Name: Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę izolacji triacyloglicerydów z wydzielin łojowych nietoperzy przy użyciu preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF. Technika ta umożliwia analizę profili lipidowych pełniących rolę sygnałów chemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pomoc została udzielona przez Scotta Treece'a, Katelyn Arter, Jeremy'ego Ragsdella, Tony'ego LaMarka Jamesa, Amy Fischer, Hannah Blair i Cheyenne Gerdes podczas rozwoju metod laboratoryjnych. Serdecznie dziękujemy Laboratorium Medina-Bolivar (Luis H. Nopo-Olazabal; Arkansas Biosciences Institute) w celu uzyskania pomocy w densytometrii skaningowej TLC. MALDI-TOF MS wykorzystany w tym projekcie został dostarczony za pośrednictwem NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiative P3 Center (EPS-0701890) w Instytucie Nauk Biologicznych w Arkansas. Finansowanie zostało zapewnione przez U.S. Fisheries and Wildlife Service/Arkansas State Wildlife Grant, National Speleological Society oraz The Center for North American Bat Research and Conservation na Indiana State University.

UWAGA: Uzyskaj z wyprzedzeniem wszystkie wymagane pozwolenia stanowe i federalne na obchodzenie się, transport i przechowywanie nietoperzy. Zgody należy również uzyskać od instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, a także od instytucjonalnego komitetu ds. bezpieczeństwa biologicznego. W przypadku kontaktu z żywymi nietoperzami (lub tkankami układu nerwowego) osoby zajmujące się zwierzętami powinny być zaszczepione przeciwko wściekliźnie. Nietoperze użyte w obecnym badaniu zostały zebrane z Ozark St. Francis National Forest, AR, latem 2010 r. zgodnie ze standardowymi metodami (zatwierdzenie Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Stanowego Arkansas # 135349-1)28.
1. Leczenie tkanek i ekstrakcja lipidów
<ol>
	<li>Oczyść wszystkie narzędzia metanolem przed i między pobraniem tkanek od różnych osób. Przyciąć włosy (ok. 1,0 g) ze skóry nożyczkami i umieścić w kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Pobrać próbkę sebum z powierzchni skrzydła, szorując skórę 4-6 wacikami zwilżonymi rozpuszczalnikiem chloroform:metanol (C:M; 3:2 v/v) i umieścić je w osobnej kolbie.</li>
	<li>Ekstrahować tkankę za pomocą 10 ml C:M (2:1 v/v) zawierającego 0,5% butylowanego hydroksytoluenu (BHT), aby zapobiec utlenianiu29. Używaj wyłącznie rozpuszczalników o jakości HPLC.</li>
	<li>Po 2 godzinach dodać około 0,5 g bezwodnego siarczanu do każdej kolby, krótko wymieszać i zebrać rozpuszczalnik, filtrując przez bibułę filtracyjną.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.2 i 1.3 dwukrotnie. Raz z 1:1 C:M i sekwencyjnie z 1:2 C:M. Basen filtruje się razem.</li>
	<li>Odparować połączone filtraty pod strumieniemN2, oznaczyć suchą masę i rozpuścić pozostałość lipidową w stosunku 3:2 C:M (z 0,5% BHT) do stężenia 10 mg/ml. Próbkę przechowywać w szklanych fiolkach w temperaturze -20 °C. Ogólnie rzecz biorąc, najlepiej jest analizować próbki w ciągu jednego miesiąca po pobraniu próbki i zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
2. Separacja lipidów metodą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej przemyte rozpuszczalnikiem probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, napełniając je roztworem o temperaturze 3:2 C:M, spłukując acetonem i susząc na powietrzu. Ma to na celu usunięcie plastyfikatorów, które mogą zakłócać późniejszą analizę spektrometrii mas. Probówki z próbkami należy przechowywać w pojemniku bezpyłowym i obchodzić się z nimi wyłącznie w rękawiczkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu olejkami skórnymi.</li>
	<li>Aktywuj płytkę TLC, najpierw wstępnie ją rozwijając w stosunku 3:2 C:M. Dodaj wystarczającą ilość rozpuszczalnika do komory TLC na głębokość 1 cm, a następnie umieść płytkę w komorze (zamknij szklaną pokrywką) i pozwól, aby rozpuszczalnik całkowicie spłynął do górnej części płytki. Trwa to około 45 minut.</li>
	<li>Wyjąć płytkę i wysuszyć w dygestorium do momentu odparowania rozpuszczalnika (około 15 min), a następnie umieścić w piekarniku na co najmniej 10 minut w temperaturze 120 °C. Umieścić ołówek na górze płytki, aby zachować orientację podczas nakładania próbek. Umieść prostą linię ołówkiem, 1,5 cm od dolnej krawędzi płytki, aby zaznaczyć linię bazową, w której zostanie umieszczona próbka i wzorce.</li>
	<li>Przygotuj komorę TLC, wycinając kawałek bibuły filtracyjnej wystarczająco duży, aby wyłożyć dwie krótkie ścianki i jedną długą ścianę. Umieść wkładkę z bibuły filtracyjnej w komorze. Całkowicie zwilży się po dodaniu rozpuszczalnika do komory.</li>
	<li>Przygotować 100 ml rozpuszczalnika fazy ruchomej, którym jest heksan: eter dietylowy: kwas octowy (H:E:A; 80:20:2 v/v/v). Wlej rozpuszczalnik do komory, aby uzyskać głębokość około 1 cm. Przykryj szklaną pokrywą, używając silikonowej uszczelki smarowej wzdłuż górnej krawędzi komory. Pozwól komorze zrównoważyć się przez noc przed użyciem.</li>
	<li>Próbkę nanieść ręcznie na przygotowaną płytkę za pomocą rurki kapilarnej lub pipety w postaci ciągłej smugi od około 1,5 cm od jednej krawędzi do 1,5 cm do drugiej krawędzi. Preferowany jest automatyczny aplikator próbki, ponieważ ładuje on próbkę w bardziej jednorodnej smugi. Użyj zewnętrznych pasów płytki TLC, aby wykryć około 20 μl mieszaniny sterolu, FFA, TAG i wzorców estrów steroli (stosować w stężeniu 10 mg/ml; można uzyskać gotowe mieszanki).</li>
	<li>Umieścić załadowaną płytkę TLC w zrównoważonej komorze, zamknąć pokrywką i rozwijać płytkę, aż rozpuszczalnik dotrze do górnej krawędzi. Trwa to około 45 minut z opisaną tutaj fazą ruchomą. Wyjąć płytkę z komory i pozostawić nadmiar rozpuszczalnika do odparowania z płytki w dygestoriach przez około 1 minutę.</li>
	<li>Spryskaj 0,05% rodaminą 6G w 95% etanolu. Wizualizuj pasma lipidowe pod lampą ultrafioletową o dużej długości fali. Zaznaczyć ołówkiem położenie Rf dla pasm fluorescencyjnych rozwiązanych w próbce i wzorcach. W tym momencie można wykonać dokumentację fotograficzną.</li>
	<li>Zidentyfikuj pasmo odpowiadające wzorcowi TAG i usuń je z płytki, zeskrobując krzemionkę szpatułką na duży kawałek papieru do ważenia szkła. Przenieść krzemionkę do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej przemytej rozpuszczalnikiem.</li>
	<li>Dodać 1,0 ml rozpuszczalnika 3:2 C:M do probówki z próbką, sonikować przez 1 minutę, osadzać krzemionkę przez odwirowanie, a następnie przenieść rozpuszczalnik do nowej, wstępnie zważonej probówki. Powtórzyć poprzedni krok, zebrać filtraty i odparować rozpuszczalnik pod strumieniemN2.</li>
	<li>Wysuszoną pozostałość zawierającą TAG należy przechowywać w ciemności podN2 w temperaturze 4 °C, podczas gdy dodatkowe próbki tkanek są rozdzielane metodą TLC. Rodamina 6G jest obecna w próbkach, ale jest nierozpuszczalna w heksanie i jest usuwana podczas rozpuszczania próbki bezpośrednio przed analizą MS.</li>
</ol>
3. Analiza TAG przez MALDI-TOF MS
<ol>
	<li>Przygotować świeży roztwór matrycy kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA), rozpuszczając 10 mg CHCA w 1 ml rozpuszczalnika (49,5% etanolu, 49,5% acetonitrylu i 1% wodnego 0,1% TFA).</li>
	<li>Przygotować hormon adnerczynikotropowy (ACTH; 18-39 clip, 2465.1989 Da) do badania rozdzielczości i czułości instrumentu, mieszając 1 μl ACTH (1 mg/ml) z 39,5 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) w celu otrzymania roztworu podstawowego o stężeniu 10 pmol/μl. Można go przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Przygotować świeży roboczy roztwór ACTH (1 pmol/μl), pobierając 1 μl roztworu podstawowego o stężeniu 10 pmol/μl, mieszając z 9 μl 0,1% TFA, a następnie mieszając (1:1) z 10 μl roztworu matrycy CHCA w celu uzyskania stężenia 500 fmol/μl.</li>
	<li>Przygotować wzorce TAG w stężeniu 10 mg/ml w proporcji 3:2 C:M do kalibracji przyrządu MALDI (np. trikapryna [470,361 Da], trikaprylina [554,455 Da], trilauryna [638,549 Da], tripalmityna [722,642 Da], tripalmityna [800,689 Da], trimyrystyna [806,736 Da], trioleina [884,783 Da], tri-11-eikozenoina [968,877 Da] i trierucyna [1052,971 Da]).</li>
	<li>Przygotować trioleinę w stężeniu 10 mg/ml w proporcji 3:2 C:M do zewnętrznej kalibracji wzorca TAG do kalibracji masy zamka.</li>
	<li>Przechowywane próbki TAG rozpuścić w heksanie do roztworu o stężeniu 10 mg/ml.</li>
	<li>Przygotować 0,5 M (77,06 mg/1,0 ml) roztwór podstawowy kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) z 90% metanolem do użycia jako próbka i matryca wzorcowa. Przygotuj również 1,0 M (2,0 g/50,0 ml) roztwór NaOH. Przykryj rurkę roztworem DHB za pomocą folii aluminiowej w celu ochrony przed światłem.</li>
	<li>Wymieszać (we wstępnie umytych probówkach) 10,0 μl matrycy DHB, 10,0 μl próbki lub wzorca i 5,0 μl 1,0 M NaOH. Wymieszaj i krótko odwiruj probówkę, aby doprowadzić mieszaninę do dna.</li>
	<li>Umieścić 1,0 μl wzorca, próbki lub ACTH na płytce celowniczej MALDI ze stali nierdzewnej i umieścić w eksykatorze do wyschnięcia. Umieść tabliczkę celowniczą w przyrządzie w celu uzyskania danych.</li>
	<li>Wykonaj analizy MALDI-TOF MS w trybie dodatniego reflektronu. Nastroić i skalibrować przyrząd zgodnie z opisem producenta przyrządu przy użyciu standardowych roztworów ACTH i TAG.</li>
	<li>Zdobądź widma dla każdej próbki dostrzeżonej na płycie celowniczej (zgodnie ze specyfikacją instrumentu; parametry dla tej pracy to szybkostrzelność lasera 5 Hz, ~100 strzałów na plamkę, aby uzyskać średnie widmo). Po wygładzeniu i odjęciu tła od widm MALDI, przetwarzaj piki jonów ręcznie za pomocą wyszukiwarki internetowej MAPY LIPIDOWE (<a href="http://www.lipidmaps.org/tools/ms/glycerolipids_batch" target="_blank">www.lipidmaps.org/tools/ms/glycerolipids_batch</a>).</li>
	<li>Skopiuj i wklej widma listy do pola lista jonów prekursorowych i intensywności. Ogranicz wyszukiwanie do pożądanego składu acylowego. Zidentyfikuj TAG na podstawie stosunku masy/ładunku (m/z) od jonów obecnych w widmie dla każdej próbki. Jeśli zawartość procentowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) jest dostępna z oddzielnej analizy GC/MS, dodaj te dane, aby uzyskać prawdopodobieństwo obecności TAG.</li>
</ol>
INSTRUMENT: Spektrometr masowy używany w tym badaniu to Waters MALDI Micro MX (wyposażony w laser 337 nm 20 Hz N2). Można użyć dowolnego przyrządu MALDI z możliwością dodatniego trybu odbicia. Ogólne ustawienia to napięcie impulsu, 2 000 V; reflektor, 5 200 V; źródło, 15 000 V, z akwizycją danych za pomocą oprogramowania MassLynx (wer. 4.0). Takie warunki pracy zapewniają rozdzielczość masową większą niż 12 000.

<ol><li>Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+fate+and+selective+utilization+of+major+FAs+in+human+sebaceous+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland.</a> Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).</li>
<li>Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+surface+lipids+of+man+compared+with+those+of+eighteen+species+of+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals.</a> Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).</li>
<li>Desbois, A. P., Smith, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+free+fatty+acids%3A+activities%2C+mechanisms+of+action+and+biotechnological+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).</li>
<li>Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+water+loss+and+lipids+of+the+stratum+corneum+in+Dusky+Antbirds%2C+a+lowland+tropical+bird%5BTitle%5D)+AND+%22Condor%22%5BJournal%5D)">Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird.</a> Condor. 109 (1), 59-66 (2007).</li>
<li>Catala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+very+long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+in+the+pineal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).</li>
<li>Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+epidermal+lipid+composition+and+skin+morphology+of+animal+skin+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo.</a> European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).</li>
<li>Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sebaceous+gland+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Dermato-Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Sebaceous gland lipids.</a> Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).</li>
<li>Ro, B. I., Dawson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sebaceous+gland+activity+and+scalp+microfloral+metabolism+in+the+etiology+of+seborrheic+dermatitis+and+dandruff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff.</a> Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).</li>
<li>Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+skin+sebum+and+elasticity+level+in+patients+with+sulfur+mustard-induced+dermatitis+and+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls.</a> Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).</li>
<li>Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pharmaceutical+concepts+for+sebaceous+gland+diseases%3A+implementing+today%27s+pre-clinical+data+into+tomorrow%27s+daily+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today's pre-clinical data into tomorrow's daily clinical practice.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).</li>
<li>Horton, H. R., Moran, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorton%2C+HR+%22Principles+of+Biochemistry%22">Principles of Biochemistry</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. (1993).</li>
<li>Fahy, E., Subramaniam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+classification+system+for+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive classification system for lipids.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).</li>
<li>Fahy, E., Subramaniam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+LIPID+MAPS+comprehensive+classification+system+for+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids.</a> Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF-MS+directly+combined+with+TLC%3A+A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Chromotagraphia%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state.</a> Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).</li>
<li>Savary, B. J., Vasu, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSavary%2C+BJ+%22Recombinant+Gene+Expression%2C+Reviews+and+Protocols%22">Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols</a>. Lorence, A. , 3rd, Humana Press. New York, NY. (2011).</li>
<li>Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+fragmentation+observed+in+the+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometric+analysis+of+triacylglycerols+in+vegetable+oils%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).</li>
<li>Fuchs, B., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).</li>
<li>Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+lipid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research.</a> Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).</li>
<li>Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+wavelength+in+high-irradiance+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+organic+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules.</a> Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).</li>
<li>Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+deposition+in+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry+and+Ion+Processes%22%5BJournal%5D)">Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules.</a> International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).</li>
<li>Knochenmuss, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnochenmuss%2C+R+%22Electrospray+and+MALDI+Mass+Spectrometry%3A+Fundamentals%2C+Instrumentation%2C+Practicalities%2C+and+Biological+Applications%22">Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications</a>. Cole, R. B. , 2nd, John Wiley and Sons. NJ. 149-262 (2010).</li>
<li>Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triacylglyceride+%28TAG%29+profiles+of+integumentary+lipids+isolated+from+three+bat+species+determined+by+matrix-assisted+laser+desorption+-+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MALDI+-+TOF+MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption - ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI - TOF MS).</a> Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).</li>
<li>Blehert, D., Hicks, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+white-nose+syndrome%3A+An+emerging+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen.</a> Science. 323 (5911), 227-228 (2009).</li>
<li>Gargas, A., Trest, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geomyces+destructans+sp.+nov.+associated+with+bat+white-nose+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome.</a> Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).</li>
<li>Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+infection+of+bats+with+Geomyces+destructans+causes+white-nose+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome.</a> Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).</li>
<li>Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+disease+causes+regional+population+collapse+of+a+common+North+American+bat+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species.</a> Science. 329 (5992), 679-682 (2010).</li>
<li>Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+importance+of+bats+in+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The economic importance of bats in agriculture.</a> Science. 332 (6025), 41-42 (2011).</li>
<li>Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+of+the+American+Society+of+Mammalogists+on+the+use+of+wild+mammals+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammalogy%22%5BJournal%5D)">Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research.</a> Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).</li>
<li>Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+content%2C+composition%2C+and+organization+of+porcine+epithelial+barrier+lipids+revealed+by+thin+layer+chromatography+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy.</a> Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipids+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Nicolaides, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+lipids%3A+Their+biochemical+uniqueness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skin lipids: Their biochemical uniqueness.</a> Science. 186 (4158), 19-24 (1974).</li>
<li>Camera, E., Ludovici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+major+lipid+classes+in+sebum+by+rapid+resolution+high-performance+liquid+chromatography+and+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry.</a> Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-+A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W pracy przedstawiono prostą i solidną metodę rozdzielania szerokich klas lipidów wyizolowanych z powłoki ssaków za pomocą preparatywnego TLC i określania profili TAG za pomocą MALDI-TOF MS, bez czasochłonnej derywatyzacji cząsteczek lipidów. Krytyczne etapy tworzenia wysokiej jakości widm TAG za pomocą MALDI-TOF MS obejmują: 1) Pomyślną ekstrakcję związku przy minimalnym zanieczyszczeniu lub utlenianiu; 2) wystarczające rozdzielenie i wyizolowanie metodą chromatografii; oraz 3) Wysoka rozdzielczość i dokładność masy przez MALDI-TOF MS.
W artykule przedstawiono metodę polegającą na ekstrakcji i oddzieleniu obojętnej frakcji lipidowej z plagiopatagium nocka czerwonego w celu uzyskania profili TAG MS. Podczas gdy w niniejszym badaniu wykorzystano gatunek nietoperzy (Mammalia: Chiroptera), metody te można rozszerzyć o badanie lipidów powłokowych dowolnego gatunku ssaków. Powłoka nietoperzy charakteryzuje się tym, że zawiera głównie cholesterol, z mniejszą ilością TAG, FFA, skwalenu i estrów sterolu/wosku. Stosunek lipidów w sebum u nietoperzy różni się od ludzi tym, że skwalen występuje w małych ilościach (w przeciwieństwie do 16% u ludzi), podczas gdy cholesterol występuje w większych proporcjach (1 - 7% u ludzi, ale 26 - 62% u nietoperzy)22,31. Ludzkie włosy zawierają około 3% TAGs, podczas gdy proporcje do 28% znajdują się we włosach nietoperza rudego. Ekstrakcja próbek lipidów od nietoperzy jest podobna dla innych gatunków. Podczas gdy w tym badaniu waciki nasączone rozpuszczalnikiem są używane do usuwania sebum, można również wielokrotnie odwrócić fiolkę lub probówkę z próbką zawierającą rozpuszczalnik na powierzchnię powłoki. Specjalistyczne produkty taśmowe stanowią również alternatywne sposoby ekstrakcji lipidówpowierzchniowych 32. Kluczowym elementem prawidłowej ekstrakcji lipidów jest zminimalizowanie zanieczyszczenia olejami skórnymi. Można to łatwo osiągnąć, trzymając wyciśniętą butelkę z metanolem i spryskując wszystkie szklane naczynia i przybory, wycierając przybory chusteczką między wszystkimi próbkami i nosząc rękawiczki do badań. Utlenianiu wielonienasyconych acyli zapobiega się poprzez dodanie BHT i należy go stosować niezależnie od temperatury, w jakiej przechowywane są próbki.
Analiza biomolekuł zwykle wymaga kroku chromatograficznego w celu oddzielenia interesujących cząsteczek od zanieczyszczeń. W tej metodzie stosuje się TLC, która pozwala uniknąć wymagań dotyczących oprzyrządowania do chromatografii gazowej lub cieczowej i wymaga mniejszego doświadczenia technicznego w celu uzyskania solidnych i powtarzalnych wyników. W zależności od klasy lipidów, które nas interesują, można włączyć wiele różnych faz ruchomych. Ponadto w celu uzyskania wyników ilościowych można wykorzystać płytki HPTLC i densytometrię skaningową. Chociaż odmiany metod TLC są zbyt liczne, aby je tutaj wymienić, niektóre typowe fazy ruchome stosowane w TLC lipidów obejmują chloroform:metanol:wodę do separacji fosfolipidów i glikolipidów lub izooktan:eter etylowy do separacji lipidów niepolarnych28. Jeśli chodzi o oddzielanie TAG od innych klas lipidów, system rozpuszczalników H:E:A działa konsekwentnie i zapewnia porównywalne wyniki.
Kolejną zaletą stosowania TLC jest to, że pasma zainteresowania można szybko profilować za pomocą MALDI-TOF MS bez uprzedniej derywatyzacji analitów. W tym badaniu krzemionka jest usuwana z płytki TLC, a analit jest z niej eluowany przez sonikację w rozpuszczalniku, a następnie odwirowanie w celu oddzielenia adsorbentu i odparowania rozpuszczalnika elującego. Alternatywnie, matryca może być nakładana bezpośrednio na pasma analitu oddzielone na płytkach TLC, a następnie bezpośrednio analizowana przez MALDI-TOF MS33. Skuteczne profilowanie przez MALDI-TOF MS zależy od wystarczającego przygotowania próbki i biegłości operatora w strojeniu i kalibracji przyrządu. Przyrząd powinien być codziennie kalibrowany za pomocą wzorców obejmujących zakres masy cząsteczkowej odpowiedni dla interesujących nas cząsteczek. Odpowiednia czułość i rozdzielczość (np. 10 000 ≥) sprzętu powinna być również codziennie potwierdzana za pomocą ACTH.
Składniki lipidowe łoju znajdujące się na powierzchni powłoki ssaków mogą odgrywać rolę w kolonizacji przez patogeny bakteryjne / grzybicze. W związku z tym wiedza na temat składu chemicznego gatunków i osobników może dostarczyć wskazówek na temat procesów zachodzących w chorobach ludzi i dzikich zwierząt. Różnice wewnątrzgatunkowe między osobami chorymi i zdrowymi mogą stanowić objawy kliniczne, które pomagają w wykrywaniu i diagnozowaniu choroby. Ponadto, jeśli obecne są określone związki, które hamują rozwój drobnoustrojów, można je zidentyfikować do stosowania w leczeniu i profilaktyce chorób.

Tkanki powłokowe ssaków obejmują naskórek, struktury rogowe (np. włosy i paznokcie) oraz gruczoły zewnątrzwydzielnicze. Gruczoły zewnątrzwydzielnicze typu łojowego są związane z mieszkami włosowymi, które są zbiorczo określane jako jednostka łojowo-łojowa1. Gruczoły łojowe uwalniają na powierzchnię skóry tłusty wysięk zwany sebum. Sebum składa się głównie z glicerolipidów (np. triacyloglicerydów [TAGs]), wolnych acylów tłuszczowych (FFA), estrów sterolu/wosku i skwalenu. Skład chemiczny sebum jest specyficzny dla gatunku2. Oprócz tego, że są częścią wrodzonego układu odpornościowego i zapewniają funkcję przeciwbakteryjną3, lipidy łojowe wpływają na ważne procesy fizjologiczne, w tym utratę wody przez parowanieprzez skórę 4, integralność komórkowąi regulację genów5 oraz wchłanianieleków6. Kompozycje lipidowe łoju mogą również służyć jako markery choroby. Zmienione proporcje i ilości szerokich klas lipidów łojowych są objawami klinicznymi chorób takich jak trądzik pospolity7, łupież8, łojotokowe zapalenie skóry8, asteatoza9 i inne10. Tkanki naskórka i włosa obejmują zmienne profile zawierające sterole i pochodne, TAGs, FFA, ceramidy, fosfolipidy i inne drobne składniki lipidowe. Ponieważ lipidy powłokowe mogą funkcjonować w procesach chorobowych, określenie różnic w składzie chemicznym TAG między osobami zdrowymi i chorymi może być przydatne w klinicznej diagnostyce choroby.
Lipidy są ogólnie definiowane jako nierozpuszczalne w wodzie związki organiczne z podstawnikami niepolarnymi lub niepolarnymi11. Struktury lipidowe mogą być długimi łańcuchami węglowodorowymi, utlenionymi alkanami (w tym estrami wosku, FFA, alkoholami, ketonami i aldehydami) lub złożonymi strukturami pierścieniowymi, takimi jak cholesterol12. Istnieje osiem głównych klas lipidów w zależności od struktury (FFA, glicerolipidy [GL], glicerofosfolipidy [GP], sfingolipidy [SP], lipidy steroli [ST], lipidy prenolowe [PR], sacharylipidy [SL] i poliketydy [PK]), które wykazują szeroki zakres właściwości chemicznych w zależności od klasy13. Ze względu na duże zróżnicowanie właściwości chemicznych klas lipidów pożądane jest bezpośrednie profilowanie bez uprzedniej derywatyzacji cząsteczek lipidów. Jedną z nowych metod w badaniach lipidów jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC) połączona ze spektrometrią mas czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF MS)14.
MALDI-TOF MS jest szeroko stosowany w badaniach proteomicznych do identyfikacji białek i kojarzenia ich z określonymi sekwencjami aminokwasów dzięki bardzo dokładnym "odciskom palców" masy jonów peptydowych generowanym z białek trawionych trypsyną15. MALDI-TOF MS może być również stosowany do profilowania innych klas biomolekuł, w tym lipidów, takich jak TAGs16-18. MALDI wymaga użycia matrycy, zazwyczaj związku organicznego, który zawiera aromatyczne i sprzężone struktury podwójnych wiązań. Cząsteczki matrycy służą do delikatnego przenoszenia energii lasera do analitów, wspomagania przenoszenia protonów i wytwarzania pojedynczo naładowanych jonów fazy gazowej19-21. Jony są poddawane działaniu pola wysokiego napięcia w wysokiej próżni i przyspieszane do analizatora mas TOF, gdzie jony są następnie rozdzielane przez różnice prędkości, które są proporcjonalne do ich stosunku masy do ładunku. Nawet bardzo duże biomolekuły mogą być jonizowane z niewielką fragmentacją, wytwarzając pojedynczo naładowane cząsteczki jonów w celu uproszczenia analizy widma. Możliwość bezpośredniej analizy cząsteczek lipidów bez uprzedniej derywatyzacji przyczyniła się do szybkiego przyjęcia MALDI-TOF MS w badaniach lipidomicznych18.
Ten artykuł przedstawia rutynową metodę izolowania i analizy lipidów powłokowych z włosów, wydzielin łojowych i plagiopatagium nocka czerwonego (Lasiurus borealis). Służy to do określenia międzygatunkowych zmian lipidów powłokowych nietoperzy w celu wyjaśnienia procesu chorobowego zespołu białego nosa (WNS)22. WNS jest chorobą grzybiczą nietoperzy i jest wywoływana przez nowo opisany gatunek psychrofilny Geomyces destructans23-25. WNS spowodował śmierć ponad 5 milionów nietoperzy jaskiniowych w Ameryce Północnej i grozi wyginięciem wrażliwych gatunków nietoperzy, z potencjalnymi skutkami ekonomicznymi w postaci miliardów dolarów szkód dla przemysłu rolniczego26,27. Aby zbadać etapy infekcji G. destructans, lipidy wyekstrahowano z tkanek włosów i skrzydeł wschodnich czerwonych nietoperzy i rozdzielono na szerokie klasy lipidów za pomocą TLC, aby wyizolować frakcję TAG do późniejszej analizy przez MALDI-TOF MS. TAGs zawierają krótkie łańcuchy acylowe i są łatwo wykrywalne przez MALDI-TOF MS z niewielką ingerencją macierzy.

<table><tbody><tr><td>Butylowany hydroksytoluen</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>101162</td><td><a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">www.mpbio.com</a></td></tr><tr><td>TLC Elastyczne płytki</td><td>Whatman</td><td>4410-222</td><td><a href="http://www.whatman.com" target="_blank">www.whatman.com</a></td></tr><tr><td>ACTH</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>A8346-5X1VL</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Triolein</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>44895-U</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TLC Lipid Standard</td><td></td><td>TLC 18-1</td><td><a href="http://www.nu-chekprep.com" target="_blank">www.nu-chekprep.com</a></td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Nu-Check Prep., Inc.</td><td>Kod NIH 53B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>17810-1AMP-S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklane fiolki z teflonową nakrętką</td><td>U.S. National Scientific Co.</td><td>B7800-2</td><td><a href="http://www.nationalscientific.com/" target="_blank">www.nationalscientific.com/</a></td></tr><tr><td>DHB</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>50862-1G-F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>C8982-10X10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sebutape</td><td>CuDerm</td><td>S100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas maldi-tof

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

Powłoka ssaków obejmuje gruczoły łojowe, które wydzielają oleisty materiał na powierzchnię skóry. Produkcja sebum jest częścią wrodzonego układu odpornościowego, który chroni przed drobnoustrojami chorobotwórczymi. Nieprawidłowa produkcja sebum i skład chemiczny są również objawem klinicznym określonych chorób skóry. Sebum zawiera złożoną mieszaninę lipidów, w tym triacyloglicerydy, która jest specyficzna dla gatunku. Szerokie właściwości chemiczne wykazywane przez różne klasy lipidów utrudniają precyzyjne określenie składu sebum. Techniki analityczne lipidów zazwyczaj wymagają derywatyzacji chemicznej, która jest pracochłonna i zwiększa koszty przygotowania próbki. W tym artykule opisano, jak ekstrahować lipidy z powłoki ssaków, oddzielać szerokie klasy lipidów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i profilować zawartość triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu wspomaganej matrycą laserową. Ta solidna metoda umożliwia bezpośrednie określenie profili triacyloglicerydów wśród gatunków i osobników i może być łatwo zastosowana do każdej grupy taksonomicznej ssaków.

Metoda ekstrakcji służąca do izolacji całkowitych lipidów z tkanki opisana przez Folcha30 jest prostą procedurą, która została tutaj zaadoptowana. Po ekstrakcji tkanki i odparowaniu rozpuszczalnika lipidy często występują w postaci żółtawej warstwy. Żółty kolor wynika najprawdopodobniej z zanieczyszczeń białkowych, które można usunąć poprzez przeprowadzenie ekstrakcji ciecz-ciecz. To dodatkowe przetwarzanie próbki nie jest wymagane w niniejszej procedurze, ponieważ preparatywna TLC oddziela frakcję TAG od takich zanieczyszczeń. Dodawanie świeżego bezwodnego siarczanu sodu na wszystkich etapach filtrowania pomaga zmniejszyć zanieczyszczenie wodą, co wpływa na dokładne oznaczenie masy lipidów.
Analizy lipidów powłoki skórnej ssaków za pomocą preparatywnej TLC z fazą ruchomą H:E:A zazwyczaj pozwalają na rozdzielenie czterech wyraźnych prążków odpowiadających (począwszy od linii startu) sterolom, wolnym kwasom tłuszczowym (FFA), triacyloglicerolom (TAG) oraz estrom steroli/estrom woskowym/skwalenowi (Rycina 1). W niektórych przypadkach podczas stosowania analitycznej wysokorozdzielczej (HP) TLC z fazą ruchomą H:E:A, estry steroli, estry woskowe i skwalen rozdzielają się i pojawiają się jako trzy osobne prążki. W warunkach zastosowanych w niniejszym badaniu estry steroli/woskowe nie uległy rozdzieleniu. Jeśli prążki te są przedmiotem zainteresowania, fazę ruchomą można zmienić na izooktan:eter etylowy (95:5 v/v), a płytkę HPTLC można przeanalizować za pomocą densytometrii skanującej. Inne czynniki mogą powodować słabą separację. W celu uzyskania powtarzalnej jakości rozdzielania TLC i wiarygodnych danych, zazwyczaj eliminuje się je poprzez umieszczenie papieru filtracyjnego w komorze, zastosowanie smaru dla zapewnienia szczelności pokrywy, równoważenie komory przez noc oraz utrzymywanie czystości komór TLC.
Reprezentatywne widma mas MALDI-TOF uzyskane dla TAG wyizolowanych z rudego nietoperza wschodniego przedstawiono na Rysunkach 2 i 3. Widma te zawierają piki jonów TAG w zakresie mas między m/z 850 - 910, co jest typowe dla TAG izolowanych z ssaków nienadwodnych. Dodatek 1,0 M NaOH sprzyja powstawaniu jednokrotnie naładowanych jonów Na+, które są bardziej stabilne niż jony H+. Poza stabilnością, brak jonów H+ i K+ ułatwia analizę widma. Piki jonowe w zakresie m/z 850 - 910 odpowiadają resztom FA 16:0, 18:0, 18:1 oraz 18:2, będącym dominującymi składnikami acylowymi w TAG (Tabela 1). Możliwe reszty FA w TAG mogą być wstępnie określone na podstawie całkowitego m/z jonów obecnych w widmach MALDI-TOF MS, co pozwala na wyciągnięcie wniosków dotyczących różnic między gatunkami i osobnikami. Jeśli jednak wymagane są dokładne proporcje zawartości acylowej, należy zastosować MS/MS lub chromatografię gazową (GC/MS). Dalsze informacje na temat proporcji acylowych można uzyskać, obserwując piki w obszarze diacyloglicerydów na widmie (Rysunek 4). Diacyloglicerydy powstają w wyniku fragmentacji TAG w źródle MALDI i można je znaleźć w regionie m/z 590 - 650. Fragmentację TAG można zwiększyć, pomijając dodatek 1,0 M NaOH16. Tkanka skrzydła rudego nietoperza wschodniego charakteryzuje się dominującym pikiem przy m/z 879,7, natomiast tkanka włosa dominującym pikiem przy m/z 881,8 (odpowiednio Rysunek 2 i 3). Piki przy m/z 907,8, 879,7 i 855,7 (POP, PPoS) mają w tkance włosa zbliżoną intensywność (~50%), przy czym pik przy 853,7 wynosi ~40%.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:width="2in">Skład</td>
			<td fo:width="1in">Skład pierwiastkowy</td>
			<td fo:width="1in">Masa obserwowana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+TAGs</td>
			<td> </td>
			<td>Na+TAGs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSO</td>
			<td>C57H108O6</td>
			<td>911.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OOS, LSS</td>
			<td>C57H106O6</td>
			<td>909.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OOO, LnSS, LSO</td>
			<td>C57H104O6</td>
			<td>907.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOO, LLS</td>
			<td>C57H102O6</td>
			<td>905.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLO, OOLn</td>
			<td>C57H100O6</td>
			<td>903.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLL</td>
			<td>C57H98O6</td>
			<td>901.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLLn</td>
			<td>C57H96O6</td>
			<td>899.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLnLn</td>
			<td>C57H94O6</td>
			<td>897.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLnLn</td>
			<td>C57H92O6</td>
			<td>895.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSP</td>
			<td>C55H104O6</td>
			<td>883.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSP, OOP, SOPo</td>
			<td>C55H102O6</td>
			<td>881.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOP, LnSP, LSPo</td>
			<td>C55H100O6</td>
			<td>879.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLP, LnOP, LOPo</td>
			<td>C55H98O6</td>
			<td>877.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLP, LLPo, LnOPo</td>
			<td>C55H96O6</td>
			<td>875.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLnP, LnLPo</td>
			<td>C55H94O6</td>
			<td>873.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLnPo</td>
			<td>C55H92O6</td>
			<td>871.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPS</td>
			<td>C53H102O6</td>
			<td>857.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POP, PPoS</td>
			<td>C53H100O6</td>
			<td>855.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OOM, PPL, PoPoS, POPo</td>
			<td>C53H98O6</td>
			<td>853.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPLn, PPoL, PoPoO, MyOO</td>
			<td>C53H96O6</td>
			<td>851.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LLM, LnOM</td>
			<td>C53H94O6</td>
			<td>849.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPP, SSLa</td>
			<td>C51H98O6</td>
			<td>829.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPPo, OSLa</td>
			<td>C51H96O6</td>
			<td>827.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPoPo, PMyO</td>
			<td>C51H94O6</td>
			<td>825.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LnLnLa</td>
			<td>C51H86O6</td>
			<td>817.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMS, SLaP, PPM</td>
			<td>C49H94O6</td>
			<td>801.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLaPo, PPoM, PPMy</td>
			<td>C49H92O6</td>
			<td>799.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PoPoM, OOCa</td>
			<td>C49H90O6</td>
			<td>797.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMP</td>
			<td>C47H90O6</td>
			<td>773.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMPo, OCaP</td>
			<td>C47H88O6</td>
			<td>771.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCaPo</td>
			<td>C47H86O6</td>
			<td>769.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMM, PPCa, PMLa</td>
			<td>C45H86O6</td>
			<td>745.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PoPCa, PoMLa</td>
			<td>C45H84O6</td>
			<td>743.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PoPoCa</td>
			<td>C45H82O6</td>
			<td>741.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaLaP, MMLa, MCaP</td>
			<td>C43H82O6</td>
			<td>717.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaLaPo</td>
			<td>C43H80O6</td>
			<td>715.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OO</td>
			<td>C39H72O5</td>
			<td>643.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OL</td>
			<td>C39H70O5</td>
			<td>641.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LL</td>
			<td>C39H68O5</td>
			<td>639.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP</td>
			<td>C37H72O5</td>
			<td>619.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP</td>
			<td>C37H70O5</td>
			<td>617.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP</td>
			<td>C37H68O5</td>
			<td>615.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Skład kwasów tłuszczowych, skład pierwiastkowy i masa izotopowa adduktów sodowych triacylogliceroli i diacylogliceroli. Ln=kwas linolenowy (18:3), L=kwas linolowy (18:2), O=kwas oleinowy (18:1), S=kwas stearynowy (18:0), P=kwas palmitynowy (16:0), Po=kwas palmitoleinowy (16:1), M=kwas mirystynowy (14:0), My=kwas mirystoleinowy (14:1), La=kwas laurowy (12:0), Ca=kwas kaprylowy (10:0).
<img alt="Chromatografia cienkowarstwowa lipidów; rozdzielanie steroli; schemat profilu lipidowego; analiza biochemiczna." src="/files/ftp_upload/50757/50757fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Chromatogram cienkowarstwowy rozdzielania głównych klas lipidów z zastosowaniem układu heksan:eter dietylowy:kwas octowy (80:20:2 v/v/v) jako fazy ruchomej. Prążka między sterolami a FFA nie zidentyfikowano za pomocą wzorca, lecz może on reprezentować alkohol tłusty lub woskowy diester.
<img alt="Wykres spektrometrii masowej pokazujący analizę pików dla mas cząsteczkowych." src="/files/ftp_upload/50757/50757fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Powiększony obszar TAG widma masowego MALDI-TOF dla sodowanych TAG (m/z 700 - 950) z tkanki skrzydła rudego nietoperza wschodniego (L. borealis). Piki zidentyfikowane przy m/z 853,7 (OOM, PPL, PoPoS, POPo) oraz m/z 879,7 (LOP, LnSP, LSPo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<img alt="Wynik spektrometrii mas; analiza widma, intensywność piku, identyfikacja molekularna, analiza chemiczna." src="/files/ftp_upload/50757/50757fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Powiększony region TAG widma masowego MALDI-TOF sodowanych TAG (m/z 700 - 950) z tkanki włosów rudego nietoperza wschodniego (L. borealis). Piki zidentyfikowane przy m/z 905,8 (LOO, LLS) oraz m/z 907,8 (OOO, LnSS, LSO). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Wykres spektrometrii mas, wartości m/z ilustrujące piki jonów molekularnych, analiza białek." src="/files/ftp_upload/50757/50757fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Obszar DAG widma mas MALDI-TOF sodowanych fragmentów DAG (m/z 530 - 730) z tkanki skrzydła nietoperza czerwonego (L. borealis). Piki zidentyfikowane przy m/z 643,5 (OO) oraz m/z 615,5 (LP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.

Powłoka ssaków zawiera lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, które mogą dostarczyć składu chemicznego charakterystycznego dla poszczególnych gatunków. W pracy przedstawiono rutynową metodę rozdzielania szerokich klas lipidów izolowanych z tkanek powłokowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i oznaczania profilu triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą.

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie i zidentyfikowanie zawartości trójglicerydów obecnych w wydzielinach łojowych nietoperzy. Najpierw należy wyekstrahować frakcję lipidów powierzchniowych z tkanek powłoki ciała w warunkach minimalizujących zanieczyszczenie i utlenianie. Następnie należy rozdzielić lipidy metodą cienkowarstwowej chromatografii w celu otrzymania frakcji trójglicerydów.Następnie przetwórz dane widmowe za pomocą oprogramowania urządzenia i przeanalizuj je przy użyciu internetowych baz danych chemicznych. Ostatecznie zastosowano preparatywną chromatografię warstwową oraz spektrometrię mas z jonizacją wspomaganą macierzą i desorpcją laserową z pomiarem czasu przelotu, aby określić różnice w profilach składu triglicerydów pomiędzy grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi. Metoda ta może pomóc w identyfikacji wydzielanych lipidów, które mogą pełnić funkcję sygnałów chemicznych w interakcjach między gospodarzem a patogenem.Choć niniejsza metoda jest wykorzystywana do badania objawów klinicznych zespołu białego nosa, można ją zastosować w odniesieniu do innych systemów ssaków, w tym do analizy sygnalizacji seksualnej lub ewentualnych różnic międzygatunkowych w składzie mleka. Wszystkie instrumenty należy oczyścić metanolem przed oraz pomiędzy pobieraniem tkanek od różnych osobników. Odciąć około 1 g włosa ze skóry i umieścić go w kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 ml.Aby pobrać próbki sebum z powierzchni skrzydeł, zwilżyć bawełniane tampony rozpuszczalnikiem chloroformowo-metanolowym. Przetrzeć skórę, a następnie umieścić tampony w osobnej kolbie.Następnie poddaj tkankę ekstrakcji przy użyciu 10 mililitrów chloroformu i metanolu zawierającego 0,5% BHT w celu zapobiegania utlenianiu; po dwóch godzinach dodaj około 0,5 grama bezwodnego siarczanu sodu i przefiltruj przez papier filtracyjny, aby zebrać rozpuszczalnik. Powtórz ekstrakcję sekwencyjnie, stosując mieszaninę chloroformu i metanolu w stosunku jeden do jeden oraz jeden do dwóch. Następnie połącz filtraty i odparuj je w strumieniu azotu.Wyznacz masę suchą i rozpuść pozostałość lipidową do stężenia 10 mg/ml. Przechowuj próbkę w szklanych fiolkach w temperaturze -20 °C przez maksymalnie miesiąc, aby usunąć plastyfikatory, które mogą zakłócać późniejszą analizę spektrometrią mas. Napełnij probówki mikrocentryfugowe o pojemności 1,5 ml mieszaniną chloroformu i metanolu w stosunku 3:2.Następnie przepłucz acetonem i wysusz na powietrzu; probówki z próbkami przechowuj w pojemniku wolnym od kurzu i manipuluj nimi wyłącznie w rękawiczkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu tłuszczami skórnymi. Aktywuj płytkę TLC, najpierw poddając ją wstępnemu rozwijaniu w mieszaninie chloroformu i metanolu w stosunku 3:2.Nalać rozpuszczalnik do komory TLC do głębokości 1 cm. Następnie umieścić płytkę w komorze i pozwolić rozpuszczalnikowi przemieścić się całkowicie do górnej krawędzi płytki. Wyjąć płytkę i suszyć ją w dygestorium do czasu odparowania rozpuszczalnika.Następnie nagrzewaj płytkę przez co najmniej 10 minut w temperaturze 120 stopni Celsjusza. Teraz zaznacz górę płytki ołówkiem. Narysuj prostą linię ołówkiem 1,5 centymetra od dolnej krawędzi płytki, aby wyznaczyć linię startową, na której zostaną naniesione próbka i wzorce.Następnie wyciąć kawałek papieru filtracyjnego wystarczająco duży, aby wyłożyć dwie krótkie i jedną długą ścianę komory TLC. Włożyć wyściółkę z papieru filtracyjnego do komory. Wlać do komory 100 mililitrów świeżo przygotowanego rozpuszczalnika fazy ruchomej do głębokości około jednego centymetra.Nałóż uszczelkę z smaru silikonowego wzdłuż górnej krawędzi komory. Przykryj szklaną pokrywą i pozostaw do równoważenia przez noc. Naniesienie próbki wykonaj ręcznie lub za pomocą automatycznego aplikatora próbek, tworząc ciągłą smugę.Na zewnętrznych torach płytki TLC nanieś około 20 µL mieszaniny standardów. Umieść obciążoną płytkę TLC w nasyconej komorze. Zamknij pokrywę i prowadź chromatografię do momentu, aż rozpuszczalnik dotrze do górnej krawędzi płytki.Po około 45 minutach wyjmij płytkę i pozwól nadmiarowi rozpuszczalnika odparować w dygestorium. Spryskaj ją roztworem 0,05% rodaminy 6G w 95% etanolu. Następnie zwizualizuj prążki lipidowe pod lampą ultrafioletową o długiej fali i zaznacz je ołówkiem. Wyznacz wartość RF dla prążków fluorescencyjnych rozdzielonych w próbce oraz we wzorcach.Wykonaj dokumentację fotograficzną. Następnie zidentyfikuj prążek odpowiadający wzorcowi tagu. Przenieś go na duży kawałek szkła i papier serwatkowy, a następnie do 1,5 milliliter probówki do mikrowirówki przemytej rozpuszczalnikiem.Dodaj jeden mililitr rozpuszczalnika chloroform-metanol w proporcji 3:2 do próbki i poddaj sonikacji przez jedną minutę. Odwiruj krzemionkę, aby uzyskać osad, a następnie przenieś rozpuszczalnik do nowej, wcześniej zważonej probówki. Powtórz ekstrakcję jednym mililitrem, zbierz filtraty, a następnie odparuj rozpuszczalnik w strumieniu azotu.Przechowywać wysuszony osad zawierający znaczniki w atmosferze azotu, w ciemności w temperaturze 4 °C, podczas gdy dodatkowe próbki tkanek są rozdzielane za pomocą TLC Rho Domine. W próbkach obecne jest Six G, lecz jest ono nierozpuszczalne w heksanie i zostaje usunięte podczas rozpuszczania próbek. Bezzwłocznie przed analizą MS przygotować roztwór roboczy A CTH o stężeniu 500 fmol/µL oraz standardy znaczników o stężeniu 10 mg/mL zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Należy również przygotować 0,5 M roztwór zapasowy DHB w 90% metanolu do wykorzystania jako matryca dla próbek i wzorców. Probówkę należy owinąć folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Następnie należy połączyć 10 µL matrycy DHB, 10 µL próbki lub wzorca oraz 5 µL 1 M roztworu wodorotlenku sodu, a następnie krótko odwirować probówkę, aby zgromadzić mieszaninę na dnie.Nanieś 1 µL próbki standardowej lub A CTH na stalową płytkę docelową MALDI i umieść w eksykancie do wysuszenia. Następnie włóż płytkę docelową do instrumentu w celu akwizycji danych. Przeprowadź analizę MALDI-TOF MS w dodatnim trybie refleksyjnym.Nastroić i skalibrować instrument zgodnie z instrukcjami producenta, wykorzystując roztwory standardowe A CTH i tagów. Pozyskać widma dla każdej próbki naniesionej na płytkę docelową po wygładzeniu i odjęciu tła z Aldi Spectra; przetwarzać piki jonowe ręcznie za pomocą wyszukiwarki online Lipid Maps, kopiując i wklejając listę widm do pola jonów prekursorowych i intensywności. Ograniczyć wyszukiwanie do pożądanego składu AAL. Zidentyfikować tagi na podstawie stosunków masy do ładunku jonów obecnych w widmie dla każdej próbki.Jeśli procentowe udziały estrów metylowych kwasów tłuszczowych są dostępne z oddzielnej analizy GCMS, należy dodać te dane, aby uzyskać prawdopodobieństwa dla triacyloglicerydów (TAG). Analiza lipidów pokrywu skórnego ssaków za pomocą preparatywnej TLC z HEA jako fazą ruchomą zazwyczaj pozwala na rozdzielenie czterech wyraźnych prążków odpowiadających estrom steroli, wolnym kwasom tłuszczowym (FFA), TAG oraz estrom woskowym, EER i skwalenowi. Powyższe spektra masowe uzyskano dla TAG wyizolowanych z rudego nietoperza wschodniego.Typowe dla preparatu pochodzącego od ssaków nielądowych. Widma zawierają piki jonowe w zakresie stosunku masy do ładunku od 850 do 910. Dominującymi składnikami i znacznikami AAL są fragmenty kwasów tłuszczowych.Dalsze informacje na temat stosunków AAL można wywieść z obserwacji pików w regionie glicerydów D AAL widma, które reprezentują fragmentację tagów. Widmo MALDI wykazuje trzy wyraźne regiony tagów, w których główny stosunek ładunku opiera się na liczbie atomów węgla. Tkanka skrzydła czerwonego nietoperza wschodniego charakteryzuje się dominującymi pikami w tych trzech regionach przy głównych stosunkach ładunku 8 53 0.7 8, 79 0.7 oraz 907.8.Należy pamiętać, że podczas pracy z żywymi lub uśpionymi nietoperzami należy uzyskać wszystkie wymagane zezwolenia na obchodzenie się z tymi zwierzętami, ich przechowywanie i transport. Należy również uzyskać zgodę instytucjonalnej komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt oraz instytucjonalnej komisji ds. bezpieczeństwa biologicznego. W przypadku pracy z żywymi nietoperzami lub ich tkanką nerwową należy pamiętać, że wszystkie osoby obsługujące zwierzęta powinny być zaszczepione przeciwko wściekliźnie.Ponadto, podczas pracy z niektórymi patogenami nietoperzy kąpielowych, takimi jak geo MiSiS ants, wymagane jest laboratorium poziomu biosafety level two.

profiling-triacylglyceride-contents-bat-integumentary-lipids

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Analiza zawartości trójglicerydów w lipidach skóry nietoperzy za pomocą przygotowawczej chromatografii warstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

Skład ekstraktów lipidów polarnych oraz skład kwasów tłuszczowych poszczególnych gliceryolipidów są określane w prostym i niezawodnym eksperymencie profilowania lipidów. W tym celu gliceryolipidy są izolowane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie poddawane transmetylacji ich grup acylowych. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej.

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-on) został wcześniej zgłoszony jako matryca MALDI do obrazowania tkanek małych cząsteczek; protokoły użycia DT do obrazowania MALDI endogennych lipidów na powierzchni skrawków tkanek za pomocą dodatniego jonu MALDI-MS na ultrawysokiej rozdzielczości instrument kwadrupol-FTICR są dostępne tutaj.

Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Podejście markerów troficznych kwasów tłuszczowych, tj. asymilacja kwasów tłuszczowych jako całej cząsteczki i transfer do tkanki konsumenckiej bez lub z niewielkimi modyfikacjami, jest utrudnione przez luki w wiedzy na temat metabolizmu kwasów tłuszczowych u małych bezkręgowców glebowych. Profilowanie izotopologiczne jest cennym narzędziem do rozplątywania oddziaływań troficznych.

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

U, lipidy skórne od przedstawicieli tego samego gatunku są kluczowe dla sygnalizacji seksualnej, z potencjalnym zastosowaniem w zarządzaniu gatunkami inwazyjnymi. W tym miejscu opisujemy protokoły ekstrakcji lipidów skóry ze zrzuconej skóry lub całych zwierząt, określania i analizowania całkowitej masy lipidów oraz oddzielania lipidów za pomocą frakcjonowania za pomocą chromatografii kolumnowej.

Izolacja chemiczna, kwantyfikacja i separacja lipidów skóry

Ten protokół służy do oznaczania lipidów w wodzie morskiej i próbkach biologicznych. Lipidy w filtratach ekstrahuje się chloroformem lub mieszaninami chloroformu i metanolu w przypadku ciał stałych. Klasy lipidów mierzy się za pomocą pręcikowej chromatografii cienkowarstwowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, a ich suma daje całkowitą zawartość lipidów.

Oznaczanie całkowitej zawartości lipidów i klas lipidów w próbkach morskich

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Lipidomika tkanek gryzoni

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących prawidłowego przygotowania próbki do analizy lipidów i metabolitów w małych tkankach, takich jak mózg Drosophila, przy użyciu wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji (MALDI) obrazowania spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu Drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Przedstawiona tutaj jest metoda badania struktur lipidowych poprzez znakowanie stabilnych izotopów przy użyciu czasu ich retencji, mobilności i fragmentacji.

Śledzenie lipidów de novo przy użyciu znakowania stabilnych izotopów LC-TIMS-TOF MS/MS

Protokół ten opisuje unikalny protokół kliniczny pobierania próbek ludzkiego płynu łezowego za pomocą czerwonych nici fenolowych oraz workflow oparty na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej (LC-MS/MS) w celu odkrycia profilu lipidomicznego łz. Prosta metoda bifazowej separacji metyloter-butyloeteru (MTBE)/metanolu umożliwia szybką ekstrakcję lipidów łzowych z wysoką odbudową i odkryciem biomarkerów łz.

Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów

Poznaj metodę izolacji triacyloglicerydów z wydzielin łojowych nietoperzy przy użyciu preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF. Technika ta umożliwia analizę profili lipidowych pełniących rolę sygnałów chemicznych.

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

Przeglądaj więcej filmów