Odzyskiwanie antygenu wywołane ciepłem: skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa
30 sierpnia 2013
Podczas neurogenezy dorosłego hipokampa, wyraźny zestaw markerów genetycznych ulega ekspresji, gdy spokojna nerwowa komórka macierzysta sekwencyjnie rozwija się i rozwija w funkcjonalnie zintegrowany neuron w obwodzie. Korzystając z indukowanego ciepłem odzyskiwania antygenu, typy komórek progenitorowych, które w innym przypadku są trudne do wykrycia, są identyfikowane z większą skutecznością.
Ogólnym celem tej procedury jest pobranie antygenu z tkanki mózgowej hipokampa, aby lepiej uwidocznić typy komórek progenitorowych, które dają początek nowo narodzonym neuronom. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie perfundowanego mózgu od myszy wycinającej cienkie odcinki koronalne i zamontowanie tych odcinków na szklanym szkiełku, specjalnie zaprojektowanym tak, aby silnie przylegał do tkanki. Drugim krokiem jest zagotowanie szkiełek z chusteczką i atopowym leczeniem Kay i pozostawienie wystarczającej ilości czasu na ostygnięcie.
Następnie wybarwić tkankę przez noc pierwotnymi przeciwciałami. Ostatnim krokiem jest wykonanie wtórnego barwienia przeciwciałami na tkance następnego dnia przez co najmniej dwie godziny. Ostatecznie zwizualizuj różne typy komórek propłciowych na różnych etapach rozwoju podczas neurogenezy tkanki hipokampa u dorosłych za pomocą mikroskopii poklatkowej lub konfokalnej.
Cześć, nazywam się Hun Jo, jestem doktorem habilitowanym, członkiem laboratorium dr Iana Johna i Kliniki Mayo. Naszym głównym celem w John Lab jest badanie procesu innych neurogenez w zaburzeniach neurologicznych i psychiatrycznych. Naszym celem końcowym jest skuteczne przełożenie tej wiedzy na aplikację terapeutyczną, która zademonstruje, że naszą procedurą aportera antygenu będzie Quam Hui, a cześć John z naszego laboratorium.
Główną przewagą naszej techniki nad istniejącymi metodami immunohistochemii jest to, że umożliwia ona skuteczną wizualizację różnych typów komórek podczas neurogenezy dorosłego hipokampa. Te typy komórek, w tym prekursorowe nerwowe komórki macierzyste, które w inny sposób są trudne do wykrycia, mogą być skutecznie znakowane i wizualizowane przy użyciu naszej metody pobierania antygenu. Metoda ta dostarczy informacji na temat rozwoju i regulacji neuronów noworodków podczas neurogenezy hipokampa u dorosłych.
Dla osób zainteresowanych badaniem zaburzeń psychicznych i leczeniem farmakologicznym, nasze pobieranie antygenów okaże się przydatne w badaniu roli rozwoju neuronów podczas tej choroby. Patogeneza. Rozpocznij procedurę od umieszczenia mózgu perfundowanej myszy w 4% para formaldehydzie w 10-mililitrowej stożkowej probówce na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na co najmniej 12 do 24 godzin, ale nie dłużej niż 36 godzin w celu pełnego utrwalenia. Po całonocnym utrwaleniu usuń PFA i pozostaw mózg w stożkowej rurce.
Następnie przepłucz mózg 30% sacharozą, aby usunąć wszelkie pozostałości PFA i wyrzuć sacharozę. Następnie ponownie napełnij probówkę 30% sacharozą i utrzymuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż mózg opadnie na dno probówki. Następnie pokrój hipokamp na 40-mikrometrowe skrawki mózgu na mikrotomie.
Skrawki w roztworze płynu niezamarzającego należy zachować do czasu, aż będą gotowe do immunohistochemii. Następnie zamontuj plastry na szkiełkach mikroskopowych, które są specjalnie zaprojektowane, aby mocno przylegały do tkanki. Po zamontowaniu chusteczki pozostaw szkiełka do wyschnięcia na około 10 minut.
Suszenie można przyspieszyć, jeśli szkiełka opierają się o pionową powierzchnię na ręczniku papierowym, aby zapewnić całkowite usunięcie poprzednich chemikaliów. Po wyschnięciu szkiełek należy je myć PB S3 razy przez pięć minut za każdym razem. Następnie pozwól mu ponownie wyschnąć.
W tej procedurze należy przygotować roztwór do gotowania tkanek zgodnie z opisem zawartym w dołączonym rękopisie. Następnie gotuj roztwór przez pięć minut w standardowej kuchence mikrofalowej na standardowym ustawieniu. Po zakończeniu gotowania ostrożnie wyjmij pojemnik z kuchenki mikrofalowej.
Następnie przenieś wysuszone szkiełka do roztworu. Upewnij się, że strona z sekcjami hipokampa jest całkowicie wystawiona na działanie roztworu. Jeśli to możliwe, umieść szkiełka pod kątem przy ściankach pojemnika i ułóż wokół nich inne szkiełka.
Następnie gotuj mieszaninę ze szkiełkami przez siedem minut w kuchence mikrofalowej przy standardowych ustawieniach. W międzyczasie napełnij dwa wiadra z lodem do połowy lodem. Po zakończeniu gotowania wyjmij pojemnik z kuchenki mikrofalowej i umieść go w jednym z wiader na lód.
Wlej resztę lodu z drugiego wiadra dookoła pojemnika i całkowicie go przykryj. Następnie odstaw na godzinę po godzinie. Wyjmij szkiełka z pojemnika.
Umyj je buforem TBST trzy razy przez pięć minut za każdym razem. Następnie susz szkiełka w ciemności przez pięć do 10 minut lub do momentu, gdy szkiełko całkowicie wyschnie. W międzyczasie przygotuj komorę z DDH dwa O do nocnego barwienia przeciwciał pierwotnych.
Po wyschnięciu szkiełek narysuj kontur wokół odcinków tkanek za pomocą pisaka do wody. Ten zarys działa jak bariera zapobiegająca przepływaniu mieszaniny przeciwciał. Następnie przygotuj pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał w T-B-S-T-T.
Umieść wysuszone szkiełka na stoliku w komorze barwienia. Powoli dodawaj 500 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego, aby pokryć całą powierzchnię. Następnie przykryj komorę barwienia, aby zablokować światło zewnętrzne i trzymaj ją przez noc w temperaturze pokojowej następnego dnia, myj szkiełka trzy razy przez pięć minut za każdym razem buforem TBST.
Następnie wysusz je w ciemności. Teraz przygotuj drugorzędową mieszaninę przeciwciał w T-B-S-T-T. Następnie umieść suche szkiełka w komorze barwienia.
Dodać 500 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego. Powoli przykryj komorę barwienia i trzymaj ją z dala od światła zewnętrznego przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej po zakończeniu barwienia wtórnego, umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut za każdym razem buforem TBST, po wysuszeniu wysusz szkiełka w ciemności. Dodaj rozwiązanie montażowe do zjeżdżalni.
Ostrożnie przykryj je szkiełkami nakrywkowymi, aby zapobiec wprowadzeniu jakichkolwiek pęcherzyków. Następnie trzymaj szkiełka w ciemności przez co najmniej dwie godziny przed kolejną analizą i wykonaniem analizy poklatkowej lub konwojowej na barwionej tkance. Neurogeneza hipokampa u dorosłych jest przedstawiona w strefie subziarnistej zakrętu zębatego.
Aktywowana radialna komórka glejowa, podobna do komórki macierzystej typu pierwszego, przechodzi przez odrębne fazy, różnicując się, dojrzewając i funkcjonalnie integrując się ze skomplikowaną morfologią z obwodem neuronalnym. Każdą z faz i odpowiednie typy komórek można zidentyfikować na podstawie ich ekspresji kombinacji markerów. MCM dwa jest markerem proliferacji, który ulega ekspresji we wszystkich typach mitotycznych komórek progenitorowych, podczas gdy neina ulega ekspresji wśród promieniowych i niepromieniowych komórek glejowych, takich jak komórki macierzyste.
Ponieważ przodkowie typu drugiego A różnicują zagnieżdżoną ekspresję, jest najpierw wyłączana. Anty TBR dwa wzrosty ekspresji w postmitotycznym pregenitorze MCM dwa ekspresja jest tracona, podczas gdy ekspresja DCX i NEWAN dyktują migrację i dojrzewanie do funkcjonalnego neuronu. Jest to reprezentatywny obraz konfokalny fioletowego MCM, dwóch zielonych nestonów i czerwonego dappy barwienia.
Powiększone obrazy w pudełkach pokazują promienisty przodek podobny do GL, wyrażający neston MCM dwa i dpi. Oto reprezentatywny obraz konfokalny niebieskiego MCM dwa czerwone, TBR dwa zielone DCX i szare dpi. Barwienie charakterystyki typu komórki progenitorowej typu B pokazano na powiększonych obrazach w polach wyrażających MCM dwa, TBR 2D, c, X i dpi.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o trzech rzeczach. Po pierwsze, wykorzystaj dobrze perfundowaną i utrwaloną tkankę o odpowiedniej grubości korony. Po drugie, mocowanie chusteczki płasko na szkiełkach i zapobieganie uszkodzeniom przy tym.
I wreszcie trzy, dając wystarczająco dużo czasu na gotowanie i późniejsze chłodzenie podczas pobierania antygenu. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak konfokalna rekonstrukcja tkanki i eksperymenty behawioralne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób nowonarodzone neurony mogą integrować się z obwodami hipokampa i przyczyniać się do funkcji poznawczych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać aportowanie antygenu na tkance hipokampa, aby z większą skutecznością uwidocznić prezentowane typy komórek, które dają początek nowym neuronom podczas innej nerwicy hipokampa.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia proces neurogenezy w hipokampie dorosłych, koncentrując się na ekspresji markerów genetycznych w komórkach macierzystych neuronów podczas ich rozwoju w zintegrowane neurony. W badaniu zastosowano indukowane ciepłem odsłanianie antygenów w celu zwiększenia wykrywalności typów komórek progenitorowych w tkance hipokampa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Neurogeneza
Wstęp
- Neurogeneza u osobników dorosłych zachodzi w hipokampie.
- Neuronalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Identyfikacja komórek progenitorowych jest kluczowa dla zrozumienia neurogenezy.
- Techniki odsłaniania antygenów poprawiają wizualizację tych komórek.
Cel badania
- W celu wizualizacji typów komórek progenitorowych w tkance hipokampa.
- W celu zwiększenia wykrywalności komórek uczestniczących w neurogenezie.
- W celu zrozumienia etapów rozwojowych nowo powstałych neuronów.
Zastosowane metody
- Pobieranie perfundowanej tkanki mózgu myszy.
- Wycinanie cienkich przekrojów koronalnych mózgu.
- Gotowanie preparatów z tkanką w celu odsłonięcia antygenów.
- Barwienie tkanki za pomocą przeciwciał pierwotnych i wtórnych.
Główne wyniki
- Ulepszona wizualizacja typów komórek progenitorowych.
- Identyfikacja markerów genetycznych podczas neurogenezy.
- Skuteczne zastosowanie termicznie indukowanego odsłaniania antygenów.
- Wnioski dotyczące integracji nowo powstałych neuronów w obwodach.
Wnioski
- Odzyskiwanie antygenu jest skuteczną metodą w badaniach nad neurogenezą.
- Zrozumienie roli komórek progenitorowych wspiera badania w dziedzinie neuronauki.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu uzyskania wiedzy o potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Odzyskiwanie antygenów indukowane ciepłem usprawnia detekcję i identyfikację typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy w hipokampie dorosłych, rozwiązując kluczowy problem w neurobiologii i odkrywaniu leków ukierunkowanych na OUN. Poprawiona wizualizacja odrębnych populacji neuronowych komórek macierzystych i progenitorowych umożliwia dokładniejszą walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach projektów badawczych w dziedzinie neuronauki. Możliwość ta wspiera badania translacyjne nad zaburzeniami neurorozwojowymi i neuropsychiatrycznymi, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji dotyczących portfela badań oraz strategii w zakresie biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną identyfikację podtypów progenitorów neuronalnych, co jest kluczowe dla walidacji celów w badaniach nad neurogenezą.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie etapów rozwojowych i zależności liniowych w hipokampie.
- Zwiększa pewność prognostyczną w powiązywaniu fenotypów komórkowych z mechanizmami istotnymi dla przebiegu chorób.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zwiększa czułość i swoistość testu w wykrywaniu rzadkich lub w inny sposób maskowanych typów komórek progenitorowych.
- Standaryzuje przepływy pracy w immunohistochemii w celu uzyskania powtarzalnych odczytów ilościowych w różnych eksperymentach.
- Przygotowuje zwalidowane systemy tkankowe do dalszego screeningu związków i analizy fenotypowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia detekcję markerów komórkowych ze strategiami biomarkerów translacyjnych w modelach chorób OUN.
- Umożliwia przejście od mechanistycznych badań na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji interwencji neurogennych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów modulujących neurogenezę.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając wiarygodną identyfikację populacji progenitorów neuronalnych w utrwalonej tkance mózgowej, co wspiera zarówno badania oparte na hipotezach, jak i rozwój ilościowych testów analitycznych.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia wiarygodną detekcję markerów rozwojowych do testowania hipotez i wyjaśniania szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki immunohistochemiczne w celu weryfikacji gotowości testu.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą liczebności komórek progenitorowych oraz ekspresji markerów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie fenotypów komórkowych do punktów końcowych istotnych dla choroby w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia znormalizowany, skalowalny protokół analizy tkanki OUN we wszystkich programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność analiz opartych na tkankach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz alokację kapitału w portfelach neurobiologicznych.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka w obszarze odkrywania leków na OUN oraz zasobów przedklinicznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuroanatomii, immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej.
- Wymaga dostępu do wysokiej jakości infrastruktury do przetwarzania tkanek i obrazowania.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów fiksacji, sekcjonowania i barwienia pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych obszarów mózgu lub specyficznych dla gatunku cech tkanki.
- Zależne od zwalidowanych paneli przeciwciał oraz rygorystycznej kontroli warunków odsłaniania antygenów.
