Wizualizacja wpływu pozytywnego wczesnego doświadczenia, stymulacji dotykowej, na morfologię dendrytyczną i łączność synaptyczną za pomocą barwienia Golgiego-Coxa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie technik barwienia złotem G Cox w celu wizualizacji zmian morfologicznych w neuronach następujących po stymulacji dotykowej we wczesnym okresie życia. Cel ten realizuje się poprzez trzykrotne codzienne poddawanie zwierząt stymulacji dotykowej od trzeciego do dwudziestego pierwszego dnia po urodzeniu. Drugim krokiem jest perfuzja zwierząt po osiągnięciu przez nie wieku badanego oraz przechowywanie ich mózgów w roztworze Goldy cos.

Następnie mózgi są przecinane za pomocą Aome. Ostatnim krokiem jest impregnacja mózgów z wykorzystaniem techniki podwójnego barwienia GOGI. Ostatecznie procedura GOGI służy do wizualizacji pojedynczych neuronów, co umożliwia analizę zmian morfologicznych.

Zaletą techniki Goy Cox jest to, że pozwala ona na ilościowe określenie struktury neuronów i powiązanie tych danych z efektami behawioralnymi. Zastosowania tej techniki obejmują zaburzenia rozwojowe, ponieważ wykazano, że stymulacja dotykowa jest skuteczna w regeneracji zarówno behawioralnej, jak i anatomicznej w przebiegu tych zaburzeń. Choć metoda ta umożliwia wgląd w neuroanatomię szczurów, może być ona również zastosowana w odniesieniu do innych organizmów modelowych oraz ludzkiej tkanki mózgowej.

Aby pomóc nam w pogłębieniu zrozumienia plastyczności zależnej od doświadczenia, zwierzęta są utrzymywane w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności z wolnym dostępem do pożywienia i wody po narodzinach. Każda samica szczura jest kwaterowana indywidualnie z potomstwem. Aby uniknąć dodatkowego stresu związanego z manipulacją, szczenięta otrzymują stymulację dotykową poczynając od trzeciego dnia po urodzeniu (P3).

Po zważeniu szczeniąt przed poranną sesją stymulacji dotykowej, przenieś szczenięta w ich klatkach macierzystych do oddzielnego pomieszczenia testowego. Umieść klatkę macierzystą na podkładce grzewczej ustawionej na 24 °C. Gdy nadejdzie czas stymulacji dotykowej, usuń matki z klatki macierzystej i umieść je w klatce tymczasowej z jedzeniem i wodą.

Samicę i tymczasową klatkę należy pozostawić w pomieszczeniu hodowlanym. Następnie należy użyć sztywnej płytki, aby podzielić klatkę domową na dwie połowy. Po tym randomly przydzielić połowę szczeniąt z każdego miotu do stymulacji dotykowej, podczas gdy pozostała połowa będzie służyć jako grupa kontrolna.

Oznacz tylne łapy i ogony szczeniąt markerem permanentnym, aby odróżnić grupy, a następnie umieść szczenięta z grupy stymulacji dotykowej po jednej stronie klatki, a szczenięta z grupy kontrolnej po drugiej. Ustaw czasomierz na 15 minut i użyj miękkiego, pierzastego pędzla. Szczotkuj wszystkie szczenięta z grupy stymulacji dotykowej jednocześnie przez 15 kolejnych minut.

Młode szcząta zazwyczaj tulą się do siebie i zdają się wchodzić w głęboki cykl snu, co znacznie ułatwia jednoczesną stymulację wszystkich młodych. Wraz z wiekiem szcząta stają się bardziej aktywne, a niektóre z nich zaczynają chodzić i badać otoczenie. W trakcie sesji należy przenosić wszelkie oddalające się szcząta z powrotem do grupy, aby zapewnić każdemu z nich równą stymulację.

Po 15 minutach stymulacji dotykowej należy umieścić matkę z powrotem w klatce i przetransportować ją do pomieszczenia hodowlanego. Proces ten powtarza się trzy razy dziennie. Przez 19 dni po ostatniej sesji stymulacji dotykowej odsadza się młode od matek. Młode są kwaterowane w klatkach z pięcioma lub sześcioma innymi odsadzonymi zwierzętami tej samej płci; szczury pozostawia się bez ingerencji w standardowych warunkach bytowania, aż do osiągnięcia wieku badanego.

Próbki pobiera się, gdy zwierzęta osiągną wiek 100 dni. Po eutanazji i perfuzji wewnątrzsercowej wyodrębnia się mózg, dbając o to, aby móżdżek pozostał nienaruszony.

Umieścić mózgi w nieprzezroczystej butelce Nalgene wypełnionej 20 mililitrami roztworu Goldy Coxa, w której powinny pozostawać przez 14 dni. Po 14 dniach zastąpić roztwór 30% roztworem sacharozy. Przechowywać mózgi w roztworze sacharozy od dwóch do pięciu dni przed przystąpieniem do sekcjonowania.

Osusz mózg przed przymocowaniem go do stolika do sekcjonowania za pomocą akrylowego kleju Sano, aby zapobiec rozdarciom lub nierównemu cięciu; upewnij się, że cały mózg jest stabilnie przymocowany do stolika. Następnie napełnij zbiornik Vibram 6% roztworem sacharozy, aż zakryje on ostrze sekcjonujące. Ustaw prędkość i amplitudę urządzenia Vibram na wartość pięć.

Przetnij mózg na sekcje o grubości 200 micron i umieść je na szkiełku mikroskopowym z 2% żelatyną. Podczas procesu sekcjonowania należy dopilnować, aby sekcje pozostawały wilgotne, aż do momentu zebrania wszystkich interesujących nas fragmentów. Przyciśnij sekcje do szkiełek, wywierając nacisk za pomocą zwilżonego papieru zakładowego.

Umieść preparaty w statywie do szkiełek i przechowuj je w komorze wilgotności przez co najmniej 12 godzin, ale nie dłużej niż cztery dni. Aby rozpocząć procedurę barwienia, opisz i przygotuj 12 szklanych kuwet do barwienia. W pierwszej kolejności zanurz preparaty w wodzie destylowanej na jedną minutę.

Następnie należy umieścić preparaty w wodorotlenku amonu i przechowywać je w ciemności przez 30 minut. Po dodatkowej minucie w wodzie destylowanej preparaty umieszcza się w utrwalaczu Kodak Fix na 30 minut, chroniąc je przed światłem. Przed odwodnieniem w serii roztworów alkoholu o rosnącym stężeniu, preparaty należy ponownie przepłukać w wodzie destylowanej.

Po ostatnim przemyciu alkoholem umieść preparaty w roztworze jednej trzeciej na 15 minut. Na koniec umieść preparaty w Hemo D na 15 minut. Po zakończeniu użyj środka Paramount do nałożenia szkiełek nakrywkowych na preparaty i pozostaw je do wyschnięcia przed badaniem pod mikroskopem.

Oto reprezentacyjne zdjęcie neuronu parametacyjnego w mózgu szczura, który otrzymał stymulację dotykową podczas rozwoju, barwionego metodą Golgiego-Coxa. Powiększone zdjęcie przedstawia kolce dendrytyczne na dendrytach końcowych. Jaśniejszy obraz po lewej stronie pochodzi od szczura z grupy kontrolnej, a ciemniejszy obraz pochodzi od szczura, który został poddany stymulacji dotykowej.

Wykres ten przedstawia średnią złożoność dendrytów apikalnych i bazalnych neuronów w obszarze CG trzech u dorosłych szczurów, które w okresie rozwoju otrzymały stymulację dotykową lub nie. Stosując tę procedurę, zyskujemy tę korzyść, że w przypadku chęci postawienia dodatkowych pytań badawczych, dzięki zabarwieniu całego mózgu, możemy powrócić do tej samej tkanki mózgowej, aby na nie odpowiedzieć. Opracowując te techniki, utorowaliśmy drogę badaczom do zbadania użyteczności stymulacji dotykowej jako terapii w leczeniu urazów głowy lub innych form uszkodzeń neurologicznych po ich wystąpieniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do zbadania jej potencjału w leczeniu urazów mózgu oraz zaburzeń rozwojowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zapewnić młodym szczurom wzbogacające doświadczenie stymulacji dotykowej, a także poznać metodę wizualizacji poszczególnych neuronów i synaps.