprowadzenie ich wielokrotnie. Z menu głównego modułu rejestracji należy wybrać lokalizację danych, aby utworzyć lub wybrać folder. Każdy pomiar powinien mieć osobny folder, który powinien być podfolderem folderu eksperymentu.

Teraz należy nacisnąć przycisk start recording i wprowadzić liczbę całkowitą określającą czas trwania nagrania w minutach, a następnie nacisnąć okay, aby rozpocząć eksperymentalną sesję nagrywania. Po zakończeniu nagrań należy skopiować i wkleić podfoldery z danymi o pojemniku dla zwierzęcia oraz danymi korelacyjnymi z folderu kalibracyjnego do folderów utworzonych wcześniej podczas nagrywania. Aby rozpocząć rekonstrukcję ścieżki, należy otworzyć moduł trajektorii w oprogramowaniu. Następnie należy nacisnąć data location, aby wybrać folder utworzony za pomocą modułu nagrywania.

Następnie naciśnij przycisk konfiguracji systemu, aby najpierw otworzyć okno parametrów i dostosować progi kolorystyczne widoku dolnego końcówki górnej. Dobrą wartością początkową jest 1000. Następnie wybierz progi rozmiaru widoku dolnego końcówki górnej.

Dobrym rozmiarem początkowym dla danio przebraska o średniej wielkości jest 10; dla ryby dużej należy użyć wartości 20, a dla małej wartości 5. Im wyższe są te progi, tym mniejsza jest szansa, że oprogramowanie zarejestruje szum. Jednak przy zbyt wysokiej wartości może ono nie być w stanie wykryć ryby.

W dalszej części eksperymentu może okazać się konieczne ponowne dostosowanie tych progów. W przypadku górnego progu wielkości zwykle wystarcza wartość 3000. W odniesieniu do specyficznej długości należy zachować ustawioną fabrycznie wartość 220.

Liczba ryb odnosi się do liczby ryb w zbiorniku obserwacyjnym. Maksymalna liczba punktów odnosi się do całkowitej liczby klatek; należy zapisać lub zapamiętać tę liczbę, a następnie nacisnąć OK. Następnie należy wybrać opcję pozyskiwania tła (acquire background).

W następnym oknie pojawi się prośba o wypełnienie dwóch pól. Po załadowaniu tła dostosuj trzy czerwone ramki za pomocą myszy; ramki te wyznaczają obszary, w których oprogramowanie wyszukuje ryby. Zminimalizuj ramkę po lewej stronie.

Ponieważ widok boczny służy wyłącznie do kalibracji, należy teraz nacisnąć przycisk rozpoczęcia generowania trajektorii, aby uruchomić rekonstrukcję ścieżki. Idealnie znacznik powinien znajdować się na obrazie ryby; jeśli jest on często umieszczany błędnie, należy otworzyć okno informacji. Tutaj widzimy przypadek idealny, w którym widoczne są jedynie kontury ryby.

W przypadku wystąpienia nadmiernego szumu należy nacisnąć przycisk stop w menu głównym i wybrać nowe progi koloru oraz rozmiaru. Należy również sprawdzić, czy można nieco zmniejszyć czerwone ramki. Na przykład w górnej części, aby wykluczyć szum generowany przez ruchy wody, należy obserwować trajektorię na ekranie 3D.

Klikając prawym przyciskiem myszy, badacz może wybrać między rotacją a translacją konfiguracji 3D. Aby rozpocząć przetwarzanie danych, należy otworzyć moduł przetwarzania danych, wybrać opcję projektu na pasku narzędzi, a następnie z menu rozwijanego wybrać opcję nowy i wprowadzić nazwę eksperymentu. Następnie należy wybrać edytuj projekt.

Następnie dodaj do projektu, a następnie wybierz nową grupę i wprowadź nazwę dla grupy eksperymentalnej. Teraz zaznacz grupę eksperymentalną w prawym oknie. Zauważ, że pasek narzędzi ulegnie zmianie.

Wybierz grupę edycji (edit group), następnie dodaj do grupy (add to group), a potem nowe pomiary (new measurements). Otworzy to okno przeglądarki. Następnie otwórz folder utworzony podczas rejestracji, wybierz podfolder trajektorie (trajectories), a następnie plik wygładzony (point smoothened file).

W przedstawionym tutaj przykładzie dla grupy A wczytano sześć plików, a dla grupy B cztery pliki. Aby rozpocząć analizę, należy wybrać plik z wygładzonymi punktami w prawym oknie. Następnie z menu rozwijanego należy wybrać przetwarzanie danych (data processing) oraz pojedyncze wartości końcowe (single value endpoints).

W ramach przykładu wybierz funkcję duration freezing. Otworzy się okno umożliwiające określenie parametrów zamrażania w postaci progu prędkości oraz progu czasu trwania, co pozwoli zapoznać się z działaniem programu. Wypróbuj inne przykłady, takie jak travel distance depth distribution, która pozwala określić liczbę poziomów głębokości oraz częstotliwość serii pomiarowych.

Po wybraniu tej opcji zostanie przeprowadzone przetwarzanie wsadowe z wykorzystaniem domyślnego progu, w ramach którego obliczone zostanie około 200 punktów końcowych. Wartości domyślne oznaczają, że ustawiono już ograniczniki. Przykładowo, obecnie rozkład głębokości jest obliczany dla trzech poziomów głębokości, a rozkład kątowy dla czterech sekcji.

Po wygenerowaniu parametrów otworzy się nowe okno z prośbą o podanie lokalizacji i nazwy pliku do utworzenia. Dane zostaną zapisane w formacie CSV i mogą zostać zaimportowane do innego oprogramowania. Tutaj rycina A przedstawia typowy przykład klatki dla kontroli.

Ryby danio prążkowane, podczas gdy rycina B przedstawia typową klatkę z przykładem ryb danio prążkowanych traktowanych MK 801, obie zarejestrowane podczas porannej sesji. Zauważmy, że kontrolowane ryby danio prążkowane znajdowały się blisko dna i blisko siebie. W przeciwieństwie do nich, ryby danio prążkowane po podaniu MK 801 znajdowały się blisko powierzchni i pływały w znacznej odległości od siebie.

Tutaj przedstawiono dwie reprezentatywne trajektorie dla kontrolowanych rybek danio-ostrobrzuchych oraz rybek poddanych działaniu 10 µM MK 801, dla sesji porannej oraz popołudniowej. Na tym rysunku przedstawiono średnie dystanse społeczne dla grupy kontrolnej oraz ryb poddanych działaniu 10 µM MK 801 dla obu sesji, a tutaj zaprezentowano osie czasu średnich odległości międzyosobniczych dla obu grup.

Na rysunku A przedstawiono rozkład danio pręgowanego na 10 równych poziomach głębokości podczas sesji porannej, a na rysunku B rozkład podczas sesji popołudniowej. Tutaj widoczny jest rozkład czasowy grup eksperymentalnych w czterech strefach radialnych. Wstawka pokazuje położenie tych stref od centrum do peryferii, a tutaj przedstawiono rozkład czasowy grup eksperymentalnych w czterech kwadrantach.

Wstawka przedstawia rozmieszczenie kwadrantów. Podwójne linie oznaczają białe ściany, a pojedyncze linie oznaczają ściany przezroczyste. Kamera znajduje się po lewej stronie wstawki, najbliżej kwadrantów pierwszego i czwartego.

Czarne gwiazdki oznaczają porównania między grupami z sesji porannej, a szare gwiazdki porównania dla sesji popołudniowych. Na koniec przedstawiono składowe X, Y, Z dystansu przebytego przez rybkę danio podczas sesji porannych i popołudniowych. Przedstawiono średnią oraz błąd standardowy średniej.

Podczas pracy z systemem należy pamiętać, że jakość danych zależy od jakości nagrania, dlatego należy upewnić się, że system jest odpowiednio skalibrowany, a ustawienia kamery są optymalne. Pozostałe etapy są proste i wymagają jedynie zapoznania się z poszczególnymi krokami.