Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie i wygodne wytworzenie kompetentnych bakterii tego samego dnia. Są potrzebne do transformacji. Osiąga się to poprzez najpierw posiew bakterii na agarze LB i inkubację ich przez cztery do sześciu godzin.

Następnie trawnik bakteryjny jest ostrożnie zbierany z powierzchni agaru, a granulat jest ponownie zawieszany w sterylnej zimnej wodzie lub buforze. Następnie osad bakteryjny przemywa się trzykrotnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesza w 40 mikrolitrach. Na koniec kompetentne komórki są elektropostowane w obecności DNA.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują poziomy przemian bakteryjnych porównywalne do tych uzyskiwanych przy użyciu tradycyjnej metody, która wymaga znacznego sprzętu, dużych ilości kultur bakteryjnych i sterylnych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że świeże, kompetentne bakterie można przygotować praktycznie z dowolnego szczepu laboratoryjnego tego samego dnia, w którym planowana jest transformacja, bez potrzeby stosowania dużych wirówek, wirników lub liderów sterylnych i kultur Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie nie będą się zbytnio zmagać, ponieważ jest to tylko skrótowa odmiana technik powszechnie stosowanych w laboratoriach bakteriologicznych. Nie można zidentyfikować twórcy tego protokołu, ponieważ z biegiem czasu był on używany i optymalizowany przez wielu badaczy.

Przedstawiona tutaj metoda jest stosowana w naszych laboratoriach od prawie dwóch dekad, a naszym celem jest podzielenie się tym użytecznym protokołem z naszymi rówieśnikami. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna dla jednego kroku. W szczególności zbieranie bakterii z trawnika na ślimaku, ponieważ ocena wzrostu na talerzu wymaga doświadczonego oka.

I to jest najlepiej zobrazowane. Procedurę demonstruje pani Theresa Brooks, asystentka naukowa z laboratorium dr Te Koski na University of Alberta w Edmonton w Kanadzie. Aby rozpocząć przygotowywanie kultur bakteryjnych późnym popołudniem, użyj niewielkiej ilości E coli lub v coray do zaszczepienia od jednego do pięciu mililitrów autoklawu bulionu LB w sterylnych probówkach ze szkła krzemianowego.

Umieść zaszczepione probówki w bębnie rolkowym i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i dużej prędkości. Przygotuj rozsiewacz komórek w kształcie kija hokejowego ze szklanego pręta, podgrzewając środek pręta w płomieniu palnika Bunsena, aż szkło zmięknie. Następnie za pomocą pęsety lub szczypiec delikatnie skieruj zgięcie pod kątem 135 stopni.

Podgrzej pręt jeszcze raz w środku między końcem a pierwszym zagięciem i zegnij go pod kątem 45 stopni do wewnątrz. Przygotuj napowietrzacze lb z antybiotykami i bez antybiotyków i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka.

Umieść 100 mikrolitrów kultury przez noc na każdej płytce agarowej LB. Za pomocą rozsiewacza komórek inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do sześciu godzin lub do momentu, gdy pojawi się cienka trawa wzrostu bakterii. Za pomocą pętli zaszczepiającej zbierz z płytki masę bakteryjną o średnicy około dwóch milimetrów i ponownie zawiesij ją w jednym mililitrze lodowatego lodu.

Dwa milimolowe chlorki wapnia. W przypadku stosowania v coray lub sterylnej podwójnie destylowanej wody do E. coli przy użyciu wirówki z chłodzeniem ustawionej na cztery stopnie Celsjusza, wirować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze 5 000 Gs. Wyrzucić supernatant i powtórzyć płukanie jeszcze dwa razy. Po usunięciu końcowego resusu supernatantu zawiesić osad w 40 mikrolitrach chlorku wapnia lub podwójnie destylowanej wody i trzymać na lodzie.

Aby przeprowadzić transformację, dodaj do jednego mikrograma DNA osocza do 40-mikrolitrowej zawiesiny bakteryjnej i przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej sterylnej szczeliny 0,2 centymetra. Wete, włóż vete do komory elektroporacyjnej modułu sterującego impulsami i zjedz przy 1,8 kilowolta i 25 mikrophs. Stała czasowa powinna wynosić około 5,0 milisekund i nie powinno wystąpić wyładowanie łukowe.

Szybko zawieś komórki w jednym mililitrze bulionu LB i przenieś do wcześniej autoklawu szklanej probówki do opiekania. Pozwól komórkom zregenerować się, inkubując w napowietrzonych warunkach wzrostu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut bez selekcji antybiotyków. Umieść bakterie na płytkach LB ager z antybiotykiem i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Jak pokazano tutaj, przeprowadziliśmy zestaw transformacji z matrycą e coli i V co, aby porównać wydajność transformacji naszej szybkiej metodologii z adaptacją tradycyjnej metody pierwotnie opisanej przez doera i innych do przygotowania bakterii elektrokompetentnych. Wydajność transformantu mieściła się w zakresie od 10 od szóstej do 10 siódmych CFU na mikrogram DNA w trzech powtórzonych eksperymentach dla E coli i v coray. Wykorzystanie tradycyjnej metody dla elektrokompetencji.

Przygotowanie komórek, wydajność transformantu wydawała się zmniejszona dziesięciokrotnie do 10, do piątej, do 10 do szóstej CFU na mikrogram DNA w trzech powtórzonych eksperymentach dla E. coli i v koray przy użyciu metody szybkiej. Z tego powodu określiliśmy procent przekształconych bakterii, dzieląc przekształcone CFU przez liczbę CFU odzyskanych z pozorowanych transformacji z identycznych partii kompetentnych komórek. Procent przekształconych bakterii mieścił się w obrębie jednego logarytmu.

Niezależnie od metody przygotowania i przekształconych gatunków. Wyniki te sugerują, że skuteczność szybkiej metody jest porównywalna z tradycyjną, dłuższą procedurą przygotowania kompetentnych komórek i że reprezentatywne szczepy ieo, coray i esia coli są równie podatne na szybką procedurę. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin, wykonując ją prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zebraniu bakterii w ich logarytmicznej fazie wzrostu, umyciu ich w sterylnym, świeżo przygotowanym i wstępnie schłodzonym roztworze wody buforowej i utrzymywaniu ich w chłodzie do momentu ponownego zawieszenia w LB po elektroporacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko wygenerować elektrokompetentne komórki specyficzne dla szczepu bakteryjnego w swoim laboratorium, hodując je na inauguracyjnym trawniku, zbierając je podczas logarytmicznej fazy wzrostu, a następnie myjąc je w zimnym buforze w ramach przygotowań do elektroporacji.