Protokół testu komórkowego do prognozowania skoliozy idiopatycznej za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przewidzenie rokowania skoliozy idiopatycznej zgodnie z funkcjonalnym podziałem pacjentów poprzez badanie przesiewowe ich odpowiedzi PBM C na aktywację GPCR R za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej. Osiąga się to poprzez hodowlę pbmc w obecności fitohemaglutyniny lub PHA w celu zwiększenia liczby komórek. Ekspansja komórek odbywa się w rurce, utrzymywanej w pozycji pochylonej.

W drugim etapie komórki są traktowane OSTEOPONTYNĄ lub OPN, która zwiększa lub zmniejsza aktywność białka GI. W zależności od pacjentów po leczeniu, zawiesina komórkowa jest przenoszona do mikropłytki. Następnie komórki są stymulowane agonistami GI lub GS GPCR w celu określenia wynikających z tego zmian impedancji.

Wyniki dostarczają odpowiedzi kinetycznych dla wszystkich odwiertów, a zintegrowane odpowiedzi są następnie określane ilościowo na podstawie zmian impedancji. Implikacje tej techniki wykraczają daleko poza zwykłą diagnozę. Tak więc po raz pierwszy możemy wykryć na wczesnym etapie objawowych pacjentów zagrożonych rozwojem skoliozy, a teraz wiedząc, u kogo rozwinie się skolioza lub na jakim etapie, możemy zapewnić nowe terapie w celu ich leczenia.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekspozycja na promieniowanie rentgenowskie, jest to, że technika ta pozwala przewidzieć progno skoliozę osteopaty bez konieczności mierzenia covid i bez ryzyka dla zdrowia. Najnowszą rzeczą, techniką teraz będzie nasza asystentka naukowa Nita Franco, rozmrażanie zamrożonej porcji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą sterylnej pipety przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki zawierającej 15 mililitrów kompletnej pożywki i wirówki.

Komórki odsysają supernatant. Następnie delikatnie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki PHA, uzupełnić objętość do 20 mililitrów tym samym nośnikiem, luźno przykryj rurkę, aby umożliwić dopływ powietrza. Inkubuj probówkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla, aby umożliwić uśpionym limfocytom przekształcenie się w szybko proliferujące limfoblasty.

Całkowicie dokręć nakrętki i rozpuść komórki przez odwirowanie. Usunąć supernatant przez aspirację. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze kompletnego podłoża.

Uzupełnij objętość do 20 mililitrów tym samym podłożem i luźno zamknij probówkę kulturą na noc, aby zwiększyć liczbę komórek. Po dwóch praniach z użyciem 10 mililitrów RPMI 1640, delikatnie ponownie zawieś osad ogniwa w 600 mikrolitrach RPMI 1640. Zmierz stężenie komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek i analizatora żywotności.

Następnie dodaj odpowiednią objętość RPMI 1640, aby dostosować się do stężenia komórek 1,5 razy 10 do piątych komórek na 20 mikrolitrów. Przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny do dwóch sterylnych 1,5 mililitrowych probówek eend orph. Dodaj rekombinowaną osteopontynę w jednej probówce do końcowego stężenia 0,5 mikrograma na mililitr.

Dodaj równą objętość PBS do drugiej probówki. Delikatnie wymieszaj każdy warunek, pipetując dwukrotnie za pomocą sterylnej pipety o pojemności 100 mikrolitrów. Następnie dodaj pięć mikrolitrów RPMI 1640 do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, odwiruj płytkę przy 200 GS przez trzy minuty, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza w celu przeniesienia komórek z probówki na mikropłytkę.

Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek. Wysiew: 40 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na studzienkę w podwójnym duplikacie dla komórek niepoddanych działaniu środka i w duplikacie dla komórek poddanych działaniu ROPN lub PBS. Pozostaw płytkę komórkową pod sterylnym kapturem na pięć minut, aby komórki mogły odpocząć i równomiernie osiąść na dnie studzienki.

Aby zoptymalizować efekt hodowli OPN, komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla równoważą kultury w temperaturze pokojowej przez około 30 minut. W międzyczasie przygotuj jeden mililitr 100 mikromolowej somatostatyny i izoproterenolu w RPMI 1640. Napełnij płytkę złożoną, dozując 20 mikrolitrów do odpowiednich studzienek.

Przykryj płytkę złożoną utwardzalną uszczelką. Załaduj końcówki do pipet płytkowych i płytkę złożoną do systemu opartego na CDS. Nazwij tabliczkę w oprogramowaniu instrumentu opartym na CDS.

Przejdź do listy protokołów i wybierz odpowiedni protokół, aby zainicjować protokół. Kliknij przycisk Start. Zintegrowany system fluidyczny jednocześnie dodaje związki do wszystkich studzienek.

System oparty na CDS automatycznie zbiera dane przez 15 minut po tym, jak żywotność komórek w edycji złożonej była porównywalna między wszystkimi próbkami z wartościami spójnymi w zakresie od 86 do 96%. Natomiast w liczbie komórek odnotowano duże różnice. Spośród 32 użytych próbek dwie miały niewystarczającą liczbę komórek i nie zostały sklasyfikowane. Ten przykład przedstawia klasyfikację funkcjonalną według stopnia nierównowagi między GI a sygnalizacją GI.

Ocena efektu OPN w odpowiedzi na stymulację przewodu pokarmowego wykazała, że OPN zwiększał odpowiedź u pacjentów 353 i 371. Natomiast odpowiedź była zmniejszona o ponad 50% u pacjentów 345 i 382 oraz o mniej niż 50% u pacjentów 370 po leczeniu ROPN. Tak więc, zgodnie z naszymi kryteriami klasyfikacji, byliśmy w stanie skategoryzować pacjentów 353 i 371 w FG jeden, pacjentów 300 z 45 i 382 w FG 2 i pacjenta 370 w FG trzy.

Równolegle wszyscy pacjenci zostali przebadani pod kątem odpowiedzi na stymulację białkiem żołądkowo-jelitowym i porównani z osobami z grupy kontrolnej. Zgodnie z oczekiwaniami, wszyscy pacjenci reagowali słabiej niż osoby z grupy kontrolnej. Pacjenci zaklasyfikowani do tej samej grupy funkcjonalnej wykazywali podobny poziom maksymalnej odpowiedzi.

Klasyfikacja dużej kohorty pacjentów z SC regularnie obserwowanych w naszej specjalnej klinice w szpitalu San Justine ujawniła, że trzy grupy funkcjonalne były podobnie rozmieszczone. Wśród umiarkowanych przypadków FG dwa dominowało wśród ciężkich przypadków. Po odczekaniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak sklasyfikować pacjenta w dwóch, trzech grupach funkcyjnych za pomocą komórkowej spektroskopii dielektrycznej.