Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie testu na podłożu z łupin nasiennych w celu zbadania, w jaki sposób endosperm kontroluje kiełkowanie nasion u rabbit opsis w odpowiedzi na różne warunki środowiskowe, zarówno na poziomie genetycznym, jak i in vitro. Jest to realizowane poprzez wstępne, ostrożne wypreparowanie łupiny nasiennej i embrionu z nasion Arab Opsis przy użyciu igły strzykawki i pęsety ściętej. W drugim kroku wypreparowane łupiny nasienne są delikatnie przenoszone na podłoże do kiełkowania.

Następnie łupiny nasion układa się w jedną okrągłą warstwę. W ostatnim kroku zarodki rozmieszcza się w centrum przygotowanego łożka z łupin nasion. Również w formie pojedynczej okrągłej warstwy.

Endosperm odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu kiełkowania nasion w badanych przez nas nasionach ab autopsy. Test zginania łupiny nasiennej jest procedurą genetyczną in vitro służącą do identyfikacji molekularnych komponentów genetycznych szlaków sygnalizacyjnych działających w endospermie w celu kontroli kiełkowania nasion. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ szybka dyssekcja embrionów bez ich uszkodzenia jest wymagająca.

Ważnym czynnikiem jest również wiek materiału wyjściowego, ponieważ wraz z wiekiem nasiony mogą tracić zdolność do kontrolowania determinacji komórkowej. Należy rozpocząć od wsypania 50 do 60 µL dojrzałych, suchych nasion Arabidopsis do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Następnie do probówki należy dodać 1 ml 70% etanolu i mieszać nasiona w temperaturze pokojowej za pomocą wortexa ustawionego na 1200 RPM. Po 10 minutach probówkę należy wirować przez trzy sekundy przy 4 000 G, aby skoncentrować nasiona na dnie probówki.

Następnie za pomocą końcówki do aspiracji próżniowej ostrożnie odessać etanol, pozostawiając nasiona na dnie probówki. Teraz dodać jeden mililitr sterylnej wody destylowanej do nasion, a następnie mieszać nasiona przez kolejne 10 minut. Po ponownym odwirowaniu nasion, odessać nadsącz i dodać do probówki kolejny mililitr sterylnej wody destylowanej, dbając o to, aby strumień wody zawiesił nasiona homogenicznie w całej objętości probówki.

Następnie umieść probówkę w statywie, aby nasiona opadły na dno. Po około 30 sekundach ostrożnie odessij wodę, aby przygotować nasiona do wysiewu. Najpierw wlej 30 ml świeżo przygotowanej pożywki do kiełkowania o temperaturze 50 °C do szalki Petriego o średnicy 100 mm. Resuspenduj nasiona w 200 µl sterylnej wody destylowanej, a następnie za pomocą końcówki do mikropipety 1 ml przenieś je na powierzchnię pożywki do kiełkowania.

Odssać wodę otaczającą nasiona, a następnie pozostawić szalkę Petriego z nasionami bez przykrycia w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu dalszego suszenia. Po dwóch godzinach zamknąć szalkę Petriego, pozostawiając nasiona w komorze na kolejne 90 minut. Następnie umieścić stereomikroskop wewnątrz komory.

Nalej 30 ml pożywki do kiełkowania do kolejnej szalki Petriego o średnicy 100 mm, a następnie umieść na powierzchni pożywki dwa sąsiadujące ze sobą prostokątne, autoklawowane papierki watman o grubości 3 mm. Najtrudniejszym etapem tej procedury jest sekcja, ponieważ nasiono jest bardzo cienkie, w związku z czym należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić zarodka podczas wycinania nasiona chwyconego za pomocą sterylnej pęsety Dumont nr 5 z tępym czubkiem.

Przenieś nasiona na papiery, trzymając pęsetę zamkniętą. Delikatnie dociśnij pojedyncze nasiono do papieru. Następnie użyj końcówki igły do strzykawki insulinowej o rozmiarze 29 G, aby naciąć łupinę nasiona wzdłuż najdłuższej półosi głównej, jak najbliżej miejsca, w którym prowadnice łączą się z korzeniem.

Następnie za pomocą pęsety dociśnij nasiono do papieru. Ponownie, przykładając nacisk końcówką pęsety w miejscu najbliższym wierzchołkowi radikuli, aby uwolnić embrion z łupiny nasiennej w celu przygotowania testu na podłożu z łupin nasiennych. Najpierw umieść kawałek sterylnej siatki nylonowej o wymiarach 3,5 na 5 cm w kolejnej, świeżo zalanej szalce 100 mm z podłożem do kiełkowania.

Następnie za pomocą strzykawki delikatnie przesuń zarodki i łupiny nasienne na metalowe krawędzie pęsety i przenieś tkanki roślinne na nylonową siatkę. Używając pęsety i strzykawki, ułóż łupiny nasienne w pojedynczej okrągłej warstwie, dbając o to, aby znajdowały się one jak najbliżej siebie, a otwory w łupinach były skierowane ku górze. Następnie ułóż zarodki w pojedynczej okrągłej warstwie w centrum warstwy łupin nasiennych, upewniając się, że zarodki również znajdują się jak najbliżej siebie.

Na koniec inkubuj testy na podłożu z nasionami w warunkach ciągłego oświetlenia w temperaturze od 20 do 21 stopni Celsjusza, zgodnie z poprzednimi wynikami. Nasiona mutantów rabbit opsys niezdolnych do syntezy gier illin lub mutanty z niedoborem GA nie kiełkują po 80 godzinach od inhibicji nasion. W przeciwieństwie do tego i w dalszej zgodności z poprzednimi wynikami, usunięcie łupiny nasienna indukuje wzrost zarodka mutanta z niedoborem GA, chyba że w pożywce obecny jest kwas OB CIC lub BA, co sugeruje, że endosperm mutantów z niedoborem GA uwalnia BA w kierunku zarodka, aby zablokować jego kiełkowanie.

Na tym obrazie, 80 godzin po inhibicji nasion, przedstawiono test z podłożem z łusek nasiennych z embrionami mutantów z niedoborem GA na podłożu z 80 łusek nasiennych mutantów z niedoborem GA. Zgodnie z naszą hipotezą, łuski nasienne mutantów z niedoborem GA blokują wzrost embrionów mutantów z niedoborem GA. Tutaj przedstawiono test z podłożem z łusek nasiennych z embrionami mutantów z niedoborem GA hodowanymi na podłożu z łusek nasiennych mutantów z niedoborem GA, które ponadto nie posiadają zdolności do syntezy A BA; zgodnie z oczekiwaniami, 80 godzin po inhibicji nasion łuski nasienne mutantów nie są w stanie zablokować wzrostu embrionów mutantów z niedoborem GA.

Podobnie, zarodki mutantów z niedoborem GA, hodowane na podłożu z łupin nasion mutantów z niedoborem GA pozbawionych czynnika RGL2, również nie były w stanie zahamować wzrostu zarodków mutantów z niedoborem GA po zastosowaniu tej procedury. W celu zbadania interakcji genetycznych przy użyciu kąpieli w łupinach nasion można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza ekspresji genów z łupin nasion i zarodków wypreparowanych z nasion. Zatem po opanowaniu tej techniki powinna ona umożliwić badaczom w dziedzinie kiełkowania nasion zbadanie, w jaki sposób łupina nasion kontroluje wzrost zarodka w odpowiedzi na sygnały środowiskowe w naszym układzie.