Name: Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-03T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj metodę iniekcji igłowej do oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte. Technika ta umożliwia kontrolowane dostarczanie patogenu i badanie reakcji odpornościowych roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorowi Emirowi Islamoviciowi za pomoc laboratoryjną i szklarniową. Dziękujemy również dr Sherry Flint-Garcia za dostarczenie linii introgresji kukurydzy x teosinte.

1. Wzrost materiału roślinnego
<ol>
	<li>Wybierz linie roślin do inokulacji i badań przesiewowych. Do pracy wykorzystano dwie linie kukurydzy, pięć linii teosinte i czterdzieści linii kukurydzy x teosinte o niescharakteryzowanej odporności na U. maydis (Tabela 1).</li>
	<li>Nasiona roślin do eksperymentalnych (wstrzyknięcie U. maydis) i kontrolnych (wstrzyknięcie wody) eksperymentów inokulacji igłowej. Zrób to dla każdej linii roślin.</li>
	<li>Posadź cztery nasiona (powtórzenia) dla każdej linii roślin w małych mieszkaniach, wciskając nasiona na około 1/2 cala w glebę palcem i lekko przykrywając ziemią (rysunki 1A i 1B). Nie pakuj ziemi na nasiona. Sadzenie nasion głębiej lub pakowanie gleby na nasionach może powodować problemy ze wschodami sadzonek.</li>
	<li>Wlej nasiona do gleby. Upewnij się, że gleba jest przemoczona, a nasiona pozostają pod ziemią po podlaniu.</li>
	<li>Po podlaniu umieść rośliny w komorze wzrostowej ze środowiskiem dziennym i nocnym o temperaturze odpowiednio 28/20 °C i 14/10 godzinach fotoperiodu i około 500 μmol/m2 sek fotosyntetycznie aktywne promieniowanie na szczycie baldachimu. Utrzymuj wilgotność względną w dzień i w nocy na poziomie odpowiednio około 70% i 90%.</li>
	<li>Trzymaj wszystkie rośliny w tej samej komorze wzrostu, aby utrzymać środowisko wzrostu, które jest zgodne w całym eksperymencie.</li>
	<li>Po 10 dniach wyjąć rośliny z komory wzrostowej i zaszczepić rośliny kulturą zawiesiny komórek U. maydis metodą inokulacji igłowej. Uwaga: Rośliny kukurydzy można zaszczepić 7 dni po posadzeniu8-10. Jednak rośliny teosinte są zbyt małe po 7 dniach. Dlatego należy zaszczepić zarówno kukurydzę, jak i teosinte 10 dni po posadzeniu, aby zachować spójność w eksperymencie (patrz krok 2.12).</li>
</ol>
2. Inokulacja iniekcją igły
<ol>
	<li>Wszystkie prace wykonuj w okapie z przepływem laminarnym. Usuń zapasy glicerolu U. maydis z zamrażarki. Użyj sterylnej pętli i smug glicerolu szczepów U. maydis typu dzikiego 1/2 (typ krycia a1b1) i 2/9 (typ krycia a2b2, prawie izogeniczny do 1/2) na płytkach z agatorem z dekstrozą ziemniaczaną (PDA). Utrzymuj naprężenia oddzielnie.</li>
	<li>Umieść płytki PDA z prążkami U. maydis w inkubatorze w temperaturze 30 °C na dwa dni. W przypadku stosowania innego patogenu biotroficznego należy użyć odpowiedniego szczepu, pożywki i warunków wzrostu. Monitoruj wzrost patogenu przez okres dwóch dni, aby upewnić się, że szczep U. maydis dobrze rośnie.</li>
	<li>Po dwóch dniach należy wyjąć płytki PDA z inkubatora. Płytki powinny mieć dobry wzrost patogenów i zawierać pojedyncze kolonie (ryc. 2A). Ważne jest, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Jeśli pojedyncze kolonie nie są obecne, należy ponownie umieścić płytki w niższym stężeniu.</li>
	<li>Całą pracę wykonuj w okapie z przepływem laminarnym. Użyj sterylnej wykałaczki, aby wybrać pojedynczą kolonię dla każdego szczepu z płytek PDA. Umieść wykałaczkę zawierającą pojedynczą kolonię w 3 ml bulionu z dekstrozy ziemniaczanej (PDB). Zaleca się posiadanie 2-3 kultur.</li>
	<li>Umieścić 3 ml kultur PDB w inkubatorze/wytrząsarce o temperaturze 30 °C na dwa dni przy prędkości 200 obr./min. Monitoruj wzrost kultury w ciągu dwóch dni, aby zapewnić wzrost kultury. Kultura powinna wydawać się bardzo mętna.</li>
	<li>Wyjąć płynne kultury z inkubatora/wytrząsarki i zmierzyć stężenie przy OD600, aby upewnić się, że komórki zostały wyhodowane do OD 1,0 (~1 x 107 komórek/ml)17.</li>
	<li>Doprowadzić hodowle zawiesiny komórek U. maydis do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml, używając wody w końcowej objętości hodowli wynoszącej 30 ml. Stężenie to konsekwentnie skutkuje dobrym zakażeniem roślin kulturą zawiesiny komórek patogenu. 17 </li>
</ol>
Uwaga: Różne stężenia zawiesiny komórek powinny być testowane przy użyciu różnych szczepów patogenów, aby określić odpowiednie miano komórek potrzebne do inokulacji18,19. Podane końcowe stężenie dla hodowli zawiesiny komórkowej może być użyte jako punkt wyjścia do titteringu. Odpowiednie stężenie hodowli zawiesiny komórek patogenu należy zweryfikować poprzez wizualizację fenotypów roślin z dobrą infekcją (ryc. 3A-E).
<ol start="8">
	<li>Wymieszać równe objętości dwóch szczepów U. maydis przed inokulacją. W przypadku korzystania z jednego szczepu patogenu przejdź do kroku 2.9. Przygotuj świeże kultury zawiesinowe komórek U. maydis do każdego eksperymentu inokulacji i odrzuć kultury zawiesiny komórkowej po dwóch dniach.</li>
	<li>W celu eksperymentalnego zaszczepienia igłą należy napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml kulturą zawiesiny komórek U. maydis, wciągając kulturę zawiesiny komórkowej do strzykawki.</li>
	<li>W celu zaszczepienia igłą kontrolną należy napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml wodą17. Tę samą procedurę należy zastosować do eksperymentalnego zaszczepiania iniekcją igły.</li>
	<li>Założyć igłę podskórną o wymiarach 0,457 mm x 1,3 cm na końcu każdej strzykawki o pojemności 3 ml. Wybrany rozmiar igły dostarczy kulturę zawiesiny komórkowej między liśćmi rośliny przy minimalnym uszkodzeniu tkanki roślinnej.</li>
	<li>Usunąć rośliny doświadczalne i kontrolne z komory wzrostowej 10 dni po posadzeniu w ramach przygotowań do inokulacji iniekcyjnych igłami (Rysunek 2B) (patrz krok 1.7).</li>
	<li>Ostrożnie wprowadzić igłę podskórną zawierającą kulturę zawiesiny komórek U. maydis do łodygi rośliny doświadczalnej pod kątem 90° tuż nad linią gleby. Włóż igłę, aż znajdzie się w środku łodygi. Nie należy przepychać igły przez trzpień (Rysunek 2C).</li>
	<li>Wstrzyknąć do rośliny doświadczalnej około 100 μl kultury zawiesinowej komórek U. maydis 18,19. Będzie się to nieznacznie różnić w zależności od wysokości sadzonki. Kultura zawiesiny komórkowej przepchnie się przez łodygę i przejdzie do wiru rośliny. Hodowla zawiesiny komórkowej będzie widoczna w wirze rośliny. Kontynuować wstrzykiwanie 100 μl kultury zawiesiny komórkowej do każdej rośliny z osobna, aż strzykawka o pojemności 3 ml będzie pusta.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy ostrożnie usunąć igłę z łodygi rośliny. Wyjąć igłę z pustej strzykawki o pojemności 3 ml i napełnić ją wodą. Przymocować igłę z powrotem do strzykawki i przepchnąć wodę przez igłę, aby usunąć wszelkie tkanki roślinne, które mogą zostać uwięzione w końcówce igły.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.9-2.15 dla każdego zakładu doświadczalnego. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem dla roślin kontrolnych, wstrzykując wodę.</li>
	<li>Umieść zaszczepione rośliny doświadczalne i kontrolne z powrotem w komorze wzrostowej. Podlewaj rośliny codziennie, zwilżając glebę, a nie tkankę roślinną.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj rośliny, aby wykryć rozwój patogenów i reakcje odporności roślin.</li>
</ol>
3. Badanie przesiewowe reakcji oporności
<ol>
	<li>Oceń i zapisz reakcje odporności dla każdej rośliny 7, 10, 14 i 21 dni po inokulacji (dpi) przy użyciu skali oceny reakcji odporności od 1 do 5. Nasilenie choroby wzrasta wraz ze wzrostem wartości liczbowych na skali ocen (Tabela 2). Reakcja odporności 1C (chloroza liści), 1A (produkcja antocyjanów w liściach) lub 2 (małe galasy liściowe) wskazuje na odporność. Reakcja odporności na 3 (galasy łodygi), 4 (galas podstawowy) lub 5 (śmierć rośliny) wskazuje na podatność (ryc. 3A-E i tabela 2)18,19.</li>
	<li>Oceniaj zarówno rośliny doświadczalne, jak i kontrolne oraz rejestruj oceny odporności reakcji.</li>
	<li>Porównaj reakcje oporności w zakładach doświadczalnych i kontrolnych. Wybierz rośliny doświadczalne o wskaźniku reakcji odporności 1C, 1A lub 2. Rośliny te są uważane za odporne na U. maydis18,19.</li>
	<li>Powtórz cały eksperyment, aby zweryfikować fenotypy roślin.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crop+fungal+resistance+developed+using+genetic+engineering+and+antifungal+proteins+from+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses.</a> , ISB News. report 
 
 <a target="_blank" href="http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf">http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sher, A. F., MacNab, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSher%2C+AF+%22Vegetable+diseases+and+their+control%22">Vegetable diseases and their control</a>. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).</li>
<li>Crepet, W. L., Feldman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+earliest+remains+of+grasses+in+the+fossil+record%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Bot%22%5BJournal%5D)">The earliest remains of grasses in the fossil record.</a> Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).</li>
<li>Iltis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+evolution+and+agricultural+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Grass+systematic+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Maize evolution and agricultural origins.</a> Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).</li>
<li>Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+corn.+III.+Modern+races%2C+the+product+of+tesonite%5BTitle%5D)+AND+%22Bot.+Mus.+Leafl.%22%5BJournal%5D)">The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite.</a> Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).</li>
<li>Agrios, G. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+GN+%22Plant+Pathology%22">Plant Pathology</a>. , Academic Press. New York. (1997).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).</li>
<li>Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+beteen+Fusarium+verticillioides%2C+Ustilago+maydis%2C+and+Zea+mays%3A+An+endophyte%2C+a+pathogen%2C+and+their+shared+plant+host%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host.</a> Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).</li>
<li>Freeman, S., Rodriguez, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+assessing+pathogenicity+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp+niveum+and+F.+o.+melonis+on+cucrbits%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits.</a> Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).</li>
<li>Gottwald, T. R., Graham, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+precise+and+nondisruptive+stomatal+inoculation+of+leaf+tissue+with+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens.</a> Phytopathol. 82, 930-935 (1992).</li>
<li>Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+of+coffee+plants+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Asomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycolog.+Res%22%5BJournal%5D)">Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales).</a> Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).</li>
<li>Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+pathogenicity+genes+in+Ustilago+maydis+by+restriction+enzyme-mediated+intergratior+%28REMI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI).</a> Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).</li>
<li>Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+in+the+bW%2FbE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).</li>
<li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corn+smut+caused+by+Ustilago+maydis.+Monograph+number+2%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2.</a> , The American Phytopathological Society. (1963).</li>
<li>Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+tumors+caused+by+Ustilago+maydis+require+organ-specific+genes+in+host+and+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.%22%5BJournal%5D)">Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen.</a> Sci.. 328, 89-92 (2010).</li>
<li>Kamper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+maize+plants+expressing+the+Totivirus+antifungal+protein%2C+KP4%2C+are+highly+resistant+to+corn+smut%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut.</a> Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).</li>
<li>Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+regulatory+subunit+of+a+cAMP-Dependent+protein+kinase+is+required+for+gall+formation+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize.</a> , (1997).</li>
<li>Gold, S. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+two+chitin+syn-+thase+genes+in+the+phytopathogenic+fungus+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).</li>
<li>Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ustilago+maydis+as+a+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Ustilago maydis as a Pathogen.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).</li>
<li>Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems.</a> J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole-3-acetic+acid+%28IAA%29+biosynthesis+in+the+smut+fungus+Ustilago+maydis+and+its+relevance+for+increased+IAA+levels+in+infected+tissue+and+host+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation.</a> Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).</li>
<li>Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilaginales+as+Plant+Pests+and+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems.</a> Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).</li>
<li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Ustilago+maydis%2C+a+fungal+pathogen+that+induces+tumors+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize.</a> Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).</li>
<li>Keen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+plant+pathology%3A+a+retrospective+view+on+understanding+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu skuteczna okazała się metoda inokulacji igłowej zastosowana w celu dostarczenia szczepu U. maydis do łodygi 700 roślin kukurydzy i teosinte. Ponadto wykorzystano zmienioną skalę oceny odporności na choroby do badań przesiewowych roślin i wykrywania rozwoju patogenów. W wyniku zastosowania obu metod zidentyfikowano linie roślin odporne na U. maydis wśród 700 roślin kukurydzy i teosinte, które można teraz łączyć i testować w programach hodowlanych w celu zwiększenia odporności na choroby.</p...

Choroby grzybowe roślin stanowią jedno z największych zagrożeń dla rolnictwa. Potrzeba rozwoju upraw o zwiększonej odporności na choroby wzrasta ze względu na potrzeby żywnościowe rosnącej populacji świata. Patogeny roślin w naturalny sposób infekują rośliny uprawne na polu, powodując choroby, które negatywnie wpływają na plony6. Wykazano, że identyfikacja i wykorzystanie odpornych roślin może poprawić odporność i zmniejszyć straty plonów. Odporne odmiany zostały zidentyfikowane w wielu gatunkach roślin, w tym w kukurydzy, pszenicy, ryżu i sorgo, poprzez zaszczepienie roślin patogenem roślinnym i selekcję pod kątem odpornych linii7. W związku z tym opracowanie i zastosowanie skutecznej metody inokulacji pozwoliłoby na zaszczepienie wielu roślin i przeprowadzenie badań przesiewowych pod kątem odporności. Zastosowano różne metody inokulacji, w tym inokulację zanurzeniową, pipetowanie kultury zawiesiny komórek patogenu do wiru rośliny oraz inokulację igłową8-11. W przypadku każdej metody patogen musi być niezawodnie wprowadzony między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii, aby zapewnić rozwój patogenu i infekcję roślin12,13.
Metoda inokulacji zanurzeniowej polega na zanurzeniu sadzonki rośliny w hodowli zawiesiny komórek patogenu, podczas gdy metoda pipetowania wymaga umieszczenia kultury zawiesiny komórek patogenu w wirze sadzonki rośliny. Istnieją jednak problemy z obiema metodami. Po pierwsze, obie metody zależą od naturalnego przemieszczania się patogenu z powierzchni liścia do tkanki roślinnej, która jest bardzo zmienna. Większość patogenów naturalnie dostaje się do rośliny przez otwory szparkowe lub rany na powierzchni liści rośliny. Istnieje jednak znaczna zmienność w zdolności patogenów do przenikania przez powierzchnię liścia rośliny przez aparaty szparkowe i/lub rany na powierzchni liścia. W związku z tym penetracji patogenów nie można kontrolować za pomocą żadnej z metod inokulacji, co może prowadzić do niespójnych danych. Po drugie, w przypadku badań przesiewowych dużej liczby roślin, zanurzenie sadzonek w kulturze zawiesiny komórek patogenu może być czasochłonne i może ograniczyć liczbę roślin, które można przesiewać. I odwrotnie, opisany tutaj protokół inokulacji metodą iniekcji igłowej dostarcza kulturę zawiesiny komórek patogenu między liśćmi rośliny, ułatwiając tworzenie appressorii14. Następnie patogen wykorzystuje nowo opracowaną apresorię, aby dostać się do rośliny, eliminując problem z penetracją patogenu. Dodatkowo, protokół inokulacji metodą iniekcji igłowej zapewnia szereg fenotypów dla roślin kukurydzy i teosinte, które zostały zaszczepione U. maydis i wykazują dobrą infekcję. Fenotypy można wykorzystać jako marker do określenia najlepszego stężenia dla hodowli zawiesiny komórek patogenu, co skutkuje spójnymi fenotypami roślin w ramach różnych eksperymentów i pomiędzy nimi.
Po zaszczepieniu roślin kulturą zawiesiny komórek patogenu, rośliny są zazwyczaj badane w celu wykrycia opornego lub podatnego fenotypu8-11,15. Podczas gdy skale oceny chorób są szeroko stosowane do badań przesiewowych i klasyfikacji fenotypów roślin, skale oceny różnią się w zależności od analizowanego patogenu. W związku z tym w przypadku podobnych patogenów grzybowych można zastosować protokół skali oceny choroby dla interakcji U. maydis i kukurydzy16.
Obecna seria protokołów szczegółowo opisuje inokulację metodą iniekcji igłowej za pomocą hodowli zawiesiny komórek U. maydis oraz badanie przesiewowe reakcji odporności na choroby kukurydzy, teosinte i kukurydzy x teosinte linii introgresji. Obecne protokoły nie ograniczają się do inokulacji igłami U. maydis w roślinach kukurydzy, ale mogą być stosowane do stosunkowo każdego patogenu grzybowego i gatunku roślin. W związku z tym włączenie szczegółów obu metod do tego samego protokołu umożliwi naukowcom bezpośrednie wykorzystanie protokołów do inokulacji i badań przesiewowych lub manipulowanie oryginalnymi protokołami, aby lepiej dopasować patogeny i gatunki roślin będące przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Nasiona roślin</td><td></td><td></td><td>Zebrane z oryginalnych krzyżówek</td></tr><tr><td>Komora wzrostowa</td><td>Conviron</td><td>PGR14 REACH-IN</td><td></td></tr><tr><td>Mieszkania do sadzenia</td><td>Hummert International</td><td>14-3385-2</td><td></td></tr><tr><td>Gleba (3 części kory sosnowej; 1 część mchu torfowego z perlitem)</td><td>Hummert International</td><td>10-1059-2</td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Lab Conoco</td><td>70875372</td><td></td></tr><tr><td>Zapas glicerolu patogenu (U. maydis) lub patogenu grzybowego będącego przedmiotem zainteresowania</td><td></td><td></td><td>Zapasy wyhodowano z oryginalnej kultury</td></tr><tr><td>Sterylna pętla</td><td>Fisher Scientific S17356A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki z agarem z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)</td><td>Inkubator Fisher Scientific</td><td>R454311</td><td></td></tr><tr><td>ustawiony na 30 stopni C</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-650F</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne wykałaczki</td><td>Walmart</td><td></td><td>Zakupione w Walmart i sterylizowane w autoklawie</td></tr><tr><td>Rosół z dekstrozy ziemniaczanej (PDB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1008617</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator-wytrząsarka zestaw na 30 &deg; C</td><td>Nowy Brunszwik</td><td>14-278-179</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>4001000</td><td></td></tr><tr><td>U. maydis&nbsp; hodowla zawiesiny komórkowej (1 x 106 komórek/ml)</td><td></td><td></td><td>Wyhodowane z glicerolu zgodnie z opisem w</td></tr><tr><td>metodach Strzykawki 3 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> 309606,457 <td></td></tr><tr><td>mm x 1,3 cm Igły podskórne</td><td>Kendall Brands</td><td>8881250321</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka i skuteczna metoda oceny patogenności ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Kukurydza jest główną uprawą zbóż na całym świecie. Jednak podatność na patogeny biotroficzne jest głównym ograniczeniem zwiększającym produktywność. U. maydis jest biotroficznym patogenem grzybowym i czynnikiem wywołującym pleśń kukurydzianą na kukurydzy. Choroba ta jest odpowiedzialna za znaczne straty w plonach w wysokości około 1,0 miliarda dolarów rocznie w Stanach Zjednoczonych.1 Obecnie do zwalczania pleśni kukurydzianejstosuje się kilka metod, w tym płodozmian, stosowanie fungicydów i zaprawianie nasion. Jednak oporność żywiciela jest jedyną praktyczną metodą radzenia sobie z głownią kukurydzianą. Identyfikacja roślin uprawnych, w tym kukurydzy, pszenicy i ryżu, które są odporne na różne patogeny biotroficzne, znacznie zmniejszyła straty plonów rocznie3-5. W związku z tym zastosowanie metody inokulacji patogenów, która skutecznie i powtarzalnie dostarcza patogen między liście rośliny, ułatwiłoby szybką identyfikację linii kukurydzy odpornych na U. maydis. Pierwszym krokiem w kierunku identyfikacji linii kukurydzy odpornych na U. maydis było zastosowanie metody inokulacji metodą iniekcji igłowej oraz metody przesiewowej reakcji odporności w celu inokulacji kukurydzy, teosinte i linii introgresji kukurydzy x teosinte szczepem U. maydis oraz selekcji odpornych roślin.
Linie introgresji kukurydzy, teosinte i kukurydzy x teosinte, składające się z około 700 roślin, zostały zasadzone, zaszczepione szczepem U. maydis i przebadane pod kątem odporności. Metody inokulacji i badań przesiewowych z powodzeniem zidentyfikowały trzy linie teosinte odporne na U. maydis. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół inokulacji iniekcyjnej igłą i przesiewowego badania przesiewowego reakcji oporności dla linii introgresji kukurydzy, teosinte i kukurydzy x teosinte. Badanie to pokazuje, że inokulacja ikłująca igłą jest nieocenionym narzędziem w rolnictwie, które może skutecznie dostarczać U. maydis między liśćmi rośliny i zapewniło linie roślin odporne na U. maydis, które można teraz łączyć i testować w programach hodowlanych w celu poprawy odporności na choroby.

Poprawność inokulacji za pomocą wstrzykiwania igłą można określić poprzez wizualizację fenotypu roślin zainfekowanych U. maydis (grupa eksperymentalna). Większość roślin eksperymentalnych była podatna na infekcję U. maydis. Rośliny podatne wykazały bardzo ciężki przebieg choroby, objawiający się tworzeniem narośli na łodygach i w części przyziemnej z czarnymi teliosporami (Rysunki 3D i 3E, Tabela 2). Kilka roślin obumarło po inokulacji ze względu na cię...

Opisano użycie metody iniekcji igłą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis. Metoda inokulacji igłowej ułatwia kontrolowane dostarczanie patogenu grzybowego między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii. Metoda ta jest bardzo skuteczna, umożliwiając powtarzalne inokulacje U. maydis.

Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest inokulacja igłowa zawiesiny hodowli komórkowej kukurydzy USTA Lago oraz przeprowadzenie screeningu reakcji odporności na chorobę w liniach krzyżowych kukurydzy tete oraz kukurydzy teosinte. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzedni wybór linii roślin do inokulacji i screeningu. Następnie wysiewa się nasiona do eksperymentalnych i kontrolnych doświadczeń z inokulacją metodą wstrzykiwania igłowego.Po 10 dniach zawiesinę komórkową z U wstrzykuje się do łodygi każdej rośliny. Na koniec porównuje się reakcje odpornościowe roślin doświadczalnych i kontrolnych. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące pomyślną inokulację poprzez wstrzyknięcie igłą, wizualizując fenotyp rośliny inokulowanej you.Mais.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wprowadzenie patogenu bezpośrednio pomiędzy liście, co eliminuje problem penetracji patogenu. Aby rozpocząć, należy wybrać linie roślin do inokulacji i przesiewu; jak pokazano tutaj, w niniejszym badaniu do eksperymentalnych i kontrolnych doświadczeń z inokulacją za pomocą iniekcji igłą wykorzystano dwie linie kukurydzy, pięć linii teosinte oraz 40 linii krzyżowych kukurydzy i teosinte o niecharakteryzowanej odporności na U Mais.Posadź cztery nasiona każdej linii roślin w małych tackach, wciskając nasiona palcem na głębokość około pół cala w glebę i lekko przykrywając je ziemią. Następnie umieść rośliny w komorze wzrostowej i podlewaj nasiona do pełnego nasiąknięcia, upewniając się, że po podlewaniu pozostają one pod powierzchnią gleby. Hoduj rośliny w warunkach temperatury dziennej 28 °C i nocnej 20 °C, przy cyklach światła i ciemności wynoszących odpowiednio 14 i 10 godzin.I około 500 µmol m⁻² s⁻¹ promieniowania czynnego fotosyntetycznie (PAR) na górnej części korony roślin. Utrzymuj wilgotność względną w dzień i w nocy na poziomie odpowiednio około 70% i 90% oraz przechowuj wszystkie rośliny w tej samej komorze wzrostowej, aby zapewnić jednorodne środowisko wzrostu w trakcie całego eksperymentu. Osiem dni po wysianiu nasion, używając sterylnej pętlaki, wysew szczep z mrożonego banku glicerynowego na płytki z agarem ziemniaczano-dekstrozowym (PDA); inkubuj w temperaturze 30 °C przez dwa dni i regularnie monitoruj wzrost pod kątem prawidłowego rozwoju w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Za pomocą sterylnego wykałaczką należy pobrać pojedynczą kolonię każdego szczepu i przenieść je do probówek zawierających 3 ml bulionu PD. Kultury należy inkubować w temperaturze 30 °C i przy 200 RPM przez dwa dni, okresowo sprawdzając przyrost biomasy. Następnie należy zmierzyć OD 600 kultur, aby upewnić się, że osiągnęły one wartość OD 1,0.Używając wody, doprowadź kultury do końcowego stężenia 1 miliona komórek na mililitr w końcowej objętości 30 mililitrów. Takie stężenie zawiesiny komórek patogennych konsekwentnie zapewnia skuteczną infekcję roślin. Następnie, przed inokulacją, wymieszaj równe objętości przygotowanych dwóch szczepów.Przed napełnieniem strzykawki o pojemności 3 ml zawiesiną komórkową, należy napełnić strzykawkę kontrolną wodą, aby przeprowadzić wstrzyknięcie przy minimalnym uszkodzeniu rośliny. Do końcówki każdej strzykawki przymocuj igłę hipodermiczną o wymiarach 0,457 mm x 1,3 cm. Wyjmij rośliny z komory wzrostowej i wykonaj wstrzyknięcie pod kątem 90 stopni tuż nad linią gleby.Ostrożnie wprowadź igłę mikroszprycy do łodygi rośliny eksperymentalnej, aż znajdzie się ona w połowie jej długości. Wstrzyknij około 100 µL zawiesiny komórkowej. Płyn przejdzie przez łodygę i będzie widoczny podczas przemieszczania się w stronę rozety rośliny.Kontynuuj wstrzykiwanie do kolejnych roślin doświadczalnych, aż strzykawki zostaną opróżnione. Następnie napełnij strzykawkę wodą, aby oczyścić igłę z resztek tkanek roślinnych, i ponownie ją napełnij, aż wszystkie rośliny zostaną poddane iniekcji. W podobny sposób, używając strzykawki z wodą, wykonaj iniekcje w roślinach kontrolnych.Po zakończeniu iniekcji należy codziennie umieszczać rośliny z powrotem w komorze wzrostowej. Podlewać należy wyłącznie glebę, monitorując rozwój patogenu oraz reakcje odpornościowe roślin.Stosując skalę ocen odporności od jeden do pięciu, określ, oceń i zarejestruj reakcje odpornościowe każdej rośliny w 7., 10., 14. i 21. dniu po inokulacji (DPI). Wartości liczbowe w skali ocen rosną wraz ze wzrostem nasilenia choroby. Na przykład, reakcja odpornościowa A1C jeden A lub dwa wskazuje na odporność.Reakcja odporności na poziomie trzy, cztery lub pięciu wskazuje na podatność. Porównaj reakcje odporności roślin doświadczalnych i kontrolnych, a następnie wybierz rośliny doświadczalne z oceną reakcji odporności A1C jeden a lub dwa. Rośliny te uznaje się za odporne na matis.W tym eksperymencie większość roślin zaszczepionych humusem okazała się podatna na infekcję. Rośliny wykazały silny rozwój choroby, objawiający się tworzeniem narośli na łodygach i w obrębie podstawy z czarnymi teliosporami. Kilka roślin obumarło po inokulacji ze względu na ciężki przebieg choroby.W przeciwieństwie do nich, rośliny kontrolne były bardzo czyste i nie wykazywały rozwoju patogenu w żadnej części rośliny, co wskazuje, że rozwój patogenu u roślin doświadczalnych był wynikiem inokulacji poprzez wstrzykiwanie do igieł. Zidentyfikowano trzy linie agresyjne krzyżówek U Mais i Mais Teosinte, które były odporne na U Mais, a pomyślną inokulację zweryfikowano na podstawie niewielkiej sklerozy, produkcji cyjanu lub powstania niewielkich narośli liściowych. Technikę tę można przeprowadzić w sposób wysoce wydajny i powtarzalny. Ułatwia to inokulację oraz fenotypowanie dużej liczby roślin.

a-rapid-efficient-method-for-assessing-pathogenicity-ustilago-maydis

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Szybka i skuteczna metoda oceny patogeniczności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Tutaj prezentujemy protokół do testowania zjadliwości roślin z patogenem roślinnym Magnaporthe grisea. Raport ten przyczyni się do zakrojonych na szeroką skalę badań przesiewowych patotypów izolatów grzybów i posłuży jako doskonały punkt wyjścia do zrozumienia mechanizmów oporności roślin podczas hodowli molekularnej.

Test infekcji roślin: inokulacja w sprayu i za pośrednictwem ran patogenem roślinnym Magnaporthe Grisea

Ta praca opisuje klonowanie szczepu konia trojańskiego Ustilago maydis w celu dostarczania in situ wydzielanych białek kukurydzy do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.

Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Geny morfogeniczne roślin mogą być wykorzystane do poprawy genetycznej transformacji opornych genotypów. Opisano tutaj protokół transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium (QuickCorn) dla trzech ważnych publicznych linii wsobnych kukurydzy.

Transformacja niedojrzałych zarodków opornych linii wsobnych kukurydzy za pośrednictwem Agrobacterium przy użyciu genów morfogennych

To jest prosty protokół badania pochwy liści jęczmienia przy użyciu minimalnej ilości odczynników i zwykłego sprzętu laboratoryjnego (w tym podstawowego smartfona). Celem jest wizualizacja wczesnego procesu infekcji blastyczną w laboratoriach bez dostępu do zaawansowanego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja wczesnych miejsc infekcji choroby ryżu (Magnaporthe oryzae) na jęczmieniu (Hordeum vulgare) za pomocą podstawowego mikroskopu i smartfona

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Protokoły szybkiej oceny biologicznej wykorzystujące makrobezkręgowce bentosowe są często używane do monitorowania i oceny jakości wody. Skuteczny protokół obejmuje kolekcje wysięków poczwarkowych Chironomidae unoszących się na powierzchni (SFPE). Opisano tu techniki zbierania w terenie, obróbki laboratoryjnej, montażu szkiełek i identyfikacji Chironomidae SFPE.

Wykorzystanie pływających powierzchniowo wysięków poczwarkowych Chironomidae (Dipterae) jako protokołu szybkiej oceny biologicznej zbiorników wodnych

Dokładność i precyzja technik stosowanych do pomiaru emisji metanu od przeżuwaczy są niezwykle ważne dla powodzenia działań mających na celu ograniczenie emisji gazów cieplarnianych. W artykule opisano zasady i działanie zautomatyzowanego systemu do monitorowania przepływów masy metanu i dwutlenku węgla z oddechu przeżuwaczy.

Wykorzystanie zautomatyzowanego systemu (GreenFeed) do monitorowania emisji metanu i dwutlenku węgla w jelitach od przeżuwaczy

Poznaj metodę iniekcji igłowej do oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte. Technika ta umożliwia kontrolowane dostarczanie patogenu i badanie reakcji odpornościowych roślin.

Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Przeglądaj więcej filmów