Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Ogólnym celem niniejszej procedury jest integracja transgenicznych macierzy pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans przy użyciu naświetlania promieniami ultrafioletowymi. Najpierw należy wybrać linię transgeniczną o jak najwyższym współczynniku transmisji, idealnie powyżej 80%. Następnie wyselekcjonowane larwy L4 linii transgenicznej należy naświetlić promieniami UV, a z każdej wybranej płytki F1 wyizolować po cztery fluorescencyjne zwierzęta transgeniczne F2. W kolejnym kroku należy przebadać płytki F2 w celu wyłonienia osobników transgenicznych wykazujących 100% fluorescencji.

Krzyżowano pokolenie F3 robaków. Ostateczny wybór zwierząt fluorescencyjnych z pokolenia F3 może wykazać 100% dziedziczenia transgenu. To podejście eksperymentalne jest odpowiednie dla linii transgenicznych, które przekazują dodatkowe macierze chromosomowe z wysoką częstotliwością.

Procedurę zaprezentuje Stephanie Belman, technik z naszego laboratorium. Należy rozpocząć od przygotowania 500 dużych szalek Petri zawierających podłoże do wzrostu nicieni. Na każdą płytkę należy zasiać 0,3 ml nasyconej zawiesiny Escherichia coli.

Kultura OP 50. Ocenić stopień transmisji linii transgenicznej przeznaczonej do integracji dla każdej z linii. Za pomocą fluorescencyjnego stereomikroskopu przenieść 10 fluorescencyjnych dorosłych osobników na 10 osobnych płytek z pożywką.

Zwierzęta umieścić w inkubatorze do nicieni ustawionym w temperaturze umożliwiającej reprodukcję tła genetycznego. Monitorować potomstwo każdego dnia, aby ocenić, na którym etapie rozwoju marker z ko-iniekcji ulega ekspresji i może być najlepiej zaobserwowany przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Ocenić stopień transmisji u potomstwa poprzez wyznaczenie procentowej liczby potomstwa fluorescencyjnego.

W celu integracji transgenu należy wybrać linię transgeniczną o najwyższym współczynniku transmisji. Należy uzyskać populację zwierząt transgenicznych zsynchronizowanych w czwartym stadium larwalnym (L4). Do integracji należy przenieść 30 fluorescencyjnych osobników dorosłych GRA na pięć płytek hodowlanych.

Po tym, jak nicienie znosiły jaja przez trzy do czterech godzin w temperaturze 15 °C, sprawdź obecność co najmniej 30 jaj na płytce, a następnie usuń osobniki dorosłe z płytek i hoduj zwierzęta w inkubatorze dla nicieni, aż potomstwo osiągnie stadium larwalne L4. Umieść każdą płytkę zawierającą od 15 do 20 fluorescencyjnych transgenicznych osobników w stadium L4 w urządzeniu do sieciowania UV (UV crosslinker) po zdjęciu pokrywek, a następnie naświetl nicienie w celu regeneracji. Inkubuj naświetlone nicienie przez noc w temperaturze 15 °C.

Sprawdź liczbę zwierząt, które przeżyły. Wskaźnik przeżywalności na poziomie około 80 do 90% jest odpowiedni dla efektywnego napromieniowania. Hoduj napromieniowane zwierzęta w temperaturze od 15 do 25 °C, aż potomstwo osiągnie stadium rozwojowe umożliwiające obserwację ekspresji markera współwstrzykniętego.

Przenieś pojedyncze fluorescencyjne osobniki F1 na oddzielne płytki hodowlane. Przechowuj te płytki F1 w temperaturze od 15 do 25 °C, aż potomstwo osiągnie odpowiedni etap rozwoju umożliwiający obserwację fluorescencyjnych osobników F2, w zależności od zastosowanego markera współobecnego. W tym konkretnym przypadku obserwowaliśmy nicienie w stadium dorosłym i odrzuciliśmy wszystkie płytki F1 wykazujące albo jeden: brak potomstwa, co wskazywało na to, że osobnik F1 był sterylny lub padł, albo dwa: brak lub tylko niewielką liczbę fluorescencyjnych osobników F2, co wskazywało, że osobnik F1 nie przekazał transgenu z oczekiwaną częstotliwością.

Wybierz cztery fluorescencyjne zwierzęta transgeniczne F two z każdej wybranej płytki F1. W przypadku stosowania transgenów fluorescencyjnych należy wybierać nicienie F two o wysokim poziomie fluorescencji, ponieważ może to wskazywać, że zwierzęta te są homozygotami pod kątem zintegrowanego zestawu (array). Należy pamiętać, że podczas wybierania zwierząt F two kluczowe jest, aby nie przenieść wraz z nimi jaj lub larw, co pozwoli uniknąć wyników fałszywie ujemnych w następnym kroku.

Po wyhodowaniu zwierząt w pokoleniu F2, przejrzyj płytki F2 w poszukiwaniu w 100% fluorescencyjnych transgenicznych nicieni w pokoleniu F3. Przegląd ten jest dość szybki, ponieważ obecność pojedynczego niefluorescencyjnego nicienia oznacza, że płytkę należy odrzucić. Wybierz osiem fluorescencyjnych zwierząt F3 z wybranych płytek, aby potwierdzić 100% dziedziczenia transgenu. Jeśli to możliwe, zachowaj kilka niezależnych zintegrowanych szczepów transgenicznych.

Wykonano integracje transgenów w dwóch różnych liniach, przenoszących pozachromosomalne macierze z podobną częstotliwością. Porównując standardowy i ulepszony protokół, zoptymalizowano w tym drugim czas oraz liczbę płytek niezbędnych dla każdej zintegrowanej linii. Następnie przetestowano hipotezę, według której wyższa częstotliwość przenoszenia transgenu w linii niezintegrowanej ułatwia jego integrację z genomem.

Jeden konkretny transgen został zintegrowany w liniach wykazujących różną wydajność transmisji, przy czym w przypadku linii o najwyższej wydajności zastosowano ulepszony protokół. Odzyskano trzy linie zintegrowane z zaledwie 90 wybranych osobników F1, natomiast w przypadku linii transgenicznej o transmisji na poziomie 50 do 60% odzyskano jedną linię zintegrowaną ze 110 wybranych osobników F1. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić różne metody w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak określenie ekspresji, wzorca i regulacji genu, lokalizacja białka i nadekspresja białka lub opracowanie markerów subkomórkowych.