Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Ogólnym celem tej procedury jest wypreparowanie i zamontowanie zarodków danio pręgowanego w celu optymalnej mikroskopowej wizualizacji rdzenia kręgowego. Osiąga się to poprzez pierwsze mikrospreparowanie i usunięcie dębowej kuli. Drugim krokiem jest usunięcie resztek dębu i pipetowanie zarodków na szkiełko.

Następnie nadmiar płynu ostrożnie usuwa się chusteczką Kim, a następnie dodaje się podłoże montażowe. Ostatnim krokiem jest ustawienie zarodków na szkiełku za pomocą pogrzebacza do zarodków, a następnie nałożenie szkiełka nakrywkowego. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna lub mikroskopia jasnego pola służy do pokazania rozmieszczenia postmitotycznych ciał komórkowych i trajektorii rozwijających się aksonów.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurobiologii, takie jak mechanizmy odpowiedzialne za wzorce, różnicowanie i przewodnictwo aksonów. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wiele aspektów rozwoju układu nerwowego, może być również stosowana do innych tkanek, takich jak rozwijające się mięśnie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ przed rozpoczęciem eksperymentu wymagana jest sekcja pod mikroskopem.

Zrób pogrzebacz do zarodków, przyklejając końcówkę pipety do poprzedniej pipety, a następnie przyklejając żyłkę do końcówki pipety. Aby rozpocząć sekcję zarodków, umieść do 30 zarodków danio pręgowanego. Starzeć się 24 godziny po zapłodnieniu na 35-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej PBS.

Pod mikroskopem preparacyjnym zabezpiecz głowę zarodka parą kleszczy, jednocześnie odciągając dąb za pomocą szpilki do owadów. Następnie użyj pogrzebacza do zarodków, aby przenieść zarodki do części szalki Petriego, która nie ma dużo resztek żółtka. Następnie zasysaj zarodki do szklanej pipety pastwiskowej, pobierając jak najmniej płynu.

Następnie delikatnie pipetować do 21 zarodków na szkiełko. Ostrożnie usuń nadmiar płynu za pomocą chusteczki laboratoryjnej, unikając dotykania zarodków, a następnie dodaj jedną kroplę podłoża mocującego do zarodków. Następnie użyj pogrzebacza do zarodków, aby ustawić zarodki na bokach w dwóch do trzech rzędach.

Teraz dodaj odrobinę wazeliny do każdego rogu szkiełka nakrywkowego. Obróć szkiełko nakrywkowe tak, aby strona z wazeliną była skierowana w dół i umieść szkiełko nakrywkowe na zarodkach. Wazelina zapobiega uszkodzeniom zarodków w wyniku nadmiernej kompresji.

W razie potrzeby delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe w każdym rogu, aż nośnik montażowy dotknie szkiełka nakrywkowego, używając pipetera o pojemności od 20 do stu mikrolitrów. Dodaj więcej nośników montażowych obok szkiełka nakrywkowego i pozwól, aby dodany nośnik przesunął się pod szkiełko nakrywkowe. Teraz użyj chusteczki laboratoryjnej, aby całkowicie wyczyścić okolice szkiełka nakrywkowego.

Nie należy wywierać nacisku na szkiełko nakrywkowe, ponieważ może to uszkodzić zarodki po prawidłowym oczyszczeniu, obszar jest suchy i nie ma na nim wazeliny ani mediów montażowych. Na koniec użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego. Po zamontowaniu zarodków danio pręgowanego uwidoczniono kilka segmentów HEMI powyżej przedłużenia dębowego worka.

Ten rysunek pokazuje ekspresję NK X 6,1 w brzusznym rdzeniu kręgowym zarodka danio pręgowanego. mRNA NK X 6,1 jest rozprowadzane w przybliżeniu w brzusznej połowie rdzenia kręgowego po 24 godzinach od zapłodnienia. W domenie progenitorowej komórki progenitorowe można odróżnić od komórek postmitotycznych ze względu na obecność płytki podłogowej, która znajduje się w przyśrodkowej części rdzenia kręgowego.

Oglądane z optyką DIC. Poszczególne komórki są wyraźnie rozróżnialne i wyraźna jest wyraźna granica między komórkami wyrażającymi i niewyrażającymi się. Wypadnięciu z cyklu komórkowego progenitorowego towarzyszą zmiany w ekspresji genów.

Ten obraz pokazuje ekspresję robo trzy w neuronach postmitotycznych. Rodzina receptorów robo to receptory naprowadzające aksony, których ekspresja pozwala na dokładne zliczanie neuronów postmitotycznych. Zauważ, że płyta podłogowa i strefa progenitorowa nie są widoczne w tej bardziej bocznej płaszczyźnie ogniskowej.

Mikroskopia konfokalna została wykorzystana do zobrazowania immunofluorescencji znp one, która oznacza aksony motoryczne, jak pokazano w tym bocznie zamontowanym zarodku. Neurony ruchowe opuszczają rdzeń kręgowy brzusznie po 24 godzinach od zapłodnienia, aby unerwić otaczające rozwijające się mięśnie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zachowaniu integralności tkanek poprzez staranną mikrodyfuzję. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać technik mikrodysekcji do usuwania żółtka zarodków danio pręgowanego w celu montażu i wizualizacji mikroskopowej.