Name: Odzyskiwanie antygenu wywołane ciepłem: skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę odzyskiwania antygenu wywołanego ciepłem do wizualizacji komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa u myszy. Technika ta umożliwia skuteczną identyfikację markerów genetycznych i etapów rozwoju nowych neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Metodologia została pierwotnie opracowana w laboratorium dr Hongjun Songa w Instytucie Inżynierii Komórkowej, Wydziale Neurologii, Johns Hopkins School of Medicine. Praca ta została sfinansowana przez NIMH (R00MH090115), NARSAD, Bratni Zakon Orłów' Mayo Cancer Research Fund oraz pakiet startowy od fundacji Mayo przyznany M.H.J. i Basic Science Research Program za pośrednictwem National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (A3014385) przyznany W.R.K.

1. Pre-immunohistochemia: Perfuzja i histologia
<ol>
	<li>Perfuzja myszy zgodnie z ogólnym protokołem transsercowym dostosowanym do myszy i ekstrakcja mózgów do 4% paraformaldehydu (PFA)9.</li>
	<li>Pozostawić mózgi w PFA na noc w temperaturze 4 °C (np. stożkowa probówka o pojemności 10 ml wypełniona PFA). Przechowywać w PFA przez co najmniej 12-24 godziny, nie dłużej niż 36 godzin dla pełnego utrwalenia. Po całonocnym utrwaleniu opróżnij PFA ze stożkowej rurki, ale pozostaw mózgi w środku. Wlej 30% sacharozy do probówki i myj mózgi przez krótkie 5 sekund, aby usunąć wszelkie pozostałości PFA. Na koniec ponownie napełnij probówkę zawierającą mózgi 30% sacharozy. Utrzymuj mózgi w sacharozie w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno rurki.</li>
	<li>Wytnij skrawki mózgu o grubości 40 μm na mikrotomie. Skonsultuj się z atlasem mózgu myszy, aby rozpocząć zbieranie skrawków od początku zakrętu zębatego do jego końca. Zachowaj skrawki w roztworze niezamarzającym (prosty przepis to 300 g sacharozy w 500 ml 0,1 M PBS i 300 ml glikolu etylenowego) do momentu, gdy będą gotowe do immunohistochemii.</li>
	<li>Zamontuj przeciętą tkankę na szkiełkach mikroskopowych specjalnie zaprojektowanych tak, aby silnie przylegały do tkanki. Szkiełka te zapewniają mocne trzymanie tkanki na etapie gotowania. Po zamontowaniu chusteczki należy pozostawić szkiełko do wyschnięcia na 10 minut lub do całkowitego wyschnięcia. Suszenie można przyspieszyć, jeśli szkiełko opiera się o pionową powierzchnię, a dolna krawędź szkiełka opiera się na ręczniku papierowym. Jeśli montowana jest więcej niż jedna prowadnica, pozostałe prowadnice można w tym czasie pozostawić suche (1-2 godziny), aż będą gotowe do przejścia do następnego kroku.</li>
	<li>Po wyschnięciu szkiełka przemyć PBS trzy razy przez 5 minut każdy i ponownie wysuszyć (bufor PBS = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na2PO4). Gwarantuje to, że wszelkie wcześniejsze substancje chemiczne (takie jak glicerol z roztworu do przechowywania zapobiegającego zamarzaniu) są wystarczająco usuwane i nie mogą pogorszyć przylegania tkanki do szkiełka.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników i drobnego sprzętu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór A (0,1 M lub 19,21 g/l kwasu cytrynowego) i roztwór B (0,1 M lub 24,9 g/l cytrynianu tris-sodu), w których zostaną zagotowane skrawki tkanki.</li>
	<li>W cylindrze miarowym połączyć 9 ml roztworu A i 41 ml roztworu B. Dodać 450 ml ddH2O do tej mieszaniny.</li>
	<li>Wlej tę mieszaninę do pustego pojemnika (np. pustego pudełka po końcówkach do pipet), który można używać w kuchence mikrofalowej.</li>
</ol>
3. Pobieranie antygenu pod wpływem ciepła
<ol>
	<li>Gotuj roztwór przygotowany w kroku 2 przez 5 minut przy standardowym ustawieniu w standardowej kuchence mikrofalowej. Roztwór zacznie wrzeć w temperaturze 100 °C lub wyższej.</li>
	<li>Po zakończeniu gotowania ostrożnie wyjmij pojemnik z kuchenki mikrofalowej i umieść w nim wysuszone szkiełka, upewniając się, że powierzchnia szkiełka z sekcjami hipokampa jest skierowana w dół i jest całkowicie wystawiona na działanie płynu. Jeśli to możliwe, umieść slajdy pod kątem przy ściankach pudełka i ułóż wokół nich inne slajdy. Upewnij się, że ich "dopasowanie" do pudełka jest szczelne, aby prowadnice nie miały miejsca na przesuwanie się jedna na drugiej.</li>
	<li>Gotuj tę mieszaninę ze szkiełkami przez 7 minut przy standardowych ustawieniach w kuchence mikrofalowej. W tym czasie roztwór zagotuje się w temperaturze 100 °C lub wyższej.</li>
	<li>Podczas tego etapu gotowania napełnij dwa wiadra lodu do połowy lodem.</li>
	<li>Po zakończeniu gotowania w kroku 3.3 wyjmij pojemnik z kuchenki mikrofalowej i umieść go w jednym z wiader na lód. Wlej resztę lodu z drugiego wiadra dookoła pojemnika i całkowicie go przykryj. Pozostaw na 1 godzinę.</li>
</ol>
4. Barwienie przeciwciał pierwotnych i wtórnych
<ol>
	<li>Pod koniec 1 godzinnego okresu oczekiwania wyjmij szkiełka z pojemnika i umyj buforem TBS-T 3x przez 5 min każda. Do wykonywania tych podstawowych myć można używać dowolnej aparatury. (Bufor TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05% bufor Triton X-100 TBS, TBS-TT = 4% bufor TBS-T surowicy osła).</li>
	<li>Po umyciu pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu (np. w szufladzie ławki, włóż ręcznik papierowy do szuflady i przechyl suwak w stosunku do niego) przez 5-10 min lub do całkowitego wyschnięcia. W tym okresie należy przygotować komorę do nocnego barwienia przeciwciałami pierwotnymi. Prosta komora barwienia może składać się z pojemnika o dużej powierzchni wypełnionegoddH2Ooraz stolika wewnątrz pojemnika, na którym szkiełko może być oparte powyżejddH2O.</li>
	<li>Po wyschnięciu szkiełka narysuj kontur wokół odcinków tkanki za pomocą wodoodpornego pisaka. W kroku 4.5 ten kontur działa jak bariera zapobiegająca przepływaniu mieszaniny przeciwciał.</li>
	<li>Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał w TBS-TT. Do pokrycia jednego całego szkiełka wymagane jest co najmniej 500 μl, na przykład, jeśli zapas przeciwciał jest w stężeniu 1:500, dodać 1 μl danego przeciwciała do 500 μl TBS-TT). Wykorzystaj przeciwciała pierwszorzędowe, jak wspomniano w tabeli odczynników.</li>
	<li>Umieść wysuszone szkiełko na stoliku w komorze barwienia. Powoli dodawać 500 μl przeciwciał pierwszorzędowych i pokryć całą powierzchnię. Przykryj całe urządzenie i zawiń w folię aluminiową, aby zablokować światło zewnętrzne. Pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Następnego dnia umyj szkiełko trzy razy po 5 minut buforem TBS-T. Pozostaw do wyschnięcia w ciemnym miejscu, jak opisano w kroku 4.2.</li>
	<li>Przygotować drugorzędową mieszaninę przeciwciał podobną do kroku 4.4. Zapoznaj się z tabelą odczynników dla przeciwciał drugorzędowych.</li>
	<li>Umieścić wysuszone szkiełko w komorze barwienia zgodnie z opisem w krokach 4.2 i 4.5. Powoli dodawać 500 μl przeciwciał drugorzędowych i pokryć całą powierzchnię. Owiń komorę barwienia folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem zewnętrznym. Pozostaw pod przykryciem i chroń przed światłem zewnętrznym przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po zakończeniu wtórnego barwienia umyj szkiełko trzykrotnie po 5 minut buforem TBS-T. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia w ciemnym miejscu. Po wyschnięciu nałożyć roztwór montażowy i przykryć szkiełko szkiełkiem nakrywkowym, ostrożnie zapobiegając wprowadzeniu pęcherzyków. Pozostaw szkiełko w ciemnym miejscu na co najmniej 2 godziny przed dalszą analizą.</li>
	<li>Wykonaj analizę poklatkową lub konfokalną na barwionej tkance.</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Santarelli, L., Saxe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hippocampal+neurogenesis+for+the+behavioral+effects+of+antidepressants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants.</a> Science. 301 (5634), 805-809 (2003).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).</li>
<li>Clelland, C. D., Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325 (5937), 210-213 (2009).</li>
<li>Wang, J. W., David, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoxetine+stimulates+maturation+and+synaptic+plasticity+of+adult-born+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).</li>
<li>D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+antigen+retrieval+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).</li>
<li>Daneshtalab, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+frizzled-related+protein+3+regulates+activity-dependent+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-thermal+effects+of+microwaves+on+proteins%3A+Thermophilic+enzymes+as+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system.</a> FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).</li>
<li>Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visualization+of+a+new+class+of+traumatically+injured+axons+through+the+use+of+a+modified+method+of+microwave+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval.</a> Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najważniejszymi etapami skutecznego pobierania antygenu i barwienia typów komórek progenitorowych są: 1) wykorzystanie dobrze perfundowanej i utrwalonej tkanki o optymalnej grubości koronalnej; 2) pozostawienie wystarczającej ilości czasu na wrzenie, a następnie schłodzenie podczas pobierania antygenu; 3) manualna zręczność w montażu stałych odcinków koronowych i zapobieganiu przy tym ich uszkodzeniom.
W IHC bardzo ważne jest, aby używać perfundowanej tkanki, która została poddana wystarczając...

Neurogeneza, czyli generowanie nowych neuronów z nerwowych komórek macierzystych, jest obecnie znana z tego, że w wieku dorosłym zachodzi w dwóch wyspecjalizowanych regionach mózgu. Należą do nich strefa podkomorowa (SVZ) opuszki węchowej i strefa subziarnista (SGZ) zakrętu zębatego w hipokampie. W ciągu ostatniej dekady w dziedzinie neurogenezy hipokampa u dorosłych przeprowadzono znaczące prace. Region ten cieszy się dużym zainteresowaniem, ponieważ nowonarodzone neurony w SGZ przyczyniają się do zwiększenia plastyczności neuronalnej, która może podtrzymywać określone funkcje mózgu1-5. Uważa się, że neurogeneza hipokampa u dorosłych odgrywa ważną rolę w regulacji nastroju, regeneracji oraz uczeniu się i pamięci. W związku z tym podjęto wspólne wysiłki, aby zrozumieć rozwój i regulację neuronów w tej bogatej niszy neurogennej.
Nieuniknionym i ważnym aspektem badania neurogenezy hipokampa u dorosłych jest identyfikacja oddzielnych etapów, przez które przechodzi aktywowana nerwowa komórka macierzysta na drodze do stania się w pełni funkcjonalnym neuronem. W tym procesie aktywowana jest spoczynkowa nerwowa komórka macierzysta i przechodzi przez szereg wczesnych aktywnych i późnych aktywnych typów komórek progenitorowych (ryc. 1). Te odrębne populacje neuronalnych komórek progenitorowych można zidentyfikować na podstawie morfologii i ekspresji markerów molekularnych, takich jak MCM2, nestyna, Tbr2 i Doublecortin (DCX) oraz NeuN, które kierują konwersją RGL do odpowiednich typów komórek progenitorowych. Nestyna jest pośrednim białkiem filamentowym, które ulega ekspresji w promienistych komórkach glejowych i niektórych wczesnych typach komórek progenitorowych. Innym markerem jest Tbr2, który ulega specyficznej ekspresji w amplifikujących komórkach progenitorowych. Ekspresja transgenu Tbr2 jest początkowo wyłączona w komórkach typu 1 (podobnych do gleju promieniowego), włączana w progenitorach typu 2a, typu 2ab i typu 2b i wyłączana wśród bardziej zróżnicowanych neuronów typu 3 i niedojrzałych (ryc. 1). DCX jest markerem migracji neuronów, który ulega ekspresji w progenitorach neuronalnych typu 2ab, typu 2b i typu 3. Korzystając z tej kombinacji trzech markerów, możemy oznaczyć różne podtypy neuronalnych komórek progenitorowych. Należą do nich Typ-1 (MCM2 + nestyna + Tbr2-), Typ 2a (MCM2 + nestyna + Tbr2 +), Typ 2ab (częściowy MCM2 + nestyna-Tbr2 + i częściowy MCM2 + Tbr2 + DCX-), Typ-2b (MCM2 + Tbr2 + DCX +) i Typ 3 (MCM2 + Tbr2-DCX +). Komórki postmitotyczne, takie jak niedojrzałe i funkcjonalnie zintegrowane neurony, można zidentyfikować, wykorzystując DCX i marker dojrzałych neuronów, NeuN.
Tradycyjne metody IHC wykorzystują przeciwciała do identyfikacji antygenów dla określonych typów komórek na podstawie ekspresji ich genów. Późniejsza wizualizacja za pomocą technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikroskopia konfokalna, może być wykorzystana do ich identyfikacji. Jednak obecnie istnieją problemy z tymi metodami, które nie pozwalają na skuteczną identyfikację promienistych komórek glejowych i wczesnych typów komórek progenitorowych. Trudno jest zidentyfikować te konkretne typy komórek, ponieważ zastosowane przeciwciało nie jest w stanie przeniknąć i skutecznie związać białka gniazdowego. Nestyna jest pośrednim białkiem filamentowym, które obejmuje procesy promieniowe wytwarzane przez promienistą komórkę glejową. Nieefektywne wiązanie przeciwciała z antygenem może wynikać z wielu czynników, w tym czasu utrwalania, temperatury i zastosowanej techniki6-7. Aby pomóc w rozwiązaniu takich problemów, opracowaliśmy metodę pobierania antygenu lub "gotowania". Oprócz nestyny, ta metoda pobierania antygenu poprawia również barwienie innych markerów, takich jak Ki67, BrdU, kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP), Tbr2 i MCM2. Nasza metoda łączy w sobie podejście chemiczne i fizyczne. Polega ona na chemicznym utrwaleniu tkanki w paraformaldehydzie, a następnie wrzeniu w wysokiej temperaturze cienkich koronalnych odcinków hipokampa w buforze środka denaturacyjnego i chaotropowego. Zwiększa to dostępność antygenu dla przeciwciała, poprawia swoistość przeciwciał i umożliwia lepszą identyfikację typów komórek progenitorowych. Nasze podejście jest proste w użyciu, wymaga w większości narzędzi i odczynników już dostępnych w laboratorium. Wykorzystaliśmy go szeroko do badania rozwoju nerwowych komórek macierzystych i ich regulacji poprzez wewnętrzne czynniki genetyczne lub zewnętrzne czynniki środowiskowe8.

<table><tbody><tr><td>Prowadnica SuperFrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>Zapewnia silne przyleganie do tkanki hipokampa podczas gotowania</td></tr><tr><td>PVA/DABCO Media montażowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10981-100 ml</td><td> </td></tr><tr><td>Nestin (kurczak) </td><td>Aves Lab</td><td>NES</td><td>Marker nerwowych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>GFAP (królik)</td><td>Dako Ameryka Północna</td><td>Z033401-2</td><td>Marker astrocytów i nerwowych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>MCM2 (mysz)</td><td>Laboratorium transdukcji BD</td><td>610701</td><td>Marker proliferacji</td></tr><tr><td>DCX (koza)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC8066</td><td>Marker niedojrzałego neuronu</td></tr><tr><td>Tbr2 (królik)</td><td>Abcam</td><td>Ab23345</td><td>Amplifikujący marker progenitorowy</td></tr><tr><td>NeuN (mysz)</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>Marker dojrzałego neuronu</td></tr><tr><td>Cy2 (anty-królik)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-226-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy2 (anty-kurczak)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>303-165-006</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (anty-mysz)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>315-175-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5 (anty-koza)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>305-165-047</td><td> </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td> </td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>S2002</td><td>Dako</td><td>Wodoodporny długopis</td></tr></tbody></table>

odzyskiwanie antygenu wywołane ciepłem: skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Tradycyjne metody immunohistochemii (IHC) po utrwaleniu tkanek pozwalają na wizualizację różnych typów komórek. Zazwyczaj postępują one z zastosowaniem przeciwciał w celu wiązania antygenów i identyfikacji komórek o cechach będących funkcją wrodzonej biologii i rozwoju. Neurogeneza hipokampa u dorosłych osób jest sekwencyjnym procesem, w którym spoczynkowa nerwowa komórka macierzysta może zostać aktywowana i przejść przez etapy proliferacji, różnicowania, dojrzewania i integracji funkcjonalnej. Każda faza jest odrębna z charakterystyczną morfologią i regulacją w górę genów. Identyfikacja tych faz jest ważna, aby zrozumieć mechanizmy regulacyjne i wszelkie zmiany w tym procesie, które leżą u podstaw patofizjologii wyniszczających zaburzeń. Nasze podejście do odzyskiwania antygenu indukowanego ciepłem poprawia intensywność wykrywanego sygnału i umożliwia prawidłową identyfikację typu komórki progenitorowej. Jak omówiono w tym artykule, w szczególności pozwala nam to obejść obecne problemy z wykrywaniem niektórych typów komórek progenitorowych.

Neurogeneza w obrębie hipokampa osób dorosłych jest procesem sekwencyjnym, w którym reprezentatywny typ komórek progenitorowych na każdym etapie można zidentyfikować za pomocą kombinacji markerów. Staranna fiksacja chemiczna oraz odzyskiwanie antygenów zwiększają skuteczność i dostępność markerów, które w przeciwnym razie są trudne do wykrycia. Jednym z nich jest nestyna, która wykazuje ekspresję w neuronalnych komórkach macierzystych o charakterze glei radialnej oraz w niektórych wczesnych aktywnych typach komórek proge...

Podczas neurogenezy dorosłego hipokampa, wyraźny zestaw markerów genetycznych ulega ekspresji, gdy spokojna nerwowa komórka macierzysta sekwencyjnie rozwija się i rozwija w funkcjonalnie zintegrowany neuron w obwodzie. Korzystając z indukowanego ciepłem odzyskiwania antygenu, typy komórek progenitorowych, które w innym przypadku są trudne do wykrycia, są identyfikowane z większą skutecznością.

Odzyskiwanie antygenu wywołane ciepłem: skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie odsłonięcia antygenów w tkance hipokampa mózgu, aby lepiej zwizualizować typy komórek progenitorowych, z których powstają nowonarodzone neurony. Osiąga się to poprzez pobranie perfundowanego mózgu myszy, wycięcie cienkich przekrojów czołowych i zamocowanie tych przekrojów na szkiełku przedmiotowym specjalnie zaprojektowanym do silnego przylegania do tkanki. Drugim krokiem jest zagotowanie szkiełek z tkanką przy zastosowaniu odpowiedniej obróbki oraz zapewnienie wystarczającego czasu na ochłodzenie.Następnie należy przeprowadzić nocne barwienie tkanki przeciwciałami pierwszorzędowymi. Ostatnim krokiem jest wykonanie następnego dnia barwienia tkanki przeciwciałami drugorzędowymi przez co najmniej dwie godziny. W końcowym etapie należy zwizualizować poszczególne typy komórek progenitorowych na różnych etapach rozwoju podczas neurogenezy dorosłych w tkance hipokampa, wykorzystując mikroskopię poklatkową lub konfokalną.Witam, nazywam się Hun Jo, jestem pracownikiem postdoktorskim w laboratorium dr. Iana Johna w Mayo Clinic. Głównym celem laboratorium dr. Johna jest badanie procesów neurogenezy w zaburzeniach neurologicznych i psychiatrycznych. Naszym nadrzędnym celem jest skuteczne przełożenie tej wiedzy na zastosowania terapeutyczne, prezentując naszą procedurę odzyskiwania antygenów, a ze mną jest Quam Hui oraz John z naszego laboratorium.Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami immunohistochemii jest to, że umożliwia ona skuteczną wizualizację odrębnych typów komórek podczas neurogenezy hipokampa u osobników dorosłych. Typy komórek te, w tym prekursorowe komórki macierzyste układu nerwowego, które w przeciwnym razie są trudne do wykrycia, mogą być wydajnie znakowane i wizualizowane przy użyciu naszej metody odzyskiwania antygenu. Metoda ta pozwoli na lepsze zrozumienie rozwoju i regulacji nowo powstałych neuronów podczas neurogenezy hipokampa u osobników dorosłych.Dla osób zainteresowanych badaniem zaburzeń psychicznych i leczeniem farmakologicznym, nasza metoda odsłaniania antygenów okaże się przydatna w badaniu roli rozwoju neuronalnego podczas patogenezy tej choroby. Rozpocznij procedurę, umieszczając mózg z perfundowanej myszy w 4% paraformaldehydzie w 10 mililitrowej probówce stożkowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsius, lub przez co najmniej 12 do 24 godzin, ale nie więcej niż 36 godzin, aby uzyskać pełną fiksację. Po nocnej fiksacji usuń PFA i pozostaw mózg w probówce stożkowej.Następnie należy przepłukać mózg 30% sacharozą, aby usunąć pozostałości PFA, a następnie wylać sacharozę. Potem ponownie należy napełnić probówkę 30% sacharozą i przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż mózg opadnie na dno probówki. Następnie należy wykroić z hipokampa 40 mikrometer plastry mózgu przy użyciu mikrotomu.Przechowywać przekroje w roztworze przeciwzamrażającym do momentu rozpoczęcia procedury immunohistochemii. Następnie przymocować skrawki do szkiełek przedmiotowych specjalnie zaprojektowanych do silnego wiązania tkanki. Po przymocowaniu tkanki pozostawić szkiełka do wyschnięcia na około 10 minut.Proces suszenia można przyspieszyć, opierając preparaty o pionową powierzchnię na ręczniku papierowym, aby zapewnić całkowite usunięcie poprzednich odczynników. Po wyschnięciu preparatów należy je przemyć PBS 3 razy, po pięć minut za każdym razem. Następnie należy je ponownie wysuszyć.W tej procedurze należy przygotować roztwór do gotowania tkanek zgodnie z opisem w załączonym manuskrypcie. Następnie roztwór należy gotować przez pięć minut w standardowej kuchence mikrofalowej przy standardowym ustawieniu. Po zakończeniu gotowania należy ostrożnie wyjąć pojemnik z kuchenki mikrofalowej.Następnie przenieś wysuszone szkiełka do roztworu. Upewnij się, że strona z przekrojami hipokampa jest w pełni zanurzona w roztworze. Jeśli to możliwe, ustaw szkiełka pod kątem przy ściankach naczynia i ułóż wokół nich pozostałe szkiełka.Następnie gotuj mieszaninę z nasuniętymi preparatami przez siedem minut w kuchence mikrofalowej przy standardowych ustawieniach. W tym czasie wypełnij dwa wiaderka z lodem w połowie krą lodową. Po zakończeniu gotowania wyjmij pojemnik z kuchenki mikrofalowej i umieść go w jednym z wiaderek z lodem.Wsyp pozostały lód z drugiego wiadra wokół pojemnika, tak aby całkowicie go przykryć. Następnie pozostaw go na jedną godzinę. Po upływie godziny wyjmij preparaty z pojemnika.Przemyć je buforem TBST trzykrotnie po pięć minut za każdym razem. Następnie wysuszyć preparaty w ciemności od 5 do 10 minut lub do całkowitego wyschnięcia slajdu. W międzyczasie przygotować komorę z DDH₂O do nocnego barwienia przeciwciałem pierwszorzędowym.Po wyschnięciu preparatów należy obrysować przekroje tkankowe wodnym pisakiem nierozcierającym. Obrys ten stanowi barierę zapobiegającą rozlewaniu się mieszaniny przeciwciał. Następnie należy przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych w T-B-S-T-T.Umieść wysuszone preparaty na podstawkach w komorze barwiącej. Powoli dodaj 500 µl przeciwciała pierwszorzędowego, aby pokryć całą powierzchnię. Następnie przykryj komorę barwiącą, aby zablokować dostęp światła zewnętrznego, i pozostaw preparaty przez noc w temperaturze pokojowej; następnego dnia przemyj preparaty trzy razy przez pięć minut za każdym razem, używając buforu TBST.Następnie wysuszyć je w ciemności. Teraz przygotować mieszaninę przeciwciał wtórnych w T-B-S-T-T. Następnie umieścić wysuszone preparaty w komorze barwiącej.Dodaj 500 µL przeciwciała wtórnego. Powoli przykryj komorę barwiącą i chroń ją przed światłem zewnętrznym przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej; po zakończeniu barwienia wtórnego przemyj preparaty trzy razy, za każdym razem przez pięć minut, używając buforu TBST. Wysusz preparaty w ciemności, a następnie nałóż na nie medium montażowe.Ostrożnie przykryj je szkiełkami podstawkowymi, aby zapobiec powstaniu pęcherzyków powietrza. Następnie przechowuj preparaty w ciemności przez co najmniej dwie godziny przed kolejną analizą oraz wykonaniem analizy time-lapse lub konfokalnej barwionej tkanki. Neurogeneza w hipokampie dorosłych jest widoczna w strefie podziarnistej zakrętu zębatego.Aktywowana komórka macierzysta typu pierwszego, przypominająca glej promieniisty, przechodzi przez odrębne fazy podczas różnicowania, dojrzewania i funkcjonalnej integracji z obwodem neuronalnym, wykształcając przy tym złożoną morfologię. Każda z faz oraz odpowiadające im typy komórek mogą być identyfikowane na podstawie ekspresji kombinacji markerów. MCM2 jest markerem proliferacji ekspresjonowanym we wszystkich mitotycznych typach komórek progenitorowych, podczas gdy nestin jest ekspresjonowany w komórkach macierzystych przypominających glej promieniisty i niepromieniisty.W miarę różnicowania się progenitorów typu A2, zagnieżdżona ekspresja jest najpierw wyłączana. Ekspresja anti TBR2 wzrasta w postmitotycznym progenitorze, podczas gdy ekspresja MCM2 zanika, a ekspresja DCX i NEUN determinuje migrację i dojrzewanie do funkcjonalnego neuronu. Jest to reprezentatywny obraz konfokalny z barwieniem na MCM2 (fioletowy), nestynę (zielony) i DAPI (czerwony).Powiększone obrazy w ramkach przedstawiają radialny progenitor typu GL wykazujący ekspresję nestin, MCM2 i dpi. Przedstawiono reprezentatywny obraz konfokalny z barwieniem na MCM2 (kolor niebieski), TBR2 (kolor czerwony), DCX (kolor zielony) oraz dpi (kolor szary). Charakterystyczne dla typu komórek progenitorowych typu 2B barwienie, wykazujące ekspresję MCM2, TBR2, DCX i dpi, widoczne jest na powiększonych obrazach w ramkach.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o trzech kwestiach. Po pierwsze, należy wykorzystać dobrze perfundowaną i utrwaloną tkankę o odpowiedniej grubości cięcia w płaszczyźnie wieńcowej. Po drugie, należy płasko zamocować tkankę na szkiełkach, zapobiegając przy tym jakimkolwiek uszkodzeniom.I na koniec, po trzecie, należy zapewnić odpowiedni czas na gotowanie i późniejsze chłodzenie podczas odsłaniania antygenów. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak konfokalna rekonstrukcja tkanki i eksperymenty behawioralne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób nowo powstałe neurony mogą integrować się w obrębie obwodów hipokampa i przyczyniać się do funkcji poznawczych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić odsłanianie antygenów w tkance hipokampa, aby z większą skutecznością wizualizować reprezentatywne typy komórek, z których powstają nowe neurony podczas neurogenezy w hipokampie.

heat-induced-antigen-retrieval-an-effective-method-to-detect-identify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Regeneracja antygenu indukowana ciepłem: Skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy hipokampu u dorosłych

Wideo ilustruje metodę barwienia immunofluorescencyjnego używaną do badania neurogenezy w dorosłym hipokampie. Początkowo wycinek mózgu myszy jest poddawany leczeniu pierwotnymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko białkom markerowym związanym z neurogenezą w neuronalnych komórkach progenitorowych. Następnie jest znakowany przeciwciałami drugorzędowymi oznaczonymi fluoroforami. Sekcja mózgu jest następnie obserwowana pod mikroskopem konfokalnym w celu rozróżnienia różnych podtypów komórek...

Technika barwienia immunofluorescencyjnego do wykrywania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Ten film demonstruje procedurę barwienia nowo rozmnożonych nerwowych komórek macierzystych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą inkorporacji EdU, a następnie immunofluorescencji w celu wizualizacji określonych białek, zwiększając zrozumienie dynamiki i proliferacji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Opisujemy protokół immunohistochemiczny do badania profilu aktywacji neuronów hipokampa po ekspozycji na zadanie uczenia przestrzennego w modelu mysim charakteryzującym się deficytami poznawczymi pochodzenia neurorozwojowego. Protokół ten może być stosowany zarówno do genetycznych, jak i farmakologicznych modeli myszy charakteryzujących się deficytami poznawczymi.

Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Ten artykuł przedstawia cztery najpopularniejsze techniki wizualizacji komórek BrdU dodatnich do pomiaru neurogenezy u dorosłych szczurów. Praca ta zawiera instrukcje dotyczące przygotowania odczynników, podawania analogu tymidyny, perfuzji przezsercowej, przygotowania tkanek, reakcji immunohistochemicznej peroksydazy, immunofluorescencji, wzmocnienia sygnału, barwienia przeciwstawnego, obrazowania mikroskopowego i analizy komórek.

Techniki immunohistochemiczne do analizy proliferacji komórkowej i neurogenezy u szczurów przy użyciu analogu tymidyny BrdU

Autoimmunologiczne zapalenie mózgu to nowa kategoria chorób ośrodkowego układu nerwowego wywołanych przez przeciwciała. Neurony hipokampa mogą być wykorzystane do odkrycia i scharakteryzowania tych przeciwciał. W artykule przedstawiono protokół pierwotnej hodowli komórek i barwienia immunologicznego w celu określenia autoprzeciwciał w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów.

Hodowle neuronów hipokampa w celu wykrywania i badania nowych patogennych przeciwciał zaangażowanych w autoimmunologiczne zapalenie mózgu

Przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych, generowanych przez programowanie neuronalne, może być potencjalnym podejściem do leczenia zaburzeń neurorozwojowych. Protokół ten opisuje wytwarzanie i przeszczepianie prekursorów neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do mózgów nowonarodzonych myszy, umożliwiając długoterminowe badanie przeszczepionych neuronów i ocenę ich potencjału terapeutycznego.

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

Przedstawiona tutaj jest metoda sekwencjonowania pojedynczych jąder wyizolowanych z mysiego zakrętu zębatego, która wyklucza większość neuronów poprzez sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FAN). Takie podejście pozwala na uzyskanie wysokiej jakości profili ekspresji i ułatwia badanie większości innych typów komórek reprezentowanych w niszy, w tym rzadkich populacji, takich jak nerwowe komórki macierzyste.

Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

Poznaj metodę odzyskiwania antygenu wywołanego ciepłem do wizualizacji komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa u myszy. Technika ta umożliwia skuteczną identyfikację markerów genetycznych i etapów rozwoju nowych neuronów.

Odzyskiwanie antygenu wywołane ciepłem: skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa (Wideo) | JoVE Journal

Odzyskiwanie antygenu wywołane ciepłem: skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa

Przeglądaj więcej filmów