Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie
18 października 2013
Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja mutacji somatycznych w genach komórek z tkanki nowotworowej związanych z rakiem przy użyciu multipleksowanych bibliotek DNA z kodami kreskowymi, a następnie masowo równoległego sekwencjonowania. Osiąga się to poprzez pierwsze ligowanie adapterów sekwencjonowania z kodami kreskowymi do fragmentów DNA wyizolowanych z zachowanych guzów. Drugim etapem procedury jest hybrydyzacja do niestandardowych biotynylowanych oligonukleotydów, komplementarnych do wszystkich eksonów otoczkujących białka 279 onkogenów i genów supresorowych nowotworów.
Trzecim krokiem jest wykonanie masowo równoległego sekwencjonowania pul kodów kreskowych z przechwyconych bibliotek. Ostatnim krokiem jest przeszukanie danych sekwencji pod kątem zmian związanych z rakiem dla 279 docelowych genów. Ta procedura może ujawnić mutacje sekwencji, małe insercje, małe delecje, zmiany liczby kopii i wybrane zmiany strukturalne.
Tak więc główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że pozwala ona badać całe eksony zarówno pod kątem powszechnych, jak i rzadkich mutacji, a także identyfikować dodatkowe zmiany genomowe, takie jak utrata i zyski liczby kopii, oraz osiągać większą czułość w próbkach heterogenicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki nowotworów, takie jak to, jakie są kluczowe mutacje powodujące różne typy nowotworów i czy te mutacje w próbkach klinicznych korelują z wynikami lub odpowiedzią na terapie celowane? Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę i leczenie raka, ponieważ mutacje mogą być identyfikowane prospektywnie i wykorzystywane do kierowania pacjentów do odpowiednich terapii i badań klinicznych.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ krok czyszczenia pszczoły jest trudny do nauczenia ze względu na technikę ostrożności potrzebną podczas zmywania i unikania DNA z koralików. Wymieszaj odpowiednie objętości, aby uzyskać 50 mikrolitrów na próbkę. Porcjować 50 mikrolitrów każdego przezroczystego DNA do oddzielnych studzienek na płytce z sześcioma dołkami ID.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów przygotowanej mieszanki głównej naprawy końcówek do każdej reakcji i inkubuj płytkę w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby oczyścić reakcję. Najpierw dodaj 200 mikrolitrów kulek AMP pure XP do każdej próbki i delikatnie pipetuj całą objętość 10 razy w górę i w dół za pomocą pipetara wielokanałowego. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Następnie przenieś płytki na stojak magnetyczny i pozostaw je do oczyszczenia przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po oczyszczeniu delikatnie usunąć i wyrzucić większość supernatantu, uważając, aby nie naruszyć kulek. W studzienkach może pozostać pewna ilość płynu.
Następnie delikatnie dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu do każdej próbki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Ostrożnie odpipetować etanol i powtórzyć mycie jeszcze raz. Następnie pozostaw talerz do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aż cały alkohol ucieknie.
Teraz ponownie zawieś wysuszone kulki w 44,5 mikrolitrach sterylnej wody. Delikatnie przepuść każdą próbkę przez pipetę 10 razy, aż do ostatniego wyrzutu. Spłucz wszelkie koraliki przymocowane do boku studni.
Teraz inkubuj zawieszone w wodzie kulki w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie przenieś je na stojak magnetyczny na pięć minut, aż studzienki będą czyste. Na koniec delikatnie przenieś 42 mikrolitry klarownego supernatantu do każdej studzienki, która zawiera próbkę, do nowego dołka. Próbki można teraz przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do tygodnia.
Zacznij od przygotowania mieszanki wzorcowej D tailing w sterylnej probówce do mikrowirówki. Dodać osiem mikrolitrów przygotowanej mieszanki głównej ogonów DA do każdego dołka naprawionego DNA na końcu. Następnie inkubuj płytkę w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby oczyścić reakcję.
Użyj tego samego procesu opisanego w poprzedniej sekcji przy dwukrotnie większej objętości i zakończ, zawieszając kulki w 33,75 mikrolitrach sterylnej wody. W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do tygodnia. Aby kontynuować, przygotuj główną mieszankę ligacji na 15 mikrolitrów na reakcję.
Dodać 15 mikrolitrów głównej mieszanki ligacji do każdej studzienki zawierającej DNA ogona D. Następnie dodaj 1,25 mikrolitra odpowiedniego 25 mikromolowców. Następny elastyczny adapter z kodem kreskowym.
Do każdej, cóż, każda próbka powinna otrzymać osobny adapter z kodem kreskowym. Po załadowaniu adapterów inkubuj płytkę przez 15 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Teraz używając 50 mikrolitrów kulek, wykonaj czyszczenie po podwiązaniu adaptera i ponownie zawieś próbkę w sterylnej wodzie do 50 mikrolitrów.
Następnie wykonaj proces czyszczenia po raz drugi, kończąc na 23 mikrolitrach wody. W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do tygodnia. Następnym krokiem jest amplifikacja biblioteki każdej próbki, która jest szczegółowo opisana w protokole tekstowym dotyczącym rozmrażania lodu, uniwersalnych i indeksowych blokerów oligonukleotydów, łatwej bibliotece CCAP oraz zwinnych komponentach wychwytywania generacji, które obejmują bufor hybrydyzacyjny con TNA two X i składnik hybrydyzacji.
A. Teraz przygotuj jednomilimolową pulę indeksowych blokerów oligonukleotydów odpowiadających określonym sekwencjom adaptera z kodami kreskowymi użytymi w przygotowaniu biblioteki. Połącz jeden mikrolitr każdego blokera i wiruj je razem przez 10 sekund W nowej tubie o pojemności 1,5 mililitra przygotuj mieszankę wychwytującą składającą się z pięciu mikrolitrów conte A w ilości jednego miligrama na mililitr, dwóch mikrolitrów uniwersalnego blokera i dwóch mikrolitrów puli blokerów. Połącz 24 biblioteki kodów kreskowych w jedną reakcję.
Dodaj w sumie od jednego do trzech mikrogramów z zbiorczej biblioteki sekwencji kodów kreskowych do mieszanki przechwytywania. Przebij od 15 do 20 otworów w nasadce za pomocą igły o rozmiarze 20 lub mniejszym, odkurz mieszaninę w koncentratorze próżniowym DNA w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aż całkowicie wyschnie. Następnie ponownie uwodnić mieszaninę w buforze hybrydyzacyjnym i składniku hybrydyzacyjnym A. Przykryj otwory w nasadce taśmą i wiruj próbkę przez 10 sekund.
Następnie odwiruj mieszaninę z maksymalną prędkością przez 10 sekund. Teraz krótko inkubuj mieszankę w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby zdenaturować DNA. Następnie wykonaj 10-sekundowe wirowanie z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej w 0,2 mililitrowej probówce paskowej do PCR, wymieszaj 2,25 mikrolitra sond do przechwytywania ccap easy library z tą samą objętością sterylnej wody wolnej od nukleaz.
Następnie w reakcji wirówki wymieszać z probówką i delikatnie przepuścić całą objętość przez końcówkę pipety 10 razy. Teraz inkubuj probówkę o pojemności 0,2 mililitra w termocyklerze w temperaturze 47 stopni Celsjusza przez 48 do 96 godzin. Utrzymuj temperaturę pokrywy termocyklera na poziomie 57 stopni Celsjusza, aby zapobiec parowaniu i ustabilizować temperaturę reakcji kilka dni później.
Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby umyć i odzyskać przechwycone DNA. Następnie użyj zmodyfikowanego protokołu Roche nimble gen, aby amplifikować przechwycone DNA poprzez ilościowe określenie amplifikowanego przechwyconego DNA za pomocą testu wysokiej czułości kubitu. Jedna pula 24 bibliotek sekwencji z kodami kreskowymi, która zawierała 12 normalnych par guza, została przechwycona za pomocą sond 279 genów raka i zsekwencjonowana jako dwa na 75.
Odczyty pary zasad na jednym torze guza z komórkami przepływowymi HighSeq 2000 i normalne biblioteki zostały połączone w stosunku dwa do jednego. Obraz IGV pokazuje specyficzność pokrycia sekwencji w eksonach EGFR w raku płuca, szare słupki reprezentują unikalne odczyty sekwencji. Heterozygotyczna mutacja T 2 G po prawej stronie była obecna w 24% odczytów, co wskazuje, że jest to somatyczna substytucja aminokwasów L 8 58 R.
Żaden z odczytów prawidłowej tkanki płucnej nie wykazał tej mutacji TTA G, niektóre indele w guzie raka jelita grubego, normalna para wykazała somatyczną insercję przesunięcia ramki w PC lub somatyczną delecję przesunięcia ramki odczytu siedmiu par zasad. W TP 53 zaobserwowano również zmiany liczby kopii między normalnymi parami guza. Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczy ekson z 279 genów docelowych.
Zyski i straty liczby kopii są wnioskowane na podstawie wzrostów i spadków sekwencji guza Pokrycie Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu sześciu i pół godziny w przypadku przygotowania biblioteki udostępniania i od 48 do 96 godzin w przypadku hybrydyzacji przechwytywania, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Chociaż wykonanie tego testu jest niezwykle ważne, aby zachować ostrożność na zanieczyszczenia podczas przygotowywania biblioteki, ponieważ może to zakłócić analizę danych Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie Sangera i analiza fragmentów, aby odpowiedzieć na pytania takie jak: jak zweryfikować wątpliwą zmianę? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować biblioteki DNA z kodami kreskowymi i przeprowadzić przechwytywanie Exxon na tych połączonych bibliotekach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę identyfikacji mutacji somatycznych w genach związanych z nowotworami w tkance guza z wykorzystaniem kodowanych kreskowo multipleksowych bibliotek DNA oraz sekwencjonowania masowo równoległego. Metoda ta opiera się na wychwytywaniu eksonów metodą hybrydyzacji w celu wykrycia kluczowych mutacji w próbkach klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Badania nad rakiem
- Sekwencjonowanie nowej generacji
Wprowadzenie
- Mutacje somatyczne odgrywają kluczową rolę w rozwoju nowotworów.
- Ukierunkowane sekwencjonowanie eksonów zapewnia wysoką czułość w wykrywaniu mutacji o niskiej częstotliwości.
- Sekwencjonowanie masowo równoległe umożliwia wysokoprzepustową i kosztowo efektywną analizę.
- Dostosowane biotynilowane oligonukleotydy zwiększają specyficzność wykrywania mutacji.
Cel badania
- Wykrywanie mutacji związanych z nowotworami w klinicznych próbkach guza.
- Wykorzystanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi w celu wydajnego sekwencjonowania.
- Zwiększenie czułości i swoistości identyfikacji mutacji.
Zastosowane metody
- Ligacja sekwencyjnych adapterów z kodami kreskowymi do fragmentów DNA z utrwalonych guzów.
- Hybrydyzacja z biotynylowanymi oligonukleotydami celującymi w eksony onkogenów i genów supresorowych nowotworów.
- Masowe równoległe sekwencjonowanie przechwyconych bibliotek.
- Analiza danych sekwencyjnych pod kątem zmian związanych z nowotworami.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja mutacji sekwencji oraz małych insercji/delecji.
- Wykrywanie zmian liczby kopii oraz wybranych zmian strukturalnych.
- Wysoka czułość osiągnięta dla mutacji o niskiej częstotliwości.
- Kompleksowa analiza 279 wybranych genów.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia solidne podstawy do wykrywania mutacji w badaniach nad nowotworami.
- Sekwencjonowanie multipleksowe z kodowaniem kreskowym zwiększa efektywność analizy genetycznej.
- Podejście to może znacząco przyczynić się do strategii medycyny personalizowanej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Celowane sekwencjonowanie eksonów umożliwia działom R&D w sektorze biofarmaceutycznym wykrywanie niskoczęstotliwościowych mutacji somatycznych w heterogenicznych próbkach nowotworowych, co wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Dzięki zapewnieniu głębokiego pokrycia onkogenów i genów supresorowych, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych i dostarcza informacji niezbędnych dla strategii identyfikacji wiodących cząsteczek. Kompatybilność z materiałem FFPE ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez identyfikację mutacji sekwencyjnych, insercji, delecji oraz zmian liczby kopii w 279 genach związanych z nowotworami.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki wysokoczułemu wykrywaniu wariantów o niskiej częstotliwości w próbkach heterogenicznych.
- Wartość naukowa: Ułatwia wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wykrywanie wybranych rearanżacji strukturalnych oprócz mutacji punktowych.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane sekwencyjne na poziomie eksonów, umożliwiając standaryzowaną ocenę obciążenia mutacyjnego i częstotliwości allelicznej.
- Wartość operacyjna: Multipleksowanie z użyciem kodów kreskowych pozwala na równoległe przetwarzanie par guz-tkanka prawidłowa, co poprawia powtarzalność i przepustowość analizy.
- Wartość naukowa: Głębokie pokrycie zwiększa czułość wykrywania mutacji subklonalnych, wspierając wiarygodny screening związków w modelach istotnych dla danej choroby.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykrywa przyrosty i straty liczby kopii pomiędzy parami tkanek nowotworowych i prawidłowych, dostarczając informacji dla mechanistycznych modeli amplifikacji onkogenów lub utraty supresorów nowotworowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne monitorowanie zmian genetycznych w modelach przedklinicznych, wspierając decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka.
- Wartość naukowa: Dostarcza danych o mutacjach korelujących z odpowiedziami fenotypowymi, pomagając w dopasowaniu translacyjnych biomarkerów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, umożliwiając walidację celów terapeutycznych w oparciu o postawione hipotezy, przyczyniając się do identyfikacji wiodących związków poprzez profilowanie mutacji oraz wspierając prace przedkliniczne dzięki podłużnemu monitorowaniu genetycznemu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wykrywanie zmian somatycznych w genach związanych z nowotworami.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki niezbędne do standaryzacji testów i oceny związków w formatach multipleksowych.
- Analityka: Zapewnia liczbę odczytów specyficznych dla alleli oraz wnioskowania o liczbie kopii, co umożliwia statystyczne porównywanie różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkrywcze z ciągłością przedkliniczną poprzez wykrywanie mutacji korelujących z odpowiedzią na lek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przygotowanie bibliotek z kodami kreskowymi umożliwia ich ponowne wykorzystanie w wielu projektach i dla różnych typów nowotworów, maksymalizując wykorzystanie platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez wykrywanie rzadkich mutacji oraz zmian liczby kopii, które zostają pominięte w metodach o niskim pokryciu.
- Wartość operacyjna: Ustandaryzowany schemat postępowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego i multipleksowania poprawia powtarzalność oraz obniża koszt analizy pojedynczej próbki.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuowaniu lub przerwaniu badań poprzez wczesne ujawnianie czynników onkogennych oraz mechanizmów oporności na etapie odkryć.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o częstość występowania mutacji i ich wpływ funkcjonalny.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu bibliotek kwasów nukleinowych, wychwytywaniu opartym na hybrydyzacji oraz analizie danych z sekwencjonowania nowej generacji.
- Zależne od dostępu do platform sekwencjonowania masowo równoległego i biotynylowanych sond oligonukleotydowych do wzbogacania sekwencji docelowych.
- Wymaga standaryzowanych protokołów przetwarzania tkanek FFPE i świeżo zamrożonych w celu zapewnienia jakości DNA i wydajności biblioteki.
- Wymaga infrastruktury bioinformatycznej do mapowania, wykrywania wariantów oraz wnioskowania o liczbie kopii z danych sekwencjonowania.
- Wydajność jest ograniczona przez ilość i jakość wejściowego DNA, szczególnie w zdegradowanych próbkach FFPE, co wpływa na efektywność wychwytywania.
