Name: Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj ilościowy test migracji komórek dla jelitowych progenitorów nerwowych myszy z wykorzystaniem mikrotomu wibracyjnego i mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda pozwala badać wpływ czynników wzrostu na ruchliwość komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Denisowi Flipo za porady dotyczące przetwarzania i analizy obrazu, oraz Davidowi W. Silversidesowi, w którego laboratorium wygenerowano linię myszy Gata4p[5kb]-GFP. Badania w laboratorium Pilon są finansowane przez CIHR, NSERC, FRQS i FRQNT.

Oświadczenie etyczne
Eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi opieki i manipulacji zwierzętami wykorzystywanymi w badaniach medycznych. Protokoły dotyczące manipulacji zwierzętami zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną Uniwersytetu Quebec w Montrealu (Comité Institutionnel de Protection des Animaux; numer referencyjny 0512-R3-650-0513).
1. Przygotowanie żeli kolagenowych
Pracuj w sterylny sposób, pod kapturem do hodowli tkankowej.
<ol>
	<li>Przygotuj kompletne 5x DMEM (zmodyfikowana pożywka eteryczna Eagle'a), w tym standardowe antybiotyki. Rozpuścić 3,37 g proszku DMEM i 0,925 g NaHCO3 w 20 ml wody. Sterylizować, przechodząc przez filtr 0,22 μm. Dodać 2,5 ml sterylnej 100x penicyliny/streptomycyny i 25 ml sterylnej, inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Na lodzie wymieszać 800 μl roztworu kolagenu I (3,77 mg/ml w 0,02 N kwasie octowym, sterylizowanym filtrem), 600 μl kompletnego 5x DMEM i 17 μl 1 N NaOH. Rozcieńczyć sterylną wodą do końcowej objętości 3 ml. Uwzględnij w tym zestawie odpowiednie czynniki wzrostu. Zwykle używamy GDNF w stężeniu 10 ng/ml w celu stymulacji migracji NCC jelitowej.</li>
	<li>Umieścić około 480 μl w każdym dołku z jednego rzędu na płytce 24-dołkowej. Unikaj bąbelków. Pozostałe rzędy można wykorzystać do przetestowania wpływu innych czynników wzrostu na migrację komórek.</li>
	<li>Pozostawić kolagen do polimeryzacji przez co najmniej 1 godzinę w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
2. Sekcja zwierząt16
<ol>
	<li>Ustaw krycia i sprawdź, czy następnego ranka nie ma czopów dopochwowych. Dzień e0,5 w południe w dniu znalezienia czopa pochwowego należy odizolować samicę i odczekać 12 dni do e12,5.</li>
	<li>Znieczulić ciężarne myszy izofluranem i poddać eutanazji przez wdychanie CO2 .</li>
	<li>Spryskaj mysz 70% etanolem. Podnieś skórę brzucha i otwórz jamę brzuszną nożyczkami preparacyjnymi.</li>
	<li>Wyjmij macicę do szklanej szalki Petriego wypełnionej lodowatym PBS (solą fizjologiczną buforowaną fosforanami). Przeciąć macicę poprzecznie między poszczególnymi obrzękami zarodka, aby wyizolować każde miejsce implantacji zarodka.</li>
	<li>Pracuj nad każdym miejscem implantacji osobno na innej szklanej szalce Petriego wypełnionej lodowatym PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczy, aby usunąć warstwę mięśniową macicy.</li>
	<li>Otwórz woreczek żółtkowy trzewny i owodnię, aby odsłonić zarodek. Należy zachować ostrożność podczas przecinania naczyń krwionośnych łączących zarodek z łożyskiem/woreczkiem żółtkowym trzewnym, ponieważ są one splecione z rozwijającymi się jelitami.</li>
	<li>Odetnij głowę zarodka na szyi.</li>
	<li>Włóż zamknięte kleszcze do jamy brzusznej zarodka, tuż nad ciemnoczerwoną wątrobą i pozwól kleszczom otworzyć się (przestań wywierać nacisk), aby zrobić poprzeczny otwór w jamie brzusznej. Pociągnij otwarte kleszcze w dół w kierunku tylnego końca zarodka, aby całkowicie otworzyć brzuch.</li>
	<li>Chwyć tkankę łączną za wątrobą i wyciągnij wnętrzności z brzucha, uważając, aby nie uszkodzić jelit (okrężnica jest przyczepiona do odbytu).</li>
	<li>Przetnij okrężnicę, aby uwolnić wnętrzności od reszty zarodka. Cięcie można wykonać w dowolnym miejscu wzdłuż okrężnicy. Zarezerwuj część ogonową na później.</li>
	<li>Usuń tkankę łączną z jelita ślepego, a następnie resztę jelit. Uważaj, aby nie zranić przy tym jelit.</li>
	<li>Odetnij wątrobę i żołądek (na rostralnym końcu jelita cienkiego), a także śródnerce i grzbiety narządów płciowych, jeśli są obecne.</li>
	<li>Odizoluj jelito cienkie. Ponownie uważaj, aby nie ugryźć jelita. Od teraz orientację rosrrocaudal tkanki jelitowej można śledzić za pomocą ostrej krzywizny występującej na końcu rostralnym. Pozostawić jelito cienkie w PBS w temperaturze pokojowej na jak najkrótszy czas przed osadzeniem (patrz krok 3.3).</li>
	<li>Na koniec zapisz liczbę somitów ogonowych dla każdego zarodka, aby dokładnie określić etap rozwoju embrionalnego.</li>
</ol>
3. Sekcja jelit embrionalnych
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do sekcji zarodków należy rozpuścić 1,5 g agarozy w 100 ml PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) i przechowywać w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Wlej stopioną agarozę do formy do zatapiania (np. zamkniętej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml, która została przecięta wzdłuż, aby wyciąć około 1/4 ścianki probówki). Pozwól agarozie ostygnąć do około 42-45 °C, powinna być tylko lekko ciepła w dotyku.</li>
	<li>Osadź jelito embrionalne tuż przed zestaleniem się agarozy (można to ocenić za pomocą końcówek kleszczy i nastąpi to około 36-38 °C). Trzymając jelito kleszczami za złożony koniec rostralny, przeciągnij je bardzo powoli przez agarozę wzdłuż formy. Pomaga to utrzymać jelita prosto, podczas gdy agaroza tężeje. Uwolnij tkankę, gdy tylko zacznie opierać się ruchom. Śledź orientację rostralno-ogonową jelit.</li>
	<li>Wstaw foremkę do lodówki na 2-3 minuty, aby upewnić się, że agaroza całkowicie stwardniała.</li>
	<li>Wyjmij agarozę z formy (wysuwając ją z otwartej rurki Eppendorfa). Za pomocą ostrza usuń nadmiar agarozy na obu końcach, wykonując nacięcia prostopadłe do jelita.</li>
	<li>Przyklej rostralny koniec bloku jelita/agarozy na metalowym stoliku mikrotomu za pomocą wibrującego ostrza. Przytnij nadmiar agarozy po bokach bloku jelitowego/agarozowego.</li>
	<li>Zamontuj metalowy stolik na wibrującej komorze mikrotomu. W razie potrzeby dostosuj kąt etapu tak, aby jelito było jak najbardziej pionowe (a więc prostopadłe do ostrza). Przykryj próbkę lodowatym PBS. Zmniejsz ostrze mikrotomu do kilku milimetrów pod powierzchnię bufora.</li>
	<li>Wykonaj wibratome poprzeczne nacięcia jelita cienkiego o grubości 200 μm, upewniając się, że każdy plasterek agarozy zawiera pełny wycinek jelita.</li>
</ol>
4. Kultura eksplantatów jelitowych
<ol>
	<li>Delikatnie umieść świeżo ścięte plastry jelita/agarozy płasko na żelach kolagenowych za pomocą kleszczy, umieszczając jeden plasterek w kierunku środka każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić migrację NCC z eksplantatu.</li>
	<li>Bardzo delikatnie zdejmij plastry jelita/agarozy z żelu kolagenowego za pomocą kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić znajdującego się poniżej żelu.</li>
	<li>Unikaj dotykania żelu kolagenowego bezpośrednio podczas kolejnych etapów inkubacji i mycia, aby upewnić się, że wzorzec migracji komórek nie zostanie zakłócony. Utrwalić za pomocą 500 μl 4% PFA (paraformaldehydu) (w PBS) na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąp utrwalacz 500 μl roztworu DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindolowego) (5 μg/ml w PBS) na basenik i inkubuj 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć każdą studzienkę 3x 500 μl PBS przez 5 min.</li>
	<li>Sfotografuj komórki fluorescencyjne (kanały GFP i DAPI) osadzone w żelu kolagenowym w każdym dołku.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
Intensywnie korzystaliśmy z ImageJ17 do przetwarzania i ilościowego określania obrazów generowanych po hodowli eksplantatów.
<ol>
	<li>Zacznij od zobrazowania szkiełka mikrometrycznego w tym samym powiększeniu, co zdjęcia komórek fluorescencyjnych. Zmierz długość jednego mikrona w pikselach (za pomocą narzędzia Linia prosta).</li>
	<li>Ustaw skalę (Analizuj/Ustaw skalę; wprowadź liczbę pikseli/mikron).</li>
	<li>Dla każdego zdjęcia fluorescencyjnego GFP zmień format obrazu na 8-bitową skalę szarości (Obraz/Typ/8-bitowy).</li>
	<li>Dostosuj intensywność sygnału (Obraz/Regulacja/Jasność/Kontrast).</li>
	<li>W razie potrzeby odejmij szum tła (Proces/Odejmij tło; dostosuj promień toczącej się piłki).</li>
	<li>Ustaw próg, aby podświetlić komórki i skupiska komórek (Obraz/Dostosuj/Próg), a następnie zastosuj zlewnię, aby podzielić kępy (Proces/Binarny/Zlewnia).</li>
	<li>Analizuj cząstki, aby określić obszary zainteresowania (ROI) i generować statystyki liczby komórek (Analizuj/Analizuj cząstki; ustaw minimalny rozmiar, aby wykluczyć pozostałe piksele).</li>
	<li>Ustaw opcje pomiaru tak, aby uwzględniały średnicę Fereta (Analizuj/Ustaw pomiary).</li>
	<li>Grupuj ROI i mierz jako całość, aby określić średnicę Feret, wskazanie rozmieszczenia komórek (Analiza/Narzędzia/Menedżer ROI/Więcej/OR, następnie Menedżer ROI/Dodaj i Menedżer ROI/Pomiar).</li>
</ol>

<ol><li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li>
<li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li>
<li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li>
<li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li>
<li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li>
<li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li>
<li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li>
<li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li>
<li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li>
<li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li>
<li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li>
<li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%2C+associated+syndromes+and+genetics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li>
<li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li>
<li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZD5438%2C+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1%2C+2%2C+and+9%2C+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pokazujemy, w jaki sposób nasza technika hodowli eksplantatów ex vivo może być wykorzystana do precyzyjnego określenia ilościowego potencjału migracji NCC w jelitach w obecności GDNF. Tak precyzyjna kwantyfikacja jest znacznie ułatwiona dzięki użyciu wibratotycznych skrawków jelit o grubości 200 μm zamiast dużych kawałków o przybliżonej wielkości, jak opisano wcześniej11,12,15. Rzeczywiście, pozwala nam to pracować z rozsądną liczbą komórek w wysoce powtarzalnym otoczeniu. Warto zauważyć, że równomier...

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) są przejściowym typem komórek unikalnym dla kręgowców, który tworzy wiele pochodnych podczas rozwoju zarodka. Ta populacja komórek powstaje na granicy płytki nerwowej, w sąsiedztwie ektodermy nieneuronalnej1. Podczas neurulacji zginanie płytki nerwowej umieszcza NCC wzdłuż grzbietowej krawędzi tworzącej cewy nerwowej. NCC przechodzi następnie przejście nabłonkowo-mezenchymalne, segregując się i migrując z dala od cewy nerwowej. NCC kolonizują różne struktury embrionalne, w tym przewód pokarmowy, gdzie tworzą cały jelitowy układ nerwowy (ENS), połączoną sieć zwojów nerwowych osadzonych w ścianie jelita. Jak niedawno dokonano przeglądu2,3, wiele genów było zaangażowanych w rozwój tej skomplikowanej struktury.
Większość ENS pochodzi z małej puli NCC pochodzącej z cewy nerwowej nerwu błędnego (tj. wokół potencjalnej granicy tyłomózgowia i rdzenia kręgowego)4. Te neuronalne komórki progenitorowe docierają do jelita przedniego około dnia embrionalnego (e) 9,0 u myszy, a następnie migrują doogonowo w mezenchymie jelitowej do około e15,0, aby skolonizować całe jelita embrionalne. Niewielki podzbiór progenitorów nerwowych okrężnicy jest również zapewniony przez krzyżowe NCC, które atakują tylne jelito w przeciwnym kierunku aż do jelita ślepego4. Zarówno NCC nerwu błędnego, jak i krzyżowego wymaga wielu sygnałów promujących migrację, proliferację, przeżycie i różnicowanie, aby zapewnić pełne uformowanie ENS. W związku z tym modele zwierzęce - zwłaszcza genetycznie modyfikowane myszy - odegrały zasadniczą rolę w identyfikacji kilku niezbędnych ligandów zewnątrzkomórkowych: GDNF (czynnik neurotroficzny pochodzący z komórek glejowych), Endotelina-3, Neurotrofina-3, BMP (białka morfogenne kości), Netrin, a także Sonic i Indian Hedgehog (Shh i Ihh)5-10. Spośród nich sygnalizacja GDNF przez transbłonowy receptor kinazy tyrozynowej RET (Rearranged during transfekcji) jest uznawana za najbardziej krytyczną ścieżkę przyciągania i prowadzenia NCC do i w obrębie jelita embrionalnego. GDNF jest wydzielany przez mezenchymę jelitową i tworzy przestrzennie kontrolowany gradient rosrrocaudalny, który jest bezpośrednio chemoatrakcyjny dla jelitowego NCC, który wyraża RET11,12.
Wśród innych funkcji, ENS reguluje ruch w przewodzie pokarmowym poprzez interakcję z mięśniami gładkimi w ścianie jelita. Brak zwojów nerwowych w końcowym obszarze jelita powoduje chorobę Hirschsprunga: toniczny skurcz dotkniętego odcinka prowadzi do zablokowania, akumulacji strawionego materiału i masywnego rozdęcia jelit i brzucha. Choroba Hirschsprunga występuje u około jednego na 5 000 żywych urodzeń. Uważa się, że głównym czynnikiem przyczyniającym się do etiologii choroby Hirschsprunga jest wzorzec migracji doogonowej jelitowej NCC. Okrężnica, najbardziej oddalona od źródła migrującego NCC i ostatnia część jelita do skolonizowania, jest najbardziej podatna na defekty w tworzeniu ENS. Ze względu na kluczową rolę w migracji NCC do jelita, zakłócenie sygnalizacji GDNF/RET jest główną znaną przyczyną genetyczną choroby Hirschsprunga13.
Aby lepiej zbadać rozwój NCC i ENS, wygenerowaliśmy transgeniczną linię myszy - nazwaną Gata4p[5kb]-GFP14 - w której migrujące NCC są znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Następnie udoskonaliliśmy test migracji komórek ex vivo, zaadaptowany na podstawie opublikowanych prac innych grup11,12,15, który obecnie umożliwia precyzyjne ilościowe określenie potencjału migracji NCC jelita w obecności różnych czynników wzrostu, takich jak GDNF.

<table><tbody><tr><td>DMEM w proszku</td><td>Żubr</td><td>219-010-XK&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td> System <td></td></tr><tr><td>filtracji próżniowej Steriflip klasy biotechnologicznej (0,22 mikrona)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100x</td><td>Żubr</td><td>450-201-EL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Żubr</td><td>095-150</td><td>Wysokiej jakości</td></tr><tr><td>Kolagen I</td><td>BD biosciences</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>Rozcieńczony z 10 N bulionu, a następnie sterylnie przefiltrowany</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24-dołkowa płytka</td><td>BD biosciences</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td> Mikroskop preparacyjny <td>klasy hodowli komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>M125</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td> Ostrze chirurgiczne <td>klasy biotechnologicznej</td></tr><tr><td></td><td>Pióro</td><td>21</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Uniwersalny długopis z klejem błyskawicznym Krazy Glue</td><td></td><td>KG824</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V Mikrotom z ostrzem wibracyjnym</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela konkretnych odczynników i sprzętu.</td></tr></tbody></table>

ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to przejściowa i multipotencjalna populacja komórek, która wywodzi się z grzbietowej cewy nerwowej i intensywnie migruje w rozwijającym się zarodku kręgowców. Oprócz dostarczania obwodowych komórek glejowych i neuronów, NCC generuje melanocyty, a także większość szkieletu czaszkowo-twarzowego. Migracja i różnicowanie NCC jest kontrolowane przez połączenie ich osiowego pochodzenia wzdłuż cewy nerwowej i ich ekspozycji na regionalnie odrębne sygnały zewnątrzkomórkowe. Taki udział ligandów zewnątrzkomórkowych jest szczególnie widoczny podczas tworzenia jelitowego układu nerwowego (ENS), złożonej, połączonej ze sobą sieci zwojów nerwowych, która lokalnie kontroluje (między innymi) ruchy mięśni jelitowych i motorykę jelit. Większość ENS pochodzi z małej początkowej puli NCC, które podejmują długą podróż w celu skolonizowania - w sposób rostralny do ogonowego - na całej długości jelita perspektywicznego. Spośród kilku szlaków sygnałowych, o których wiadomo, że wpływają na kolonizację jelitowej NCC, sygnalizacja GDNF / RET jest uznawana za najważniejszą. Rzeczywiście, czasoprzestrzennie kontrolowane wydzielanie liganda RET GDNF przez mezenchymę jelitową jest głównie odpowiedzialne za przyciąganie i kierowanie jelitowym NCC z ekspresją RET do i wewnątrz jelita embrionalnego. W tym miejscu opisujemy test migracji komórek ex vivo, wykorzystujący transgeniczną linię myszy posiadającą fluorescencyjnie znakowane NCC, co pozwala na precyzyjne określenie ilościowe potencjału migracji NCC jelitowego w obecności różnych czynników wzrostu, w tym GDNF.

Poniższe wyniki są reprezentatywne dla rezultatów, jakie można uzyskać przy zastosowaniu opisanej tutaj techniki (Rysunek 1). Zastosowanie czynników wzrostu (i.e. GDNF) stymuluje migrację wykazujących ekspresję GFP komórek NCC jelit poza eksplant jelita do żelu kolagenowego (Rysunek 2). Chociaż w przypadku braku czynników wzrostu część komórek opuszcza eksplant, nie są one w większości znakowane GFP i reprezentują one wnikanie pasywne. W celu zarejestrowania wyników konieczne je...

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie potencjału migracyjnego enterycznych progenitorów neuronalnych w obecności różnych czynników wzrostu. W tym celu w pierwszej kolejności przeprowadza się wycięcie embrionalnych jelit cienkich myszy, w których znajdują się fluorescencyjne komórki neuro crest. W drugim kroku wykorzystuje się mikrotom wibracyjny do wykonania plastrów jelit o grubości 200 micron.Następnie plastry te inkubuje się na powierzchni żelu kolagenowego zawierającego czynniki wzrostu. Ostatnim krokiem jest odklejenie plastrów, aby odsłonić migrujące pod nimi komórki. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną, aby ukazać wzór migrujących komórek wewnątrz żelu kolagenowego.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak zapewnienie lepszego zrozumienia oddziaływań między różnymi szlakami sygnałowymi leżącymi u podstaw formowania się obwodowego układu nerwowego. 12 dni po znalezieniu czopa pochwowego należy przeprowadzić eutanazję samicy myszy i usunąć macicę, a następnie umieścić ją w szklanej szalce Petriego wypełnionej lodem. W zimnym PBS należy przeciąć macicę poprzecznie pomiędzy poszczególnymi obrzękami decydującymi, aby wyizolować każde miejsce implantacji zarodka pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie za pomocą precyzyjnej pęsety usunąć warstwę mięśniową macicy.Otwórz trzewny worek żółtkowy i owodnie, aby odsłonić zarodek. Zachowaj ostrożność podczas przecinania naczyń krwionośnych łączących zarodek z workiem żółtkowym, ponieważ są one przeplecione z rozwijającymi się jelitami. Następnie wprowadź zamkniętą pęsetę do jamy brzusznej, tuż nad ciemnoczerwoną wątrobą, i otwórz ją.Tworzy to poprzeczne otwarcie w jamie brzusznej. Przesuń otwarte pęsetą w dół, w kierunku końca tylnego zarodka, aby całkowicie otworzyć jamę brzuszną. Po otwarciu chwyć tkankę łączną za wątrobą i wyciągnij wnętrzności.Należy uważać, aby nie przerwać jelit. Przeciąć okrężnicę w dowolnym miejscu, aby oddzielić jelita od reszty zarodka. Część ogonową zachować do późniejszego etapu.Oddziel tkankę łączną od kątnicy, a następnie od jelit, uważając, aby nie uszkodzić ich w części rostralnej jelita cienkiego. Wycięcie wątrobę i żołądek, a także krezkę, grzebienie nefroforne i gonalne, jeśli są obecne. Na koniec wyizoluj jelito cienkie, odcinając kątnicę i jelito grube oraz pozostałą tkankę łączną.Podobnie jak poprzednio, należy uważać, aby nie uszkodzić jelita. Przed zatopieniem w medium, pozostaw jelito cienkie w PBS w temperaturze pokojowej na jak najkrótszy czas. Po oddzieleniu zarodka na wysokości szyi, odnotuj liczbę somytów ogonowych, aby dokładnie określić stadium rozwoju zarodkowego.Przed przystąpieniem do sekcji zarodków, należy roztopić 1,5 g agros w 100 ml PBS i utrzymywać w temperaturze 50 °C. Formę do zatapiania przygotowuje się poprzez przecięcie wzdłuż probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml w celu usunięcia około jednej czwartej ścianki probówki. Do formy wlewa się roztopiony agros i pozostawia do ostygnięcia, aż będzie on jedynie lekko ciepły w dotyku.Po przygotowaniu, należy chwycić jelito pęsetą za złożony koniec rostralny i bardzo powoli przeciągnąć je przez agar, wzdłuż długości formy. Pomaga to utrzymać odcinek jelita w pozycji prostej, podczas gdy agar zastyga; tkankę należy zwolnić natychmiast, gdy tylko zacznie stawiać opór przy przesuwaniu, zachowując przy tym orientację rostralną jelita. Następnie należy umieścić formę w lodówce na dwie do trzech minut, aby agar całkowicie stężał.Po utwardzeniu wyjąć bloki agarowe z formy i odciąć nadmiar agaru z obu końców, wykonując cięcia prostopadle do jelita. Przykleić koniec rostralny bloku agarowego do metalowego stolika mikrotomu i odciąć nadmiar agaru z każdej strony. Następnie zamontować metalowy stolik w komorze mikrotomu wibracyjnego.W razie potrzeby dostosuj kąt nachylenia stolika, aby jelito znajdowało się w pozycji jak najbardziej pionowej. Przykryj preparat lodowatym PBS przed opuszczeniem ostrza mikrotomu na wysokość kilku milimetrów poniżej powierzchni buforu. Po przygotowaniu wykonaj poprzeczne cięcia o grubości 200 micron jelita cienkiego coddle most.Należy upewnić się, że każdy plaster agro zawiera pełny odcinek jelita. Świeżo wycięte plastry należy delikatnie osadzić na wcześniej przygotowanym żelu kolagenowym. Umieszczając jeden plaster w stronę środka każdej dołki, aby umożliwić migrację komórek grzebienia neuronalnego z tkanek jelitowych, inkubować plastry przez trzy dni.Po tym czasie ostrożnie zdejmij plastry z żelu kolagenowego za pomocą pęsety, dbając o to, aby nie uszkodzić żelu znajdującego się poniżej. Aby mieć pewność, że wzór migracji komórek nie zostanie zaburzony, należy unikać bezpośredniego dotykania żelu kolagenowego podczas kolejnych etapów inkubacji i przemywania. Najpierw utrwal komórki, dodając do każdej studni 500 µL 4% PFA na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie należy zastąpić utrwalacz 500 µL roztworu DPI na każdą studzienkę i inkubować przez 10 minut. W temperaturze pokojowej ostrożnie usunąć roztwór DPI i przemyć każdą studzienkę trzy razy 500 µL PBS przez pięć minut. Na koniec wykonać zdjęcia fluorescencyjnych komórek zatopionych w żelu kolagenowym w każdej studzience.W tym przykładzie czynniki wzrostu zostały użyte do stymulacji migracji komórek grzebieni neuronowych jelit wykazujących ekspresję GFP. Linia przerywana reprezentuje przybliżony rozmiar i położenie eksplantu. Przed zdjęciem go z żelu stwierdzono, że liczba i rozprzestrzenienie komórek wykazujących ekspresję GFP migrujących z eksplantu jelitowego były znacznie większe w warunkach traktowanych w porównaniu z nietraktowanymi.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu określania potencjału migracyjnego enterycznych progenitorów neuronalnych poprzez inkubację skrawków jelita nad żelem kolagenowym zawierającym czynniki wzrostu.

a-quantitative-cell-migration-assay-for-murine-enteric-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ilościowa metoda badania migracji komórek dla myszych komórek macierzystych układu nerwowego jelit

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

W tym protokole pokazujemy, jak konstruować niestandardowe komory, które pozwalają na zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe translokacji komórek prekursorowych pochodzenia nerwowego w dorosłym mózgu podczas galwanotaksji.

Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Ten film demonstruje test migracji neurosfery komórek prekursorowych neuronów - test in vitro do badania odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery - za pomocą analizy mikroskopowej.

Test neurosfery NPC: Test in vitro do oceny odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery

Tutaj opisujemy test migracji komórek Schwanna (SC), w którym SC są w stanie rozwijać się wzdłuż rozszerzających się aksonów.

Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Migracja neuroblastów jest kluczowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów poprzez zastosowanie nukleofekcji DNA/małego RNA spinki do włosów (shRNA) oraz testu migracji 3D z neuroblastami wyizolowanymi z pourodzeniowego strumienia migracyjnego rostralnego gryzoni.

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

Przeszczep komórek macierzystych/progenitorowych (NPC) jest bardzo obiecujący w neurologii regeneracyjnej. Systemowe dostarczanie NPC przekształciło się w skuteczny, mało inwazyjny i bardzo skuteczny terapeutycznie protokół dostarczania komórek macierzystych do mózgu i rdzenia kręgowego gryzoni i naczelnych dotkniętych eksperymentalnym przewlekłym uszkodzeniem zapalnym ośrodkowego układu nerwowego.

Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Procesy neurorozwojowe, takie jak proliferacja, migracja i rozrost neurytów, są często zaburzone w chorobach neuropsychiatrycznych. W związku z tym przedstawiamy protokoły szybkiej i powtarzalnej oceny tych procesów neurorozwojowych u ludzkich NPC pochodzących z iPSC. Protokoły te pozwalają również na ocenę wpływu odpowiednich czynników wzrostu i terapii na rozwój NPC.

Szybkie wykrywanie fenotypów neurorozwojowych w ludzkich neuronalnych komórkach prekursorowych (NPC)

Prezentujemy trzy proste testy in vitro - test migracji na duże odległości, test migracji kokulturowej i test przyciągania chemo-chemicznego - które wspólnie oceniają funkcje komórek śródbłonka okołokomorowego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i ich interakcję z interneuronami GABA-ergicznymi.

Testy migracji, chemoprzyciągania i kohodowli komórek śródbłonka pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj ilościowy test migracji komórek dla jelitowych progenitorów nerwowych myszy z wykorzystaniem mikrotomu wibracyjnego i mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda pozwala badać wpływ czynników wzrostu na ruchliwość komórek nerwowych.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Przeglądaj więcej filmów