Name: Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji mutacji DNA w komórkach hematopoetycznych z wykorzystaniem modelu transgenicznego myszy LacI. Technika ta umożliwia analizę częstości i typów mutacji spontanicznych oraz indukowanych genotoksynami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Davidowi R. Rodriguezowi, M.A. za projekt graficzny i zdjęcia w tym rękopisie. Prace te były wspierane przez fundusze z GCCRI, NIH/NIA (5R21AG033339) oraz Cancer Center Support Grant (P30CA054174) dla UTHSCSA Flow Cytometry Core facility i UTHSCSA Advanced Nucleic Acids Core Facility.

<ol><li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability%2C+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).</li>
<li>Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability%3A+a+mechanistic+view+of+its+causes+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences.</a> Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).</li>
<li>Milyavsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+DNA+damage+response+in+human+hematopoietic+stem+cells+reveals+an+apoptosis-independent+role+for+p53+in+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal.</a> Cell. Stem Cell. 7 (2), 186-197 (2010).</li>
<li>Mohrin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+quiescence+promotes+error-prone+DNA+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis.</a> Cell. Stem Cell. 7 (2), 174-185 (2010).</li>
<li>Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+polymerase+chain+reaction-based+cell+free+in+vitro+non-homologous+end+joining+assay+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells.</a> PLoS ONE. 7 (3), (2012).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+and+accelerated+DNA+repair+mediates+resistance+of+hair+follicle+bulge+stem+cells+to+DNA-damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death.</a> Nat. Cell Biol. 12 (6), 572-582 (2010).</li>
<li>Prasher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+hematopoietic+reserves+in+DNA+interstrand+crosslink+repair-deficient+Ercc1-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice.</a> EMBO J. 24 (4), 861-871 (2005).</li>
<li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447 (7145), 725-729 (2007).</li>
<li>Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulating+defect+of+mismatch+repair-deficient+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells.</a> Blood. 102 (5), 1626-1633 (2003).</li>
<li>Carney, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-related+myelodysplastic+syndrome+and+acute+myeloid+leukemia+following+fludarabine+combination+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy.</a> Leukemia. 24 (12), 2056-2062 (2010).</li>
<li>Jankowska, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+excision+repair+dysfunction+in+a+subgroup+of+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome.</a> Leukemia. 22 (3), 551-558 (2008).</li>
<li>Tam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment-related+myelodysplasia+following+fludarabine+combination+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy.</a> Haematologica. 91 (11), 1546-1550 (2006).</li>
<li>Webb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeroderma+pigmentosum%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Xeroderma pigmentosum.</a> BMJ. 336 (7641), 444-446 (2008).</li>
<li>Ben-Yehuda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellite+instability+and+p53+mutations+in+therapy-related+leukemia+suggest+mutator+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype.</a> Blood. 88 (11), 4296-4303 (1996).</li>
<li>Casorelli, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+treatment+in+the+development+of+mismatch+repair+defective+acute+leukemia+and+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome.</a> DNA Repair. 2 (5), 547-559 (2003).</li>
<li>Olipitz, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+DNA-mismatch+repair%3A+a+potential+mediator+of+leukemogenic+susceptibility+in+therapy-related+myelodysplasia+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia.</a> Genes Chrom. Cancer. 34 (2), 243-248 (2002).</li>
<li>Haase, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+prognostic+impact+of+the+karyotype+in+MDS+and+correlation+with+subtypes%3A+evidence+from+a+core+dataset+of+2124+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients.</a> Blood. 110 (13), 4385-4395 (2007).</li>
<li>Kohler, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+spontaneous+and+induced+mutations+in+transgenic+mice+using+a+lambda+ZAP%2FlacI+shuttle+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector.</a> Environ. Mol. Mutagen. 18 (4), 316-321 (1991).</li>
<li>Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralaboratory+optimization+and+standardization+of+mutant+screening+conditions+used+for+a+lambda%2FlacI+transgenic+mouse+mutagenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay.</a> 327 (1-2), 57-66 (1995).</li>
<li>Jakubczak, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+instability+during+mammary+tumor+progression+using+a+novel+selection-based+assay+for+in+vivo+mutations+in+a+bacteriophage+lambda+transgene+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (17), 9073-9078 (1996).</li>
<li>Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Escherichia+coli-derived+mutation+detected+with+the+Big+Blue+cII+mutant+selectable+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51 (4), 344-348 (2010).</li>
<li>Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+nonsense+sites+in+the+lacI+gene+with+specific+codons+in+the+nucleotide+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence.</a> Nature. 274 (5673), 770-775 (1978).</li>
<li>Provost, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+in+vivo+mutation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for in vivo mutation analysis.</a> Mutat. Res. 288 (1), 133-149 (1993).</li>
<li>Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+spontaneous+mutagenesis%3A+an+analysis+of+the+spectrum+of+spontaneous+mutation+in+the+Escherichia+coli+lacI+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene.</a> J. Mol. Biol. 189 (2), 273-284 (1986).</li>
<li>Schaaper, R. M., Dunn, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+mutation+in+the+Escherichia+coli+lacI+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene.</a> Genetics. 129 (2), 317-326 (1991).</li>
<li>Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ENU-induced+mutagenesis+at+a+single+A%3A+T+base+pair+in+transgenic+mice+containing+phi+X174%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174.</a> Mutat. Res. 292 (1), 69-81 (1993).</li>
<li>Valentine, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mutant+spectra+generated+by+a+forward+mutational+assay+for+gene+A+of+Phi+X174+from+ENU-treated+transgenic+mouse+embryonic+cell+line+PX-2%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2.</a> Environ. Mol. Mutagen. 39 (1), 55-68 (2002).</li>
<li>Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+galactose-sensitive+E.+coli+strains+as+selective+hosts+for+LacZ-+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids.</a> Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6674), 193-197 (2000).</li>
<li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Stratagene, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpack+packaging+extract+for+lambda+transgenic+shuttle+vector+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Instruction+manual%22%5BJournal%5D)">Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery.</a> Instruction manual. , (2001).</li>
<li>Stratagene, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecoverEase+DNA+isolation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Instruction+manual%22%5BJournal%5D)">RecoverEase DNA isolation kit.</a> Instruction manual. , (2009).</li>
<li>Stratagene, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Big+Blue+transgenic+mouse+mutagenesis+assay+system%5BTitle%5D)+AND+%22Instruction+manual%22%5BJournal%5D)">Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system.</a> Instruction manual. , (1992).</li>
<li>Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+validation+of+the+Big+Blue+transgenic+mouse+mutagenesis+assay%3A+the+mutational+spectrum+of+ex+vivo+pinpoint+mutant+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Muta.+Res%22%5BJournal%5D)">Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques.</a> Muta. Res. 372 (1), 97-105 (1996).</li>
<li>Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+analysis+of+lacI+mutations+in+sectored+plaques+from+Big+Blue+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice.</a> Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).</li>
<li>Bielas, J. H., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+is+necessary+for+both+repair+and+mutation+in+transgenic+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11391-11396 (2000).</li>
<li>Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+spontaneous+somatic+mutations+and+sectored+plaques+detected+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice.</a> Mutat. Res. 373 (2), 277-284 (1997).</li>
<li>de Boer, J. G., Glickman, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lacI+gene+as+a+target+for+mutation+in+transgenic+rodents+and+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli.</a> Genetics. 148 (4), 1441-1451 (1998).</li>
<li>Piegorsch, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+design+and+sample+sizes+for+a+lacI+transgenic+mouse+mutation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 25 (3), 231-245 (1995).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Lin%28-%29Sca1%28%2B%29kit%28%2B%29CD34%28%2B%29Flt3-+short-term+hematopoietic+stem+cells+capable+of+rapidly+reconstituting+and+rescuing+myeloablated+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients.</a> Blood. 105 (7), 2717-2723 (2005).</li>
<li>Hilbe, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHilbe%2C+JM+%22Negative+Binomial+Regression.+second+edn%22">Negative Binomial Regression. second edn</a>. , Cambridge University Press. (2011).</li>
<li>de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+mutation+in+lacI+transgenic+mice%3A+a+comparison+of+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues.</a> Mutagenesis. 13 (2), 109-114 (1998).</li>
<li>Huffman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+approximation+to-sample+poisson+test%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Stat%22%5BJournal%5D)">An improved approximation to-sample poisson test.</a> Appl. Stat. 33 (2), 224-226 (1984).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Test mutagenezy in vivo opisany w niniejszym dokumencie opiera się na transgenicznym modelu myszy LacI , pierwotnie wygenerowanym przez Kohlera i wsp.18 Model ten wykorzystuje wektor fagowy λ przenoszący gen reporterowy lacI . Dwa miejsca cos otaczające wektor pozwalają na stosunkowo proste odzyskanie, a następnie upakowanie w zakaźne cząstki fagowe, używane do infekowania E. coli. Niebieska blaszka zostanie wygenerowana przez zakażone fagami E. coli </...

W większości tkanek zróżnicowane komórki mają ograniczoną długość życia. Aby zachować integralność funkcjonalną, długowieczne, specyficzne tkankowo komórki macierzyste w sposób ciągły wytwarzają komórki progenitorowe, które z kolei dają początek w pełni zróżnicowanym komórkom wymaganym do funkcjonowania tej konkretnej tkanki. Komórki macierzyste uzupełniają również swój własny przedział w procesie zwanym samoodnawianiem. W ten sposób komórki macierzyste są odpowiedzialne za utrzymanie integralności funkcjonalnej tkanki, w której się znajdują. Dlatego konieczne jest, aby były one wyposażone w solidne mechanizmy wykrywania i potencjalnej naprawy uszkodzonego DNA. Jeśli nie, mogą nabyć wiele zaburzeń genomowych (potencjalnie szkodliwych), które mogą być dziedziczone przez ich potomstwo. Zrozumienie, w jaki sposób komórki macierzyste chronią swój genom podczas życia organizmu, jest ważnym pytaniem i może pomóc nam zrozumieć, dlaczego niestabilność genomu jest powiązana z rakiem i niektórymi innymi chorobami związanymi z wiekiem (przegląd w1,2).
Kontrolowanie integralności genomowej tkanki na poziomie komórek macierzystych lub wczesnych populacji komórek progenitorowych można osiągnąć poprzez eliminację wadliwych komórek macierzystych (lub progenitorowych) poprzez śmierć komórki, starzenie się lub różnicowanie, i/lub poprzez efektywną naprawę uszkodzonego DNA. Ostatnie badania wykazały, że możliwe jest zmierzenie niektórych rodzajów naprawy DNA bezpośrednio w tych rzadkich populacjach3-6. Stwierdzono, że np. w układzie krwiotwórczym pęknięcia dwuniciowego DNA mogą być naprawiane przez rekombinację homologiczną (HR) lub niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), przy czym ten ostatni jest procesem naprawczym o mniejszej wierności, a tym samym zwiększonym ryzyku popełnienia błędów. Oba są wykorzystywane w hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC)4,5, jednak u myszy wydaje się, że jest to głównie NHEJ w HSC, podczas gdy wczesne komórki progenitorowe wykorzystują HR4. Podobną obserwację poczyniono w odniesieniu do komórek macierzystych w skórze6. Co ciekawe, w ludzkich HSC HR, a nie NHEJ, wydaje się być mechanizmem naprawczym z wyboru w przypadku pęknięć podwójnej nici3. Nie wiadomo jeszcze, czy ta funkcjonalna różnica między tymi dwoma gatunkami jest prawdziwa, czy też stanowi jedynie różnicę technologiczną lub eksperymentalną.
Repertuar komórek macierzystych do naprawy uszkodzonego DNA prawdopodobnie obejmuje inne mechanizmy naprawy DNA, takie jak naprawa przez wycinanie zasady (BER), naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) i naprawa niedopasowania (MMR). BER i NER są odpowiedzialne za naprawę zmian jednej lub wielu par zasad w jednoniciowym DNA, podczas gdy MMR naprawia niedopasowania zasada-zasada i pętle insercji/delecji; tego typu uszkodzeń DNA nie mogą być naprawione przez NHEJ lub HR. Na poparcie tego poglądu przemawia kilka badań z zakresu układu krwiotwórczego wykazujących związek między zmianami w jednym z tych szlaków a nieprawidłowościami w przedzialeHSC 7-9, a także zwiększone ryzyko rozwoju zespołu mielodysplastycznego10-16, choroby wywodzącej się z HSC i związanej z rosnącą niestabilnością genomu w miarę postępu choroby17. Jak dotąd nie zgłoszono pomiarów BER, NER i MMR bezpośrednio w HSC.
Oprócz wyjaśnienia różnych procesów kontrolujących integralność tkanek na poziomie mechanistycznym, konieczne jest możliwość zmierzenia stopnia zmutowanego DNA, aby można było przetestować konsekwencje aberracji w jednym z tych procesów, np. w normalnych kontra genetycznie modyfikowanych komórkach macierzystych lub u starych kontra młodych. Jednak opracowanie odpowiedniego testu jest trudne ze względu na niedostatek komórek macierzystych specyficznych dla tkanek i brak warunków hodowli, które zachowują "macierzystość". Co więcej, taki test powinien być przystosowany do manipulacji środowiskowych i genetycznych. Możliwym rozwiązaniem tych ograniczeń i wymagań jest wykorzystanie modeli mysich, które są specjalnie zaprojektowane do wykrywania mutacji DNA.
Opracowano wiele modeli myszy transgenicznych do wykrywania mutacji. Na przykład transgeniczne myszy LacI 18 są nosicielami odzyskiwalnego wektora fagowego λ kodującego system reporterowy LacI, w którym gen LacI koduje supresor operatora Lac i służy jako reporter mutacji. Po mutacji genu LacI aktywowany jest operator Lac i wytwarzana jest β-galaktozydaza. β-galaktozydaza rozszczepia chromogenny substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-e-indolilo-β-D-galaktopiranozyd), który zmienia kolor na niebieski. Miejsca cos flankujące wektor LacI umożliwiają łatwe odzyskiwanie przez białka fagowe lambda i późniejsze zakażenie E. coli. Po inkubacji zakażonej E. coli na agarozie, która zawiera substrat X-gal, można ocenić płytki nazębne. Niebieskie blaszki zawierają przypuszczalnie zmutowanego faga Lac-I, podczas gdy przezroczyste blaszki są siedliskiem niemutantów. Częstotliwość występowania niebieskich blaszek (wśród tych przezroczystych) wskazuje na częstość mutacji w pierwotnej populacji komórek, z której wyekstrahowano DNA. Co więcej, λ, w którym znajduje się cel LacI, może być łatwo sekwencjonowany przy użyciu technik PCR w celu przeprowadzenia analizy o stosunkowo wysokiej przepustowości. Sekwencjonowanie wielu zmutowanych genów LacI ujawni ważne informacje na temat spektrum mutacji, co z kolei może wskazywać na możliwe braki w określonych szlakach naprawy DNA lub na określone zdarzenia genotoksyczne. System transgeniczny LacI został ustandaryzowany w wielu laboratoriach19, a odczynniki są dostępne na rynku. Jedną z głównych wad systemu LacI jest ograniczona zdolność do wykrywania dużych delecji lub rearanżacji; dlatego należy zastosować inne metody, np. wielobarwne FISH na spreadach metafazowych, aby uzupełnić ten niedobór.
W wektorze fagowym λ mysiego modelu LacI, znajduje się znacznie mniejszy gen, CII, dostępny do analizy mutacji. Jego rozmiar i fakt, że mutanty mogą być selekcjonowane, sprawiają, że jest to mniej pracochłonny i tańszy test20 niż analiza genu LacI. Jednak gen LacI jest szerzej badany pod kątem mutagenezy21, a wrażliwość genu na mutacje została dobrze scharakteryzowana, tak aby można było jasno zrozumieć reszty aminokwasowe, które generują odpowiedź fenotypową na podłożu chromogennym22-25.
Inne modele myszy do wykrywania mutacji obejmują użycie transgenów ΦX174 lub LacZ. Transgeniczny model myszy ΦX174, z oryginalnym testem mutacji rewersyjnej A:T→G:C26 lub testem mutacji do przodu27, który umożliwia wykrycie spektrum podstawień par zasad, reprezentuje mniej kosztowny system niż model LacI. Jednak badanie przesiewowe mutacji w teście naprzód nie jest trywialne, a spektrum mutacji transgenu ΦX174 nie jest tak dobrze scharakteryzowane jak w przypadku LacI. W modelach mysich przenoszących transgeny LacZ, reporter mutacji LacZ jest odzyskiwany przy użyciu komórek gospodarza E. coli, które są wrażliwe na galaktozę i pożywkę zawierającą galaktozę28. Wadą tego systemu jest to, że odzyskiwanie celu LacZ obejmuje również trawienie endonukleazy restrykcyjnej, a następnie ligację i elektroporację gospodarzy E. coli, co utrudnia dostosowanie systemu do małej liczby komórek. Chociaż nie jest to bezwzględny wymóg do pracy z populacjami komórek macierzystych/progenitorowych (zawsze można zacząć od większej liczby myszy), jeśli wymagana jest duża liczba komórek (np. miliony lub więcej), szybko stanie się to niepraktyczne i zbyt kosztowne. Ponadto, stosunkowo duży rozmiar LacZ, choć zapewnia czuły reporter mutacji, jest kłopotliwy i bardziej kosztowny dla analizy sekwencji DNA i określania widm mutacji. Główną zaletą tego modelu jest jednak jego zdolność do wykrywania dużych delecji i insercji, a także rearanżacji chromosomów.
Ponieważ wszystkie komórki w transgenicznych modelach myszy LacI, ΦX174 i LacZ posiadają system reporterowy, każdy z tych modeli myszy może być użyty do pomiaru mutagenezy w dowolnym typie komórek, w tym w komórkach macierzystych i progenitorowych, o ile mogą być niezawodnie zebrane i w wystarczającej liczbie. Ponieważ mieliśmy duże doświadczenie z mysim modelem LacI i testem mutacji LacI, zdecydowaliśmy się kontynuować badania nad tym systemem w celu analizy mutagenezy w populacjach krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych.
Tkanka krwiotwórcza jest dobrze scharakteryzowana pod względem fenotypu powierzchni komórek poszczególnych jej składników, w tym długotrwałych komórek macierzystych, które można zidentyfikować jako niezwykle rzadką populację komórek Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK)/ Flk2-CD150+CD48- komórek29. Mohrin i wsp.4 wykazały, że nieco większa populacja komórek LSK/Flk2- jest nadal dobrymi przedstawicielami HSC i znacznie różni się od najbardziej prymitywnej populacji zaangażowanych przodków szpiku (CMP), jeśli chodzi o badanie naprawy DNA. Co więcej, gdy komórki LSK wzbogacone w HSC (Flk-2+ i Flk-2-) porównano z Lin-IL7R-Sca-1-cKit++ (komórki progenitorowe LS-K), nadal istniała znacząca różnica w zdolności NHEJ5 między mniej czystą, wzbogaconą w komórki macierzyste populacją LSK a komórkami progenitorowymi. W naszym badaniu używamy komórek LSK (Flk-2+ i Flk-2-) wzbogaconych w HSC, ponieważ stwierdziliśmy, że co najmniej 2 x 105 komórek jest wymaganych do spójnych, wiarygodnych wyników w tym teście mutagenezy; ta liczba komórek jest niezwykle trudna do uzyskania, gdy sortuje się populację LSK/Flk2-CD150+CD48, a nawet populację LSK/Flk2- (pod względem myszy, kosztów i praktyczności). Protokół ten, oparty na protokole pierwotnie opracowanym przez Kohlera i wsp.18 opisuje szczegółowo, w jaki sposób można określić częstość spontanicznych mutacji DNA w komórkach LSK i zdefiniowanych populacjach zróżnicowanych komórek szpikowych, a także nierozdzielonych komórek szpiku kostnego i śledziony.

<table><tbody><tr><td>LacI myszy transgeniczne&nbsp;</td>Zestaw do izolacji <td>DNA BioReliance Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RecoverEase, w tym koktajl rybonukleazy RNace-It</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>720202</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt opakowaniowy Transpack, w tym pomarańczowe i niebieskie probówki transpack oraz SCS-8 E. coli</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>200221</td><td></td></tr><tr><td>Standardy wielkości DNA &ndash; drabinka lambda</td><td>Bio Rad</td><td>170-3635</td><td></td></tr><tr><td>0,025 mM Membrany o wielkości porów&nbsp;</td><td>Fisher (Millipore)</td><td>VSWP 025 00</td><td></td></tr><tr><td>245 mm2 Naczynia do testów biologicznych (tace)&nbsp;</td><td>Fisher (Corning)</td><td>07-200-600</td><td></td></tr><tr><td>Bulion NZY (proszek)</td><td>Fisher (Teknova)</td><td>N1144</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Fisher</td><td>AC34843-5000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Research Products Intl Corp (RPI)</td><td>B71800-10.0</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Roche</td><td>3-115-852</td><td></td></tr><tr><td>Przedłużacz PCR Zestaw polimerazy Taq</td><td>5 PRIME</td><td>2200500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman/Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja mutacji dna w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

W ostatnich latach stało się jasne, że niestabilność genomu jest ściśle związana z wieloma zaburzeniami rozwojowymi, nowotworami i starzeniem się. Biorąc pod uwagę, że komórki macierzyste są odpowiedzialne za zapewnienie homeostazy i naprawy tkanek przez całe życie, uzasadnione jest postawienie hipotezy, że populacja komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności genomowej tkanek. W związku z tym pojawiło się duże zainteresowanie oceną wpływu czynników endogennych i środowiskowych na integralność genomową komórek macierzystych i ich potomstwa, mając na celu zrozumienie etiologii chorób pochodzenia komórek macierzystych.
Myszy transgeniczne LacI noszą odzyskiwalny wektor fagowy kodujący system reporterowy LacI, w którym gen LacI służy jako reporter mutacji. Wynikiem zmutowanego genu LacI jest produkcja β-galaktozydazy, która rozszczepia substrat chromogenny, zmieniając jego kolor na niebieski. System reporterowy LacI jest przenoszony we wszystkich komórkach, w tym w komórkach macierzystych/progenitorowych, i może być łatwo odzyskany i wykorzystany do późniejszego zakażenia E. coli. Po inkubacji zakażonej E. coli na agarozie, która zawiera właściwy substrat, można naciąć blaszki; niebieskie blaszki wskazują na zmutowany gen LacI, podczas gdy przezroczyste blaszki są siedliskiem typu dzikiego. Częstość występowania niebieskich (wśród przezroczystych) blaszek wskazuje na częstość mutacji w pierwotnej populacji komórek, z której wyekstrahowano DNA. Sekwencjonowanie zmutowanego genu LacI pokaże lokalizację mutacji w genie i rodzaj mutacji.
Model myszy transgenicznej LacI jest dobrze znany jako test mutagenezy in vivo. Co więcej, myszy i odczynniki do testu są dostępne w handlu. Tutaj szczegółowo opisujemy, w jaki sposób model ten można dostosować do pomiaru częstości spontanicznie występujących mutantów DNA w komórkach macierzystych wzbogaconych komórkami macierzystymi komórkami macierzystymi Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) i innych subpopulacjach układu krwiotwórczego.

Test mutagenezy in vivo mierzy rzadkie zdarzenia (mutanty PFU) spośród wielu wszystkich zdarzeń (wszystkie PFU). Przy przeprowadzaniu testu na małej liczbie komórek istnieje możliwość, że wynik będzie w znacznym stopniu pod wpływem wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Aby rozwiązać ten problem, przeprowadziliśmy eksperyment z rozcieńczeniami seryjnymi niefrakcjonowanych komórek szpiku kostnego, pobranych od trzech różnych zwierząt. Zmierzyliśmy częstotliwość mutacji w szpiku kostnym tych zwierząt, w...

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

identifying-dna-mutations-purified-hematopoietic-stemprogenitor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych komórkach macierzystych/prekursorowych krwiotwórczych

Test tworzenia kolonii (CFC) to badanie in vitro, w którym komórki progenitorowe krwiotwórcze tworzą kolonie w podłożu półstałym. Do oceny zdolności progenitorów do proliferacji i różnicowania się wzdłuż różnych linii krwiotwórczych wykorzystuje się kombinację analizy morfologii kolonii, morfologii komórek oraz cytometrii przepływowej.

Test tworzenia kolonii (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Wzorce mutacji somatycznych w komórkach odzwierciedlają wcześniejszą ekspozycję mutagenną i mogą ujawnić pokrewieństwo linii rozwojowej. Przedstawiono metodologię katalogowania i analizy mutacji somatycznych w poszczególnych krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych.

Charakterystyka ładunku mutacyjnego i składu klonalnego krwi ludzkiej

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Poznaj metodę identyfikacji mutacji DNA w komórkach hematopoetycznych z wykorzystaniem modelu transgenicznego myszy LacI. Technika ta umożliwia analizę częstości i typów mutacji spontanicznych oraz indukowanych genotoksynami.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Przeglądaj więcej filmów