Wizualizacja wpływu pozytywnego wczesnego doświadczenia, stymulacji dotykowej, na morfologię dendrytyczną i łączność synaptyczną za pomocą barwienia Golgiego-Coxa

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie technik barwienia złotem G. Coxa do wizualizacji zmian morfologicznych w neuronach, które następują po stymulacji dotykowej we wczesnym okresie życia. Osiąga się to poprzez podanie stymulacji dotykowej trzy razy dziennie od trzeciego dnia po urodzeniu do 21 dnia po urodzeniu. Drugim krokiem jest perfuzja zwierząt po osiągnięciu wieku badawczego i przechowywanie ich mózgów w roztworze Goldy cos.

Następnie mózgi są krojone za pomocą Aome. Ostatnim krokiem jest nasączenie mózgów techniką barwienia GOGI. Docelowo procedura GOGI CO służy do wizualizacji pojedynczych neuronów, co pozwala na analizę zmian morfologicznych.

Piękno techniki Goya Coxa polega na tym, że pozwala nam ona określić ilościowo strukturę neuronów i skorelować ją z wynikami behawioralnymi. Implikacje tej techniki rozciągają się na zaburzenia rozwojowe, ponieważ wykazano, że stymulacja dotykowa jest skuteczna zarówno w behawioralnym, jak i anatomicznym powrocie do zdrowia po tych zaburzeniach. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w neuroanatomię szczurów, może być również stosowana do innych organizmów modelowych i ludzkiej tkanki mózgowej.

Aby pomóc nam lepiej zrozumieć doświadczaną plastyczność zależną, zwierzęta są utrzymywane w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody po urodzeniu. Każda samica szczura jest trzymana indywidualnie ze swoim potomstwem. Aby uniknąć dodatkowego stresu związanego z obchodzeniem się, szczenięta otrzymują stymulację dotykową Począwszy od P trzy.

Po zważeniu szczeniąt przed poranną sesją stymulacji dotykowej, przetransportuj szczenięta w ich domowych klatkach do oddzielnego pomieszczenia testowego. Umieść klatkę domową na poduszce grzewczej ustawionej na 24 stopnie Celsjusza. Gdy będą gotowe do stymulacji dotykowej, wyjmij koparki z ich domowej klatki i umieść je w tymczasowej klatce z jedzeniem i wodą.

Trzymaj matkę i tymczasową klatkę w pomieszczeniu hodowlanym. Następnie użyj sztywnej deski, aby podzielić klatkę domową na dwie połowy. Następnie losowo przypisz połowę szczeniąt z każdego miotu do poddania się stymulacji dotykowej, a druga połowa służy jako kontrola.

Oznacz ich tylne nogi i ogon trwałym markerem, aby rozróżnić grupy i umieść młode w grupie stymulacji dotykowej po jednej stronie klatki i kontrolne młode po drugiej. Ustaw minutnik na 15 minut za pomocą miękkiego pióra, takiego jak miotełka do kurzu. Szczotkuj wszystkie szczenięta w grupie stymulacji dotykowej w tym samym czasie przez 15 kolejnych minut.

Młode szczenięta szczurów zwykle tulą się do siebie i wydają się wchodzić w cykl głębokiego snu, co bardzo ułatwia stymulację wszystkich szczeniąt jednocześnie. Wraz z wiekiem szczenięta stają się bardziej aktywne, a niektóre szczenięta chodzą i badają. Podczas sesji przenieś wszystkie wędrujące szczenięta do grupy, aby upewnić się, że każde szczenię otrzyma równą stymulację.

Po 15 minutach stymulacji dotykowej włóż matkę z powrotem do klatki i przetransportuj klatkę z powrotem do pomieszczenia hodowlanego. Proces ten powtarza się trzy razy dziennie. Przez 19 dni Po ostatniej sesji stymulacji dotykowej odzwyczaj szczeniąt od matek Szczenięta są trzymane w klatkach z pięcioma lub sześcioma innymi odsadzonymi zwierzętami tej samej płci, pozostawiają szczury w spokoju w standardowych warunkach mieszkaniowych, dopóki nie osiągną wieku badawczego.

Próbki pobiera się, gdy zwierzęta osiągną wiek 100 dni. Po eutanazji i perfuzji wewnątrzsercowej dochodzi do ekstrakcji mózgu. Dbanie o utrzymanie móżdżku w stanie nienaruszonym.

Umieść mózgi w nieprzezroczystej butelce Nalgene wypełnionej 20 mililitrami roztworu Goldy Cox, gdzie są przechowywane przez 14 dni. Po 14 dniach zastąp roztwór 30% roztworem sacharozy. Trzymaj mózgi w roztworze sacharozy przez dwa do pięciu dni przed sekcją w celu cięcia.

Osusz mózg przed przymocowaniem do etapu cięcia klejem akrylowym Sano, aby zapobiec rozdarciu lub nierównemu cięciu, upewnij się, że cały mózg jest mocno przymocowany do etapu. Następnie napełnij zbiornik Vibram 6% roztworem sacharozy, aż pokryje ostrze sekcyjne. Ustaw prędkość i amplitudę Vibram na pięć.

Pokrój mózg na sekcje o grubości 200 mikronów i umieść je na 2% zżelowanym szkiełku mikroskopowym. Upewnij się, że sekcje są mokre w trakcie cięcia, gdy wszystkie interesujące Cię sekcje zostaną zebrane. Dociśnij sekcje do szkiełek, dociskając zwilżonym papierem.

Umieść szkiełka w stojaku na szkiełka i przechowuj je w komorze wilgotnościowej przez co najmniej 12 godzin, ale nie dłużej niż cztery dni. Aby rozpocząć procedurę barwienia, oznacz i przygotuj 12 szklanych naczyń do barwienia. Najpierw zanurz szkiełka w wodzie destylowanej na jedną minutę.

Następnie umieść szkiełka w wodorotlenku amonu i trzymaj je w ciemności przez 30 minut. Po dodatkowej minucie w wodzie destylowanej umieść szkiełka w Kodak Fix na 30 minut z ochroną przed światłem. Umieść szkiełka jeszcze raz w wodzie destylowanej przed odwodnieniem w szeregu stopniowanych roztworów alkoholu.

Po ostatnim przemyciu alkoholem umieść szkiełka w jednej trzeciej roztworze na 15 minut. Na koniec umieść szkiełka w hemo D na 15 minut. Gdy będziesz gotowy, użyj paramount, aby umieścić szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i pozwól szkiełkom wyschnąć na powietrzu przed zbadaniem ich pod mikroskopem.

Oto reprezentatywne zdjęcie neuronu parametalicznego barwionego metodą Golgiego Coxa u szczura, który otrzymał stymulację dotykową podczas rozwoju. Powiększona fotografia pokazuje kolce dendrytyczne na dendrytach końcowych. Jaśniejszy obraz po lewej stronie przedstawia szczura w grupie kontrolnej, a ciemniejszy obraz pochodzi od szczura, który otrzymał stymulację dotykową.

Ten wykres przedstawia średnią złożoność dendrytyczną wierzchołkową i baslerską dla neuronów w obszarze CG trzy od dorosłych szczurów, które albo otrzymały stymulację dotykową podczas rozwoju, albo nie. Postępując zgodnie z tą procedurą, mamy tę przewagę, że jeśli chcemy zadać dodatkowe pytania, zabarwiliśmy cały mózg, a więc możemy wrócić i użyć tej samej tkanki mózgowej, aby odpowiedzieć na te pytania. Opracowując te techniki, utorowaliśmy naukowcom drogę do zbadania przydatności stymulacji dotykowej jako terapii w leczeniu urazów głowy lub innych form urazów neurologicznych po ich opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią do zbadania jej potencjału w leczeniu urazów mózgu i zaburzeń rozwojowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób zapewnić szczeniętom owijające wzbogacające doświadczenie stymulacji dotykowej, a także sposób na wizualizację poszczególnych neuronów i synaps.