Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte
3 stycznia 2014
Opisano użycie metody iniekcji igłą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis. Metoda inokulacji igłowej ułatwia kontrolowane dostarczanie patogenu grzybowego między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii. Metoda ta jest bardzo skuteczna, umożliwiając powtarzalne inokulacje U. maydis.
Ogólnym celem tej procedury jest inokulacja poprzez wstrzyknięcie igły, hodowla zawiesiny komórek USTA Lago maus oraz przeprowadzenie badania przesiewowego reakcji na chorobę labiryntu tete i labiryntu teosinte krzyżujących się z liniami. Osiąga się to poprzez wstępny wybór linii roślin do inokulacji i badań przesiewowych. Następnie wysiewane są nasiona do eksperymentalnych i kontrolnych eksperymentów z inokulacją igłową.
10 dni później zawiesinę komórek U wstrzykuje się do łodygi każdej rośliny. Na koniec porównano reakcje oporności w zakładach doświadczalnych i kontrolnych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują udaną inokulację igłą poprzez wizualizację fenotypu rośliny zaszczepionej tobą. Mais.
Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza patogen bezpośrednio między liście. Eliminuje to problem z penetracją patogenów. Aby rozpocząć wybór linii roślinnych do inokulacji i badań przesiewowych, jak pokazano tutaj, do tego badania wykorzystano dwie linie labiryntu, pięć linii teosinte i 40 linii krzyżowych labiryntu Teosinte z niescharakteryzowaną odpornością na U Mais do eksperymentalnych i kontrolnych eksperymentów inokulacji igłowej.
Posadź cztery nasiona z każdej linii roślin w małych mieszkaniach, wciskając nasiona palcem na około pół cala w ziemię i lekko przykrywając je ziemią. Następnie umieść rośliny w komorze wzrostowej i podlewaj nasiona, aż się nasiąkną, upewniając się, że po podlaniu pozostaną pod ziemią. Uprawiaj rośliny w środowisku dziennym i nocnym o temperaturze 28 i 20 stopni Celsjusza oraz odpowiednio 14 i 10-godzinnych cyklach światła i ciemności.
I około 500 mikromolów na metr kwadratowy na sekundę promieniowania aktywnego fotosyntetycznie na szczycie baldachimu. Utrzymuj wilgotność względną w dzień i w nocy na poziomie odpowiednio około 70% i 90% i utrzymuj wszystkie rośliny w tej samej komorze wzrostu, aby utrzymać środowisko wzrostu, które jest zgodne w całym eksperymencie. Osiem dni po posadzeniu nasion użyj sterylnej pętli, aby rozprowadzić huis z zamrożonego bulionu glicerolowego na agarze z dekstrozą ziemniaczaną lub płytkach PDA, inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni i regularnie monitorować, aby upewnić się, że dobrze rośnie pod okapem z przepływem laminarnym.
Użyj sterylnej wykałaczki, aby wybrać pojedynczą kolonię dla każdego szczepu i umieść je w trzech mililitrowych probówkach bulionu PD. Inkubuj kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez dwa dni, okresowo sprawdzając wzrost. Następnie zmierz OD 600 kultur, aby upewnić się, że zostały wyhodowane do OD 1,0.
Za pomocą wody doprowadź kultury do końcowego stężenia 1 miliona komórek na mililitr w końcowej objętości 30 mililitrów. Takie stężenie patogennej zawiesiny komórkowej konsekwentnie skutkuje dobrą infekcją roślin. Następnie, przed inokulacją, wymieszaj równe objętości dwóch, które zrobiłeś jako szczepy.
Przed napełnieniem trzymililitrowej strzykawki zawiesiną komórkową, należy napełnić strzykawkę kontrolną wodą do wstrzyknięcia przy minimalnym uszkodzeniu rośliny. Tkanka mocuje igłę podskórną w punkcie zerowym o wymiarach 457 milimetrów na 1,3 centymetra na końcu każdej strzykawki. Wyjmij rośliny z komory wzrostowej i wstrzyknij pod kątem 90 stopni tuż nad linią gleby.
Ostrożnie włóż igłę U maus w łodygę rośliny doświadczalnej, aż znajdzie się w środku łodygi. Wstrzyknąć około 100 mikrolitrów zawiesiny komórek. Przepchnie się przez łodygę i będzie widoczny, gdy wejdzie w wir rośliny.
Kontynuować wstrzykiwanie dodatkowych roślin doświadczalnych, aż do opróżnienia strzykawek. Następnie napełnij go wodą, aby oczyścić igłę z tkanki roślinnej i ponownie napełnij strzykawkę, aż wszystkie rośliny zostaną wstrzyknięte. Użyj strzykawki z wodą, aby wstrzyknąć rośliny kontrolne w podobny sposób.
Po zakończeniu wstrzyknięć. Codziennie umieszczaj rośliny z powrotem w komorze wzrostowej. Podlewaj tylko glebę i sprawdzaj rozwój patogenów i reakcje odporności roślin.
Korzystając z oceny reakcji odporności od jednego do pięciu, skaluj, oceniaj i rejestruj reakcje odporności dla każdej rośliny 7, 10, 14 i 21 dni po inokulacji lub DPI. Wartości liczbowe na skali oceny rosną wraz ze wzrostem ciężkości choroby. Na przykład reakcja rezystancji A1C jedna lub dwie wskazują na opór.
Trzy, cztery lub pięć reakcji oporności wskazuje na podatność. Porównaj reakcje oporności zakładów doświadczalnych i kontrolnych i wybierz zakłady doświadczalne o wskaźniku reakcji A1C jeden lub dwa. Rośliny te są uważane za odporne na matis.
W tym eksperymencie większość roślin zaszczepionych humusem była podatna na infekcję. Rośliny wykazywały poważny rozwój choroby, o czym świadczy tworzenie się łodyg i podstaw żółci z czarnymi zarodnikami telio. Kilka roślin było martwych po zaszczepieniu z powodu ciężkości choroby.
W przeciwieństwie do tego, rośliny kontrolne były bardzo czyste i nie wykazały rozwoju patogenu w żadnej części rośliny, co wskazuje, że rozwój patogenu w roślinach doświadczalnych był spowodowany inokulacją igłową U Mais zidentyfikowano trzy linie agresji krzyżowej Mais Teosinte, które były odporne na U Mais, a udana inokulacja została zweryfikowana przez niewielkie stwardnienie rozsiane, cyjan w produkcji lub drobne tworzenie się żółci liściowej. Technikę tę można wykonać w bardzo wydajny sposób z powtarzalnością. Pomaga to w inokulacji i fenotypowaniu dużej liczby roślin.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę iniekcji igłowej służącą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis. Technika ta pozwala na kontrolowane wprowadzenie patogenu, ułatwiając jego wnikanie do rośliny poprzez tworzenie apresoriów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fitopatologia
- Interakcje roślin z mikroorganizmami
- Techniki inokulacji grzybami
Wprowadzenie
- Ustilago maydis jest biotroficznym patogenem atakującym kukurydzę.
- Skuteczne metody inokulacji są kluczowe dla badania odporności roślin na choroby.
- Iniekcja igłowa zapewnia precyzyjną metodę wprowadzania patogenu.
- Zrozumienie reakcji roślin na patogeny może pomóc w opracowaniu strategii hodowlanych.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody inokulacji dla Ustilago maydis.
- Przesiewanie linii kukurydzy i teosinte pod kątem odporności na chorobę.
- Porównanie reakcji odpornościowych między roślinami eksperymentalnymi a kontrolnymi.
Zastosowane metody
- Wybór linii roślin do inokulacji i przesiewania.
- Sadzenie nasion dla grup eksperymentalnych i kontrolnych.
- Wstrzykiwanie zawiesiny komórek Ustilago maydis do łodygi każdej rośliny.
- Porównanie reakcji odporności roślin inokulowanych i kontrolnych.
Główne wyniki
- Metoda iniekcji igłowej pozwala na powtarzalne inokulacje.
- Wizualne fenotypowanie pozwala stwierdzić pomyślny przebieg inokulacji.
- Reakcje odpornościowe mogą być skutecznie oceniane pomiędzy różnymi liniami roślin.
- Metoda ta pogłębia zrozumienie oddziaływań między rośliną a patogenem.
Wnioski
- Metoda iniekcji igłą jest wydajna w badaniu Ustilago maydis.
- Zapewnia ona kontrolowane środowisko do oceny odporności roślin.
- Wyniki przyczyniają się do szerszego zrozumienia odporności na choroby u kukurydzy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładna ocena patogenności ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji linii upraw odpornych na choroby w biotechnologii rolniczej. Ta metoda iniekcji igłowej umożliwia powtarzalne wprowadzanie Ustilago maydis, wspierając walidację celów w badaniach nad interakcjami między rośliną a patogenem. Podejście to ułatwia screening fenotypowy oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w programach hodowlanych skoncentrowanych na odporności na patogeny biotroficzne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen poprzez kontrolowane dostarczanie patogenu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną inokulację w celu spójnego oceniania reakcji odpornościowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację linii odpornych do dalszej hodowli i walidacji cech.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wygenerowanie ilościowych ocen reakcji odpornościowych (skala 1-5) do badań fenotypowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne wprowadzanie patogenu pomiędzy liście roślin, co ogranicza zmienność wyników.
- Skalowalność: Metoda jest kompatybilna z wysokoprzepustową inokulacją dużych populacji roślin (np. 700 roślin).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy fenotypy odporności z liniami introgresji genetycznej w zastosowaniach hodowlanych.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Umożliwia selekcję odpornych linii teosinte oraz linii kukurydza-teosinte w celu kumulacji cech.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Wyjaśnia fenotypy podatności i odporności poprzez wizualną ocenę objawów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących mechanizmów odporności w liniach roślin przed etapami identyfikacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków poprzez izolację dostarczenia patogenu jako niezależnej zmiennej.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowany inokulum dla biologicznych układów gotowych do analizy.
- Analityka: Zapewnia uporządkowane oceny odporności (DPI 7,10,14,21) dla korelacji cech ilościowych.
- Badania translacyjne: Łączy reakcje odpornościowe z tłem genetycznym w liniach introgresyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny wielu szczepów patogenów w panelach zasobów genoplazmatycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w testach patogenności dzięki bezpośredniej iniekcji do łodygi.
- Wartość operacyjna: Eliminuje bariery penetracji patogenu, poprawiając powtarzalność infekcji.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność w ocenie odporności poprzez porównanie fenotypów eksperymentalnych i kontrolnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację linii odpornych z uwzględnieniem ryzyka w celu ich wprowadzenia do procesu hodowlanego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w jałowym przygotowywaniu kultur grzybów oraz w obchodzeniu się z roślinami.
- Zależność od wykorzystania sterylnych strzykawek i igieł w celu precyzyjnego przeprowadzenia inokulacji.
- Konieczność standaryzacji komory wzrostowej w celu zapewnienia powtarzalnych warunków środowiskowych.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych stadiów rozwojowych i genotypów roślin.
- Ograniczenie do możliwości zastosowania w iniekcjach łodygowych; metoda nieodpowiednia do testów patogeniczności specyficznych dla liści lub korzeni.
