Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych
18 września 2013
Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie potencjału migracyjnego progenitorów neuro jelitowego w obecności różnych czynników wzrostu. Osiąga się to poprzez pierwszą sekcję embrionalnych jelit cienkich myszy wypełnionych fluorescencyjnymi komórkami skorupy nerwowej. Drugim krokiem jest użycie wibrującego mikrotomu do przygotowania plastrów jelit o grubości 200 mikronów.
Następnie plastry te są inkubowane na żelu kolagenowym zawierającym czynniki wzrostu. Ostatnim krokiem jest oderwanie plasterków, aby odsłonić migrujące pod spodem komórki. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna służy do pokazania wzorca migrujących komórek w żelu kolagenowym.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w biologii rozwoju, takie jak lepsze zrozumienie wzajemnych oddziaływań między różnymi szlakami sygnałowymi leżącymi u podstaw powstawania obwodowego układu nerwowego. 12 dni po znalezieniu czopa dopochwowego poddaj eutanazji samicę myszy i usuń macicę, umieść macicę na szklanej szalce Petriego wypełnionej lodem. Zimny PBS przecina macicę poprzecznie między poszczególnymi obrzękami deum, aby wyizolować każde miejsce implantacji zarodka pod mikroskopem preparacyjnym, użyj cienkich kleszczy, aby usunąć warstwę mięśniową macicy.
Otwórz worek z żółtkiem trzewnym i owodnią, aby odsłonić zarodek. Zachowaj ostrożność podczas przecinania naczyń krwionośnych, łącząc zarodek z workiem żółtkowym, ponieważ są one splecione z rozwijającymi się jelitami. Następnie włóż zamknięte kleszcze do jamy brzusznej tuż nad ciemnoczerwoną wątrobą i pozwól im się otworzyć.
W ten sposób powstaje poprzeczny otwór w jamie brzusznej. Pociągnij otwarte kleszcze w dół w kierunku tylnego końca zarodka, aby całkowicie otworzyć brzuch. Po otwarciu chwyć tkankę łączną za wątrobą i wyciągnij wnętrzności.
Uważając, aby nie złamać jelit. Wytnij okrężnicę w dowolnym miejscu, aby uwolnić jelita od reszty zarodka. Zarezerwuj część ogonową na później.
Usuń tkankę łączną z jelita ślepego, a następnie jelita, pracując ostrożnie, aby nie zranić ich na rostralnym końcu jelita cienkiego. Odetnij wątrobę i żołądek, a także mezo, nerce i grzbiety narządów płciowych, jeśli są obecne. Na koniec wyizoluj jelito cienkie, wycinając jelito ślepe i okrężnicę, a także pozostałą tkankę łączną.
Tak jak poprzednio, uważaj, aby nie naciąć jelita. Pozostaw jelito cienkie w PBS w temperaturze pokojowej na jak najkrótszy czas przed wsadzeniem. Po odcięciu zarodka na szyi zapisz liczbę somitów ogonowych, aby dokładnie określić etap rozwoju zarodka.
Przed przystąpieniem do sekcji zarodków rozpuść 1,5 grama agros w 100 mililitrach PBS i utrzymuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Przygotuj formę do zatapiania, przecinając wzdłuż dwumililitrową rurkę do mikrowirówki, aby wyciąć około jednej czwartej ścianki rurki. Wlej stopiony agros do formy i pozwól mu ostygnąć, aż będzie tylko lekko ciepły w dotyku.
Gdy będzie gotowy, przytrzymaj jelito kleszczami za złożony koniec rostral i przeciągnij je bardzo powoli przez agros, wzdłuż długości pleśni. Pomaga to utrzymać jelito prosto, podczas gdy zestawy agro uwalniają tkankę, gdy tylko zaczyna ona opierać się ruchomości i śledzić orientację rostralnego rozpieszcza jelita. Następnie umieść formę w lodówce na dwie do trzech minut, aby całkowicie stężała.
Po związaniu usuń agros z formy i przytnij nadmiar agros na obu końcach, wykonując nacięcia prostopadłe do jelita. Przyklej rostralny koniec bloku agros do metalowego stolika mikrotomu i przytnij nadmiar aros ze wszystkich stron. Następnie zamontuj metalowy stolik na wibrującej komorze mikrotomu.
W razie potrzeby dostosuj kąt etapu tak, aby jelito było jak najbardziej pionowe. Przykryj próbkę lodowatym PBS przed zejściem ostrza mikrotonowego na kilka milimetrów pod powierzchnię bufora. Gdy będziesz gotowy, wykonaj 200 mikronów poprzecznych nacięć najbardziej rozpieszczonego jelita cienkiego.
Upewnienie się, że każdy plasterek agro zawiera pełny wycinek jelitowy. Świeżo pokrojone plastry delikatnie układamy na wcześniej przygotowanym żelu kolagenowym. Umieszczając jeden plasterek w kierunku środka każdej studzienki, aby umożliwić migrację komórek grzebienia nerwowego z bakłażanów, inkubuj plastry przez trzy dni.
Po tym czasie delikatnie zdejmij plastry z żelu kolagenowego za pomocą kleszczyków, uważając, aby nie uszkodzić znajdującego się poniżej żelu. Aby upewnić się, że wzorzec migracji komórek nie zostanie zakłócony, ważne jest, aby unikać bezpośredniego dotykania żelu kolagenowego podczas kolejnych etapów inkubacji i mycia. Najpierw utrwal komórki za pomocą 500 mikrolitrów 4% PFA na studzienkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Następnie zastąp utrwalacz 500 mikrolitrami roztworu DPI na studzienkę i inkubuj przez 10 minut. W temperaturze pokojowej ostrożnie usuń roztwór DPI i umyj każdą studzienkę trzy razy 500 mikrolitrami PBS przez pięć minut. Na koniec sfotografuj komórki fluorescencyjne osadzone w żelu kolagenowym w każdej studzience.
W tym przykładzie zastosowano czynniki wzrostu w celu stymulacji migracji komórek nerwowych jelita z ekspresją GFP. Linia przerywana reprezentuje przybliżony rozmiar i położenie planu. Stwierdzono, że przed usunięciem z żelu liczba i rozprzestrzenianie się komórek wyrażających GFP migrujących z jelita grubego było znacznie większe w stanach leczonych i nieleczonych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić potencjał migracji jelitowych neuronalnych komórek progenitorowych poprzez inkubację wycinków jelitowych na żelu kolagenowym zawierającym czynniki wzrostu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia test migracji komórek ex vivo, zaprojektowany w celu ilościowego określenia potencjału migracyjnego komórek grzbietowych neuronów jelitowych w odpowiedzi na różne czynniki wzrostu. Metodologia obejmuje wycinanie embrionalnych jelit cienkich myszy oraz wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji migrujących komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Komórki grzebienia neuronalnego układu pokarmowego odgrywają kluczową rolę w rozwoju jelitowego układu nerwowego.
- Zrozumienie ich migracji jest niezbędne do poznania mechanizmów zaburzeń przewodu pokarmowego.
- Czynniki wzrostu mogą wpływać na zachowanie tych komórek podczas rozwoju.
- Analizy ex vivo zapewniają kontrolowane środowisko do badania migracji komórek.
Cel badania
- Ilościowe określenie potencjału migracyjnego progenitorów neuronów jelita.
- Ocena wpływu różnych czynników wzrostu na migrację komórek.
- Opracowanie wiarygodnego testu do przyszłych badań nad komórkami grzebienia neuralnego jelita.
Zastosowane metody
- Disekcja embrionalnego jelita cienkiego myszy zawierającego fluorescencyjne komórki grzebienia neuronalnego.
- Przygotowanie plastrów o grubości 200 micron przy użyciu wibracyjnego mikrotomu.
- Inkubacja plastrów tkanki na żelach kolagenowych z czynnikami wzrostu.
- Mikroskopia fluorescencyjna w celu wizualizacji i analizy migrujących komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna kwantyfikacja wzorców migracji komórek w odpowiedzi na czynniki wzrostu.
- Wizualizacja migrujących komórek pod przekrojami tkankowymi.
- Wykazanie skuteczności testu w badaniu zachowania komórek grzbietu neuronalnego splotu jelitowego.
- Wnioski dotyczące roli konkretnych czynników wzrostu w migracji komórek.
Wnioski
- Test ex vivo stanowi cenne narzędzie do badania migracji komórek grzebienia neuralnego jelit.
- Czynniki wzrostu znacząco wpływają na potencjał migracyjny tych komórek.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu poszukiwania celów terapeutycznych w leczeniu schorzeń przewodu pokarmowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe testy migracji komórek dla mysich progenitorów neuronów jelitowych umożliwiają precyzyjną ocenę wpływu czynników wzrostu na ruchliwość komórek grzebienia neuronalnego, co jest krytycznym parametrem we wczesnym etapie odkrywania i walidacji celów w badaniach nad rozwojem neurologicznym oraz układem pokarmowym. Ta platforma ex vivo dostarcza wiarygodnych i powtarzalnych danych, które pozwalają na mechanistyczną redukcję ryzyka i zwiększają pewność predykcyjną strategii modulacji szlaków sygnałowych. Ilościowe wyniki testu ułatwiają podejmowanie decyzji portfelowych z uwzględnieniem ryzyka na styku biologii rozwoju i translacyjnej neuronauki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkryć i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków sygnalizacyjnych czynników wzrostu wpływających na migrację komórek grzebienia neuralnego.
- Wspiera walidację funkcjonalną potencjalnych celów zaangażowanych w rozwój jelitowego układu nerwowego.
- Zmniejsza ryzyko mechanistyczne poprzez ilościowe określanie odpowiedzi komórkowych na modulację szlaków.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów do dalszej oceny przedklinicznej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowany system ex vivo do ilościowej oceny migracji komórek.
- Zapewnia powtarzalne odczyty oparte na fluorescencji, odpowiednie do analizy porównawczej.
- Wspiera standaryzację testu w celu późniejszego przesiewu związków chemicznych lub biologicznych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu czynników wzrostu lub inhibitorów na ruchliwość prekursorów neuronalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami chorób istotnymi dla zaburzeń żołądkowo-jelitowych i neurorozwojowych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania i badania szlaków sygnałowych po przedkliniczną walidację potencjalnych interwencji.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów poprzez powiązanie fenotypów migracji komórkowej z aktywnością szlaków sygnałowych.
- Umożliwia dostosowanie do ryzyka procesu rozwijania hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na migrację komórek grzebienia nerwowego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten ilościowy test migracji wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z badaniami translacyjnymi nad rozwojem jelitowego układu nerwowego.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa migrację progenitorów neuronalnych w odpowiedzi na określone czynniki wzrostu, wspierając weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne wyniki dla oceny porównawczej potencjalnych modulatorów.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar dystansu migracji i liczby komórek, co ułatwia porównania statystyczne między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy migracji ex vivo z punktami końcowymi istotnymi dla chorób w modelach żołądkowo-jelitowych i neurorozwojowych.
- Zastosowania szerokie: Oferuje platformę testową możliwą do ponownego wykorzystania i adaptacji do różnych czynników wzrostu, inhibitorów oraz tła genetycznego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad migracją komórek grzebienia neuronalnego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy dla analiz w zespołach interdyscyplinarnych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywnie kapitałowy rozwój programów neurodevelopmentalnych i gastroenterologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków z uwzględnieniem ryzyka w celu dalszego rozwoju przedklinicznego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sekcji embrionów, przygotowywaniu skrawków tkanek oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do mikrotomów wibracyjnych, zaplecza do przygotowywania żelu kolagenowego oraz infrastruktury obrazowej.
- Konieczna jest standaryzacja konfiguracji testów i protokołów analizy ilościowej pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych czynników wzrostu i modeli genetycznych, lecz ogranicza się do warunków ex vivo.
- Zależność od dostępności transgenicznych linii myszy z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami grzebienia neuronalnego.
