Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie badań przesiewowych interferencji RNA na dużą skalę w elegancji C przy użyciu biblioteki karmienia bakteryjnego DS RNA w celu obniżenia ekspresji genów. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę klonów bakteryjnych z biblioteki DS RNA. W warunkach wzrostu, które zapobiegają utracie plazmidu, zacznij od zduplikowania każdej podstawowej płytki bibliotecznej, a następnie użyj 96-dołkowej zduplikowanej płytki bibliotecznej do wygenerowania tymczasowych łodyg bakterii na płytkach agarowych.

Bakterie z tych płytek dookólnych są hodowane przez noc w płynnej kulturze, a następnie przenoszone na powierzchnię płytek zasilających robaki. Każdy klon bakteryjny z biblioteki zawiera unikalny plazmid kodujący D-S-R-N-A, który celuje w jeden gen C-elgana w celu knockdownu. Drugim krokiem jest umieszczenie zsynchronizowanych robaków na płytkach podających.

Następnie robaki hoduje się przez kilka dni w wilgotnej komorze w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Gdy robaki żywią się bakteriami, indukowane DS RNA są uwalniane do jelita zwierzęcia, gdzie następnie rozprzestrzeniają się na otaczające tkanki, powodując ogólnoustrojowe efekty knockdown. Ostatnim krokiem jest zbadanie karmionych zwierząt pod kątem efektów fenotypowych spowodowanych knockdownem specyficznym dla genu.

Te testy fenotypowe służą do identyfikacji genów ważnych dla badanego procesu biologicznego. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroiniekcja dwuniciowych RNA do gonady robaka, jest jej wysoka przepustowość. Korzystając z bibliotek żywieniowych, możemy zbadać biologiczną funkcję prawie wszystkich genów elgina morskiego w ciągu zaledwie kilku tygodni.

Wiele laboratoriów zmagało się z tym podejściem do nokautacji, ponieważ większość genów i elegancja C są wystarczające. I tak knockdown RNA musi zmniejszyć ekspresję genów o ponad 50%Aby spowodować utratę fenotypów funkcjonalnych. Aby zapewnić solidny knockdown genu, ważne jest, aby wszystkie bakterie podawane robakom wykazywały ekspresję dwuniciowego plazmidu RNA.

Aby rozpocząć procedurę określania utraty plazmidu, należy usunąć małą próbkę bakterii zgodnie z opisem na każdym odpowiednim kroku i dodać ją do 450 mikrolitrów sterylnej wody. Użyj 100 mikrolitrów tej rozcieńczonej próbki, aby uzyskać dalsze seryjne rozcieńczenia przy użyciu sterylnej wody. Dokładnie wymieszać roztwory między rozcieńczeniami.

Rozprowadzić 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytkach LB i LB AMP i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia, zidentyfikować płytkę LB zawierającą od 100 do 500 kolonii bakteryjnych. Policz liczbę kolonii na tej płytce i na odpowiadającej jej płytce lb amp zawierających takie samo rozcieńczenie bakterii. Określ utratę plazmidu za pomocą tego równania.

Procent bakterii, które nie zawierają plazmidu, oblicza się, odejmując liczbę kolonii na płytce wzmacniacza LB od liczby kolonii na płytce LB, dzieląc przez liczbę kolonii na płytce LB i mnożąc przez 100 Utracie plazmidu zapobiega się przez hodowlę bakterii w wysokich stężeniach seliny węglowej W celu skutecznego knockdownu. Sprawdź, czy nie ma utraty plazmidu przed karmieniem zwierząt i kontynuuj tylko wtedy, gdy utrata plazmidu jest mniejsza niż 15%Rozpocznij tę procedurę od usunięcia zduplikowanych płytek bibliotecznych z zamrażarki o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Zdejmij foliowe uszczelnienie, gdy kultury są jeszcze zamrożone.

Załóż plastikową osłonę płyt i ustaw zduplikowane płytki biblioteczne na równej powierzchni, aby rozmroziły się w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 30 minut. Wysterylizuj policzkowy replikator 96 pinów. Umieść go w kąpieli etanolowej, a następnie spal etanol.

Powlekanie szpilek za pomocą bułki i palnika. Poczekaj, aż płomień zgaśnie, a następnie powtórz. Styki czystego replikatora należy przepłukać wodą destylowaną, a następnie wysterylizować przed każdym użyciem.

Umieść wysterylizowany replikator w dołkach rozmrożonej zduplikowanej płytki i użyj go do delikatnego wymieszania kultur. Małe objętości kultury będą przylegać do pinów replikatora. Ostrożnie wyjmij replikator z dołków zduplikowanej płytki i umieść go delikatnie przypinając do powierzchni płytki dookólnej.

Uważaj, aby nie przebić powierzchni agaru. Pozostawić replikator na powierzchni płytki dookólnej na trzy do czterech sekund, tak aby bakterie z kołków replikatora zostały przeniesione na powierzchnię agaru. Aby zapobiec utracie plazmidu na pożywkach stałych, eat zawiera dwa miligramy na mililitr.

Sprzedaż węgla. Wyjąć replikator i pozwolić, aby niewielka objętość kultury bakteryjnej wchłonęła się do agaru. Po zduplikowaniu obu płyt.

Inkubuj odwrócone płytki dookól przez 15 do 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego ranka. Te płytki dookólne mogą być używane do inokulacji 96 dobrze płynnych kultur lub przechowywane do siedmiu dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Bakterie do karmienia robaków są przygotowywane jako płynne kultury przy użyciu bakterii z płytek dookólnych za pomocą powtarzalnego pipetera i 50-mililitrowej końcówki combi, dozuj jeden mililitr pożywki bakteryjnej na każde dwa mililitry.

Głębokie dołek płytki 96-dołkowej wysterylizuj replikator i umieść go na powierzchni płytki dookólnej zawierającej kolonie bakterii, upewniając się, że szpilki stykają się z każdą z 96 kolonii bakteryjnych. Ostrożnie przesunąć replikator z powierzchni płytki dookólnej na płytkę z głęboką studzienką, upewniając się, że kołki nie ocierają się o boki głębokich studzienek, dopóki nie zostaną zanurzone w pożywce wzrostowej. Aby usunąć bakterie do pożywki wzrostowej.

Przesuwaj replikator powoli ruchem prostopadłym, podążając za wewnętrzną ścianą płytki studzienki głębinowej. Uważaj, aby nie rozpryskiwać i nie zanieczyszczać krzyżowo studni. Na każdą płytkę do hodowli w 96 dołkach należy uwzględnić dwie kontrole.

Bakterie wykazujące ekspresję DS RNA jako kontrola pozytywna dla oczekiwanego knockdownu, fenotypu oraz bakterie zawierające pusty wektor DS RNA jako kontrola ujemna. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, usuń pojedynczą kolonię izolowaną z płytki kontroli pozytywnej i zaszczepij pustą studzienkę w głębokiej studzience zwanej płytką. Zapisz położenie studzienki, która została zaszczepiona.

Powtórzyć dla kontroli ujemnej. Potrząśnij płytkami głębokiej studzienki w pozycji płaskiej z prędkością 650 obr./min na mikrowytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po całonocnej inkubacji kultur bakterie z 96 płytek głębinowych zostaną przeniesione do 12.

Przenoszenie dobrze karmiących płyt może odbywać się w czterech dołkach jednocześnie. Końcówki do pipet należy umieszczać na co trzecim kanale 12-kanałowej pipety wielokanałowej. Usuń 150 mikrolitrów kultury bakteryjnej z płytki głębokiej studzienki i wyrzuć na powierzchnię czterech dołków 12-dołkowej płytki zasilającej.

Ważne jest, aby nie przebijać powierzchni agaru podczas przenoszenia, ponieważ robaki będą się zakopywać i nie żywić się bakteriami wykazującymi ekspresję DS RNA. Po przeniesieniu każdego zestawu czterech studzienek zastąp cztery końcówki pipet czterema nowymi sterylnymi końcówkami pipet i zasiej kolejne cztery dołki płytki podającej, przechowuj płytki z nasionami pionowo w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc, aby bakterie mogły wchłonąć się do agaru. Przed przeniesieniem L jedna zatrzymana larwa C elgana na płytki żywieniowe DS RNA w celu przesiewania pokarmowego.

Należy określić stężenie wcześniej przygotowanych zatrzymanych larw L one. Wymieszać kolbę Erlenmeyera zawierającą zatrzymane larwy L w celu rozprowadzenia zwierząt. Następnie wyjmij podwielokrotność 10 mikrolitrów i umieść kroplami na nieosadzonej sześciocentymetrowej płytce NGM.

W czterech do pięciu kroplach w dół środka talerza. Upewnij się, że wszystkie media zostały usunięte z pipety. Używając końcówki końcówki pipety, rozprowadź kropki zawiesiny ślimakowej, tworząc pojedynczą ciągłą linię cieczy, która rozciąga się na całej średnicy płytki.

Za pomocą mikroskopu preparacyjnego policz wszystkie zwierzęta, zaczynając od jednego końca linii cieczy i kontynuując do drugiego końca, zanim ciecz wchłonie się na płytkę i zwierzęta się rozproszyją. Może to wymagać ciągłego ustawiania ostrości lunety sekcyjnej, aby mieć pewność, że żadne zwierzęta nie zostaną pominięte. Powtórzyć tę procedurę liczenia dla trzech oddzielnych podwielokrotności po 10 mikrolitrów w celu określenia średniej liczby robaków na mikrolitr zawiesiny robaków i zapisać tę liczbę bezpośrednio w kolbie Erlenmeyera.

Aby rozpocząć sito karmienia, użyj zawiesiny L one zatrzymanych larw i sterylnej wody, aby przygotować roztwór zawierający 2000 robaków na mililitr. Każda 12-dołkowa płytka do karmienia będzie wymagała 120 mikrolitrów tej zawiesiny robaków dokładnie wymieszanej, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie zwierząt i przenieść je do sterylnego zbiornika w celu pipetowania. Za pomocą pipety wielokanałowej z końcówkami w co trzeciej pozycji, przenieś 10 mikrolitrów roztworu robaka bezpośrednio na trawnik bakteryjny płytek podających.

Uważaj, aby nie przebić powierzchni agaru, ponieważ robaki zagrzebią się w agarze i nie będą żywić się bakteriami wykazującymi ekspresję D-S-R-N-A. Po przeniesieniu roztworu robaka do co dwa rzędy płytek podających, ponownie wymieszaj roztwór robaka w zbiorniku, delikatnie rozlewając go, gdy robaki szybko się osiadają, zbadaj kilka studzienek na wczesnym etapie pod lunetą sekcyjną, aby upewnić się, że w każdej studzience znajduje się od 20 do 30 robaków. Gdy wszystkie płytki do karmienia mają robaki, przechowuj płytki pionowo w nawilżonym pudełku w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza następnego dnia po wchłonięciu zawiesiny robaków przez płytkę, odwróć płytki i wróć do humidora w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Zwierzęta na tych płytkach można obserwować po trzech dniach w przypadku fenotypów P zero, a następnie ponownie po sześciu dniach w przypadku fenotypów F1. Opisany tutaj protokół został wykorzystany do przetestowania czterech genów pod kątem knockdown egg L 30 dumpy 17, PAT 10, a na czterech jajach L 30 i na czterech są wyrażane w układzie nerwowym. Pat 10 ulega ekspresji w mięśniach ściany ciała, a dumpy 17 ulega ekspresji w komórkach naskórka.

W badaniach przesiewowych wykorzystano mutanty Erie one Lin 15 B ze względu na ich zwiększoną wrażliwość na RNAi jako kontrolę negatywną. Robaki były karmione bakteriami zawierającymi pusty plazmid PL 44 40, który nie wykazywał ekspresji DS RNA zgodnie z oczekiwaniami. Zwierzęta RIE one Lin 15 B karmione bakteriami zawierającymi w pustym plazmidzie nie wykazywały żadnych wad morfologicznych ani behawioralnych.

Fotografia ta pokazuje swobodnie poruszające się zwierzęta, o czym świadczy ich normalna postawa ciała. strzałka wskazuje pozycję młodego dorosłego zwierzęcia. Biała strzałka wskazuje pozycję grupy złożonych jaj.

Normalne zachowanie robaków jest pokazane w tym klipie wideo, jajo L 30 koduje ortolog morskiej elegancji podjednostki białka G alfa Q. Kiedy L jeden etap, Erie, jeden Lin 15 B larwy były karmione bakteriami wyrażającymi jajo L 30 DS RNA. Larwy wyrosły na dorosłe osobniki, które wykazywały wyraźne wady w poruszaniu się i składaniu jaj. Po trzech dniach 100% zwierząt karmionych DS RNA przeciwko jaju L 30 było sparaliżowanych i niezdolnych do składania jaj.

Fotografia ta pokazuje, że wszystkie zwierzęta przyjęły sztywny wygląd typowy dla zwierząt sparaliżowanych. Należy również zwrócić uwagę na całkowity brak złożonych jaj na talerzu. Dumpy 17 koduje białko kolagenowe niezbędne do tworzenia naskórka w morzu.

Mutanty Elgan i dumpy 17 są niższe i grubsze niż zwierzęta typu dzikiego. W tym doświadczeniu nie zaobserwowano wad morfologicznych u zwierząt P zero karmionych dumpy 17 D-S-R-N-A. Jednak 98% zwierząt F1, jak pokazano na tym rysunku, wykazywało fenotyp przysadzisty.

Należy pamiętać, że dorosłe zwierzęta na polu, z których jedno jest oznaczone strzałką, są niższe i grubsze niż dorosłe zwierzę oznaczone czarną strzałką. W panelu A. Brak niskich i grubych zwierząt P zero wskazuje, że funkcja genu 17 jest wymagana we wczesnych stadiach larwalnych dla prawidłowej morfologii ciała. Pat 10 koduje białko CA troponiny w ścianie ciała, zawierające cztery motywy dłoni EF, które wiążą wapń.

W tym badaniu zaobserwowano, że 100% zwierząt Erie one Lin 15 B karmionych RNA Pat 10 DS zostało sparaliżowanych w ciągu trzech dni i nie złożyło jaj, co doprowadziło do śmiertelnego fenotypu. Należy zauważyć, że chociaż zwierzęta są sparaliżowane, nadal mogą poruszać mięśniami głowy podczas żerowania, na co wskazuje usunięcie bakterii w pobliżu głowy oznaczone strzałką na czterech kodach, białku domeny homeo ulegającym ekspresji w neuronach ruchowych rdzenia brzusznego i jest wymagane do prawidłowego wejścia synaptycznego. Gen Choice on Four został wybrany jako gen testowy w tym badaniu, ponieważ okazał się odporny na poprzednie strategie żywieniowe DS RNA.

Wyniki tego badania wykazały, że 62% zwierząt karmionych czterema bakteriami eksprymującymi RNA DS z preparatu bibliotecznego wykazywało defekty w zachowaniu lokomocji w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego, które swobodnie cofają się ruchem sinusoidalnym po szturchnięciu w głowę, UNC cztery mutanty zerowe nie cofają się, ale zamiast tego kurczą się mocno, powodując zginacz grzbietowy, który często staje się tak ekstremalny, że głowa i ogon zwierzęcia stykają się, umieszczając ciało w pozycji zwiniętej. Poniższa tabela przedstawia odsetek zwierząt, które wykazują fenotypy zerowe, gdy są karmione RNA DS w stosunku do każdego z czterech testowanych genów, 100 zwierząt zostało przebadanych w każdym eksperymencie knockdown. Wyniki te pokazują znaczenie retencji plazmidu dla powodzenia DS RNA.

Ekrany interferencyjne Wytrzymałe i wysoce penetrujące fenotypy utraty funkcji można zaobserwować we wszystkich tkankach. Kiedy wszystkie bakterie karmione robakami wykazują ekspresję DS RNA Po opanowaniu, cała biblioteka żywieniowa może zostać przebadana przez jedną osobę w ciągu około dwóch miesięcy. Aby zwiększyć przepustowość, testujemy każdy klon bakteryjny tylko raz na ekranie karmienia.

Wszystkie geny zidentyfikowane w pierwszym przejściu przez bibliotekę są następnie ponownie testowane. W trzech egzemplarzach nalegamy, aby pożądany fenotyp był obserwowany we wszystkich ponownych testach, aby gen został podniesiony do kwadratu jako trafienie dodatnie. Plazmid jest następnie oczyszczany z bakterii i sekwencjonowany w celu zweryfikowania tożsamości zakodowanego genu.

Po zidentyfikowaniu genu zamawiamy mutanta L, jeśli jest dostępny, i testujemy go pod kątem pożądanego fenotypu przed wykonaniem jakiejkolwiek dodatkowej charakterystyki genu.