Metody ekstrakcji białka całkowitego i elektroforezy żelowej 2D dla gatunków Burkholderia

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie dwuwymiarowej mapy proteomu bakteryjnego. Osiąga się to poprzez uprawę kultury bakterii i odzyskanie białek. Następnie odzyskane białka są rozdzielane w jednym wymiarze zgodnie z ich pH.

Poprzez ogniskowanie izoelektryczne po rozdziale w pierwszym wymiarze, białka są następnie rozdzielane w drugim wymiarze zgodnie z ich masą cząsteczkową. Na koniec żel drugiego wymiaru zostaje zabarwiony, a białka są wizualizowane. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące różnice w ekspresji białek za pomocą elektroforezy dwuwymiarowej.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu patogenezy bakteryjnej, takie jak: które białka są produkowane w określonych warunkach oraz w jaki sposób różnią się od siebie różne izolaty bakteryjne pod względem produkcji białek? Informacje te mogą pomóc w zidentyfikowaniu białek kandydackich, które mogą brać udział w wirulencji. Po wyhodowaniu 100 ml kultury mlecznej bur cold do fazy stacjonarnej, przenieś 35 ml do probówki do wirowania i wiruj przy 4 500 ×g i 4 °C przez 20 minut.

Resuspend osad w 35 mililitrach zimnego PBS i powtórz wirowanie. Po resuspensji osadu w jednym mililitrze zimnego PBS przenieś roztwór do sterylnej mikroprobówki o pojemności dwóch mililitrów i ponownie wiruj. Powtórz przemywanie w jednym mililitrze zimnego PBS, a następnie wiruj w temperaturze 4 °C przy 14 000 G przez jedną minutę, odrzuć nadsącz i dodaj jeden mililitr roztworu P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F; przenieś rozpuszczony osad do probówki z nakrętką o pojemności dwóch mililitrów zawierającej około 0,5 mililitra wstępnie wysterylizowanych szklanych kulek.

Następnie, w celu rozbicia komórek w pomieszczeniu chłodniczym, zastosuj mini bead beader trzy razy po jednej minucie, umieszczając próbkę na lodzie po każdej serii. Odwiruj przez jedną minutę przed przeniesieniem supernatantu do sterylnej polistyrenowej probówki o pojemności 5 ml. Aby zwiększyć wydajność, powtórz rozbijanie kuleczkami dwa razy, dodając kolejną porcję PBSEDTAPMSF. Pobierz próbki.

Następnie, po oznaczeniu ilości białka, przechowywać alikwoty o masie 200 µg w temperaturze -80 °C do momentu przystąpienia do pierwszego wymiaru. Elektroforezę izoelektryczną (IEF) rozpocząć od oczyszczenia uchwytów do pasków za pomocą roztworu czyszczącego. Następnie opłukać paski wodą Milli-Q.

Następnie pozostawić je odwrócone do góry nogami do wyschnięcia; po wyschnięciu przypisać każdą próbkę do numeru uchwytu pasków żelowych. Nanieść wcześniej przygotowaną próbkę białka o masie 200 microgram do bocznej studni uchwytu pasków, a następnie za pomocą pipety i czystej pęsety rozprowadzić próbkę wzdłuż uchwytu. Wyjąć paski żelowe z opakowania.

Następnie usuń warstwę ochronną z pasków żelowych, a potem ułóż je szorstką stroną do dołu, przesuwając powoli, aby zwilżyć paski od bieguna ujemnego do dodatniego. Aby zapobiec wypaleniu, umieść papier filtrujący zwilżony sterylną wodą na elektrodzie i pod paskami żelowymi. Usuń pęcherzyki powietrza i przykryj wszystko cienką warstwą oleju mineralnego, aby zapobiec wysychaniu.

Ustaw uchwyty pasków żelowych w urządzeniu do IEF. Próbki należy przeanalizować, korzystając z programu wymienionego tutaj. Żele można wyjąć w dowolnym momencie podczas ostatniego etapu.

Po zakończeniu programu wyjmij paski z uchwytów i, jeśli nie będą używane natychmiast, owiń je folią spożywczą i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia drugiej wymiarowości SDS-PAGE. Po złożeniu aparatury do odlewania żelu do SDS-PAGE, przygotuj roztwór żelu w kolbie z końcówką próżniową i mieszadełkiem magnetycznym, dodając 1,5 M bufor TRIS i wodę MCU, a następnie odgazuj roztwór przy umiarkowanej prędkości za pomocą próżni przez 20 minut. Po zakończeniu próżni dodaj 10% SDS do roztworu żelu, pipetując go po ściance kolby. Aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, dodaj następnie świeżo przygotowany siarczan amonu i TEMED, a następnie wymieszaj.

Wlej żel i poczekaj do jego zastygnięcia, a następnie rozpuść DTT w wcześniej przygotowanym roztworze równoważącym. Wyjmij paski z przechowywania w temperaturze -80 °C, rozwiń je i umieść paski IPG stroną z żelem do dołu w buforze, a następnie inkubuj przez 30 minut. Następnie do komory elektroforetycznej wlej 4,5 litrów buforu do elektroforezy.

Następnie, używając pęsety, wyjmij paski z roztworu równoważącego i osusz nadmiar buforu za pomocą ręcznika papierowego. Rozmontuj aparat do odlewania żelu i umyj szklane płytki ciepłą wodą. Po zastąpieniu wody na górnej powierzchni żelu buforem do elektroforezy, użyj czystej pęsety, aby położyć pasek na górnej części długiej płytki, stroną z żelem skierowaną w Twoją stronę.

Nasmaruj pasek buforem 1x i za pomocą plastikowego paska przesuń pasek IPG dalej w dół, dociskając go do żelu, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza pomiędzy paskiem a żelem. Na górną krawędź paska nałóż roztwór uszczelniający agarozowy, aby go unieruchomić. Następnie, po powtórzeniu tego procesu dla wszystkich pasków, opuść je do komory elektroforetycznej.

Po upewnieniu się, że poziom buforu 1x w komorze zewnętrznej znajduje się na wyznaczonym poziomie, zamocuj komorę górną. Umieść ramkę górnej komory buforowej na płytkach szklanych i dociśnij ją. Wlej bufor do elektroforezy 2x do komory górnej, aż do linii środkowej.

Następnie do komory zewnętrznej dolej bufor do elektroforezy 1x, aż osiągnie on górną linię. Nałóż pokrywę, a następnie włącz urządzenie do elektroforezy oraz zasilacz. Próbki inkubuj przez noc przy napięciu 52 V, natężeniu 96 mA i mocy 5 W.

Prowadź elektroforezę żeli do momentu, gdy linie czoła dotrą do odległości jednego centymetra od dolnej krawędzi. Po zakończeniu procesu wyjmij płyty z kasety. Po oddzieleniu żeli od szklanych płyt, utrwal je w roztworze jeden przez co najmniej jedną godzinę lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsius.

Następnie przenieś żele do drugiego roztworu utrwalającego i inkubuj na kołysarce przez jedną godzinę. Przemyj żele wodą Milli Q cztery razy po 15 minut. Następnie użyj roztworu azotanu srebra, aby barwić żele przez 30 minut lub do 48 godzin.

Po przemywaniu żeli przez minutę w wodzie Milli Q, przenieś je do roztworu wywoływującego, aż żel zostanie zabarwiony. Po upływie od pięciu do 30 minut, aby zatrzymać reakcję, przenieś żele do roztworu zatrzymującego na 10 minut. Przedstawiono tutaj żel zabarwiony błękitem Coomassie z ekstrakcjami białek całokomórkowych z ol dia multivorans.

Izolaty kliniczne hodowane w bulionie LB lub bulionie mannitolowym z drożdżami, zebrane w fazie stacjonarnej. Analiza porównawcza profili białkowych wyekstrahowanych z tych samych kultur bakteryjnych w dwóch różnych próbach wykazała podobne wzory prążków, co wskazuje na prawidłowy przebieg ekstrakcji białek. Na tej ilustracji analiza elektroforezy żelowej 2D dla 200 µg całkowitego białka z Bural dio, pseudo wykazuje obecność ponad 500 plamek, które mogą zostać indywidualnie zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak cytometria, w celu określenia różnic jakościowych i ilościowych między blisko spokrewnionymi izolatami bakteryjnymi. Ponadto, dzięki modyfikacji metody barwienia, badacze mogą zidentyfikować plamki białkowe poprzez wycięcie plamki i zastosowanie spektrometrii mas.