Procedura mająca na celu zbadanie wpływu długotrwałego ograniczenia pokarmowego na poszukiwanie heroiny u szczurów abstynentów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie wpływu manipulacji środowiskowych, takich jak przewlekłe ograniczenie spożycia pokarmu, na nawrót poszukiwania heroiny u szczurów laboratoryjnych w warunkach zespołu odstawiennego. W tym celu najpierw chirurgicznie wprowadza się cewnik dożylny do żyły szyjnej szczura, aby umożliwić samodzielne podawanie heroiny po okresie rekonwalescencji. Szczury są poddawane treningowi samodzielnego podawania heroiny w komorach warunkowania operacyjnego przez okres 10 dni.

Kolejnym krokiem procedury jest faza abstynencji, podczas której szczury są transportowane do pomieszczenia dla zwierząt i poddawane okresowi ograniczonego lub nieograniczonego dostępu do pożywienia. Na koniec szczury są przenoszone z powrotem do komór warunkowania instrumentalnego w celu przeprowadzenia testu poszukiwania heroiny, w którym reakcje na dźwigni służącej do podawania heroiny skutkują aktywacją sygnału – światła i dźwięku – przy jednoczesnym braku podania heroiny. Ostatecznie u szczurów z chronicznie ograniczonym dostępem do pożywienia i historią samopodawania heroiny zaobserwuje się wyraźny wzrost poszukiwania heroiny w warunkach odstawienia, wynikający z ponownej ekspozycji na środowisko zażywania narkotyku oraz sygnały z nim związane.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak procedura przywrócenia (reinstatement), jest brak jawnego wygaszania operacyjnego, którego nie obserwuje się w przypadku ludzi. Co więcej, zastosowanie manipulacji przewlekłych zamiast ostrych pozwala na uzyskanie większej trafności teoretycznej w odniesieniu do kondycji ludzkiej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie uzależnień od substancji, takie jak wspólne mechanizmy neurologiczne leżące u podstaw zachowań poszukiwania narkotyków i pożywienia.

Cewniki przygotowuje się masowo i sterylizuje w autoklawie, aby można było ich używać przez dłuższy czas. W celu wykonania cewnika należy najpierw pociąć elastyczną rurkę na odcinki o długości 12 centymetrów. Za pomocą wykałaczki lub igły o rozmiarze 18 G należy nanieść małą kroplę silikonu na cewnik w odległości trzech centymetrów od jego końcówki.

Pozostawić krzem do wyschnięcia na 24 godziny przed autoklawowaniem; przed autoklawowaniem zegnąć długą rurkę kaniuli typu five-up pod kątem prostym względem plastikowej podstawki, tak aby służyła jako łącznik. W dniu operacji, w celu zmontowania cewników, nasunąć długi koniec rurki scholastic na zgiętą metalową rurkę kaniuli typu five-up, mniej więcej do połowy dystansu do plastikowej podstawki. Połączyć rurkę typu five-up za pomocą wężyka Tigon i stępionej igły 22G ze strzykawką o pojemności 1 mL wypełnioną sterylną solą fizjologiczną.

Przepłucz cewnik solą fizjologiczną, aby upewnić się, że przepływ nie jest zablokowany. Przed rozpoczęciem znieczul zwierzę, a następnie zgól i oczyść obszar prawego barku oraz głowy za pomocą alkoholu i środka do mycia chirurgicznego. Po nałożeniu żelu do oczu w celu zapobiegania ich wysychaniu, wstrzyknij penicylinę oraz sól fizjologiczną, aby chronić przed infekcją i odwodnieniem.

Po wyizolowaniu zewnętrznej żyły szyjnej z otaczających tkanek, odsłoń ją za pomocą standardowych technik. Wsuń zakrzywioną pęsetę pod żyłę, aby utrzymać ją w uniesieniu i lekkim naciągu. Wykonaj niewielkie nacięcie w kształcie litery V na żyle i utrzymaj je w pozycji otwartej.

Używając rozszerzacza naczyniowego, wprowadź krótki, trzycentymetrowy koniec cewnika do żyły w kierunku serca, aż silikonowa kropla znajdzie się w miejscu nacięcia. Przymocuj cewnik do żyły za pomocą trzech szwów: jednego tak caudalnie, jak to możliwe, drugiego tuż rostralnie od silikonowej kropli oraz trzeciego tak rostralnie, jak to możliwe.

Przepuść sól fizjologiczną przez cewnik, aby upewnić się, że pozostaje on drożny, a szwy nie są zbyt ciasne. Następnie ułóż szczura brzuchem do dołu. Wykonaj nacięcie w okolicy głowy i wprowadź hemostat, aby oddzielić skórę od leżącej pod nią tkanki i utworzyć kieszeń podskórną.

Przesuń hemostat pod skórą w kierunku otworu na barkach, w którym wprowadzono cewnik. Przebij tkankę łączną i ściśle zaklemuj cewnik w najbardziej rostralnym punkcie poniżej podstawy piętego otworu. Odłącz pięty otwór, a następnie przeprowadź długi koniec cewnika pod skórą i wyprowadź go przez nacięcie znajdujące się na szczycie głowy.

Używając nożyczek, przetnij cewnik poniżej miejsca zacisnięcia kleszczyków hemostatycznych i ponownie przymocuj długi koniec do urządzenia five up. Przesuń cewnik wzdłuż metalowego trzpienia five up aż do plastikowej podstawki, a następnie przepuść sól fizjologiczną, aby upewnić się, że przepływ jest swobodny. Po zamknięciu ran szwami, umieść szczura w aparacie stereotaktycznym.

Gdy odsłonięta czaszka jest już czysta i sucha, należy za pomocą wiertła ręcznego wywiercić od czterech do pięciu otworów w jej powierzchni. Następnie w otworach należy umieścić śruby maszynowe, które będą pełnić funkcję rusztowania dla nakładki na głowę. Pomiędzy śrubami należy umieścić konektor pięciopolowy, a nadmiar długości cewnika wsunąć do wcześniej przygotowanej kieszonki podskórnej.

Na koniec należy użyć cementu dentystycznego, aby przymocować pięć elektrod do górnej części czaszki. Po całkowitym wyschnięciu cementu należy wyjąć szczura z aparatu stereotaktycznego i monitorować jego stan do pełnego powrotu do zdrowia. Szczury są kwaterowane indywidualnie w komorach warunkowania operacyjnego.

Umieszczone w wyciszonych komorach wyposażonych w wentylator. Dwie chowane dźwignie zamontowano dziewięć centymetrów nad podłogą na prawej ścianie bocznej, z lampką sygnałową nad każdą z dźwigni. Moduł dźwiękowy znajduje się nad aktywną dźwignią, a czerwona lampka ogólna jest umieszczona w górnej części środka lewej ściany bocznej.

Pożywienie i woda są dostępne ad libitum. Pompa do podawania leku jest podłączona do cewnika za pomocą obrotowego złącza cieczowego i rurek tigon zabezpieczonych metalową sprężyną. Samopodawanie heroiny rozpoczyna się po rekonwalescencji po zabiegu chirurgicznym i 24-godzinnym okresie habituacji.

Na początek należy przepłukać cewnik roztworem heparyny i gentamycyny. Następnie należy podłączyć złącze pięciostronne do rurki Tigon i zamocować metalową sprężynę. Każdą sesję należy rozpoczynać na początku fazy ciemnej od wysunięcia dźwigni aktywnej i nieaktywnej, a także od zapalenia światła w pomieszczeniu i aktywacji kompleksu sygnałów dźwiękowych światła Q.

Przez 30 sekund szczury mogą samodzielnie podawać sobie heroinę przez 10 dni, w ramach trzech trzygodzinnych sesji oddzielonych trzygodzinnymi odstępami. Reakcje na dźwigni aktywnej skutkują aktywacją pompy z lekiem i rozpoczęciem 22-sekundowego okresu oczekiwania, podczas którego światło w pomieszczeniu zostaje wyłączone, a kompleks sygnału świetlno-dźwiękowego Q nad dźwignią aktywną zostaje aktywowany. Reakcje na dźwigni nieaktywnej są rejestrowane, lecz nie niosą za sobą żadnych zaprogramowanych konsekwencji.

Po zakończeniu treningu samopodawania wyjmij szczury z komór warunkowania operacyjnego i umieść je w oddzielnych klatkach w pomieszczeniu dla zwierząt, zapewniając im nieograniczony dostęp do pokarmu i wody. Następnego dnia, podczas jednego dnia wypłukiwania leku, ogranicz ilość pokarmu grupie z restrykcją pokarmową, aby rozpocząć okres abstynencji, utrzymując jednocześnie nieograniczony dostęp do pokarmu w grupie sytej. Test poszukiwania leku przeprowadź rano w dniu abstynencji.

W 14. dniu należy ponownie umieścić szczury w komorach warunkowania instrumentalnego i przymocować je do metalowej sprężyny. Przeprowadza się sesję trwającą jedną lub trzy godziny, podczas której reakcje na dźwignię aktywną i nieaktywną wywołują takie same konsekwencje jak w treningu samopodawania, z wyłączeniem dostępności leku. Wyniki te wykazują, że masa ciała pozostaje stabilna w trakcie podawania heroiny.

Trening samopodawania W okresie abstynencji szczury z nieograniczonym dostępem do paszy zwiększają masę ciała, natomiast u osobników z ograniczonym dostępem do pożywienia masa ciała spada o około 10 do 15%. Jak widać tutaj, liczba infuzji i reakcji na aktywną dźwignię wzrosła w dniach treningu, podczas gdy reakcje na dźwignię nieaktywną nie uległy zmianie. Po okresie abstynencji reakcje na aktywną dźwignię u szczurów z ograniczonym dostępem do pożywienia znacząco wzrosły w porównaniu do szczurów sytych. Jednocześnie reakcje na dźwignię nieaktywną są minimalne i porównywalne między grupami po zastosowaniu tej procedury.

Do celowania w konkretne układy neurochemiczne i farmakologiczne można zastosować inne metody, takie jak iniekcje wewnątrzczaszkowe, mikrodializa, western blotting oraz techniki immunohistochemiczne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać jasne zrozumienie sposobu chirurgicznego implantowania cewnika dożylnego do żyły szyjnej szczura, a także sposobu przeprowadzania procedury samopodawania heroiny w standardowych komorach warunkowania instrumentalnego.