Name: Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj szybką metodę integracji macierzy pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans przy użyciu promieniowania UV. Protokół ten umożliwia tworzenie stabilnych linii transgenicznych z wysoką szybkością transmisji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Claire Lecroisey i Laurentowi Ségalatowi za wygenerowanie niezintegrowanego Pdyc-1::d yc-1::gfp; Szczepy transgeniczne Pmyo-2::d sRed i Pmyo-3::gfp. Dziękujemy Andy'emu Fire'owi za dar plazmidu Pmyo-2::d sRed oraz Pameli Hoppe za dar plazmidu Pmyo-3::gfp. Praca ta została założona przez Francuskie Narodowe Centrum Badań Naukowych (CNRS) i Uniwersytet Claude'a Bernarda w Lyonie.

1. Hodowla transgenicznych nicieni przed integracją
Linie transgeniczne mogą być generowane zgodnie z opisem wpunkcie 1. Linie te zwykle zawierają plazmid markera koiniekcyjnego prowadzący albo do ekspresji białka fluorescencyjnego, albo do określonego fenotypu behawioralnego lub morfologicznego na danym etapie rozwoju1,3. Ten protokół integracji może być stosowany do szczepów wykazujących ekspresję fluorescencyjnych lub niefluorescencyjnych markerów koiniekcji. W poniższym przykładzie użyto szczepu z fluorescencyjnym markerem do współiniekcji.
<ol>
	<li>Przygotuj płytki hodowlane:
		<ol>
			<li>Przygotować około 500 szalek Petriego o średnicy 60 mm, zalanych w sposób aseptyczny po 10 ml pożywki dla nicieni (NGM)6,7.</li>
			<li>Wysiewać każdą płytkę 0,3 ml nasyconej kultury Escherichia coli OP50 zgodnie ze standardową procedurą6,7.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Oceń szybkość transmisji linii transgenicznej, która ma zostać zintegrowana:
		<ol>
			<li>Dla każdej linii transgenicznej wybierz dziesięć fluorescencyjnych dorosłych osobników na dziesięć oddzielnych płytek hodowlanych pod fluorescencyjnym stereoskopem za pomocą kilofa robakowego, jak opisano w7.</li>
			<li>Hodować zwierzęta w inkubatorze dla robaków w temperaturze 15–25 °C (w zależności od tła genetycznego), aby umożliwić robakom rozmnażanie się.</li>
			<li>Obserwuj potomstwo każdego dnia, aby ocenić, na jakim etapie rozwoju marker koiniekcji ulega ekspresji i można go najlepiej zaobserwować. Ekspresję większości obecnie stosowanych markerów koiniekcji obserwuje się w stadium larwalnym L4 lub w wieku dorosłym.</li>
			<li>Ocenić szybkość transmisji potomstwa, określając procent fluorescencyjnego potomstwa przez obserwację pod fluorescencyjnym stereoskopem.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Wybierz linię transgeniczną do integracji transgenowej:
		<ol>
			<li>Wybierz linię transgeniczną o jak najwyższym współczynniku transmisji (najlepiej ≥80%).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Uzyskanie populacji zwierząt transgenicznych zsynchronizowanych w stadium larwalnym L4 w celu integracji:
	<ol>
		<li>Wybierz 30 fluorescencyjnych dorosłych osobników na pięć płytek hodowlanych (sześć zwierząt na talerzu).</li>
		<li>Pozwól robakom złożyć jaja przez 3-4 godziny w temperaturze 15 °C.</li>
		<li>Wyeliminuj dorosłe osobniki z talerzy po sprawdzeniu, czy na talerzu znajduje się co najmniej 30 jaj.</li>
		<li>Hodować zwierzęta w inkubatorze z robakami w temperaturze 15–25 °C do momentu, gdy potomstwo osiągnie stadium larwalne L4 (96 godzin w temperaturze 15 °C lub 36 godzin w temperaturze 25 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Naświetlanie promieniowaniem UV i odzyskiwanie transgenicznych robaków
<ol>
	<li>Napromienianie robakami:
		<ol>
			<li>Wybierz 30-100 fluorescencyjnych transgenicznych zwierząt L4 na osobne płytki hodowlane (15-20 zwierząt na płytce).</li>
			<li>Umieść płytki ze zdjętymi pokrywkami w usieciowaniu UV. Napromieniować robaki w stężeniu 0,012 J/cm2. Należy pamiętać, że szczepy są mniej lub bardziej wrażliwe na promieniowanie UV, a wyniki mogą być różne w zależności od zastosowanego promiennika UV. Można badać zakres dawek w zakresie 0,010-0,015 J/cm2.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie robaków po napromieniowaniu:
	<ol>
		<li>Umieścić płytki z napromieniowanymi robakami na noc w temperaturze 15 °C w celu odzyskania.</li>
		<li>Sprawdź liczbę zwierząt, które żyją. W naszych rękach wskaźnik przeżycia wynoszący około 80-90% jest przystosowany do skutecznego napromieniania.</li>
		<li>Zwierzęta poddane napromienianiu należy hodować w temperaturze 15–25 °C do momentu, gdy potomstwo osiągnie stadium rozwojowe umożliwiające obserwację ekspresji markera jednoczesnego wstrzykiwania, jak ustalono w kroku 1.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja zintegrowanych linii transgenicznych
<ol>
	<li>Selekcja zwierząt F1:
		<ol>
			<li>Pojedyncze 150-200 fluorescencyjnych zwierząt F1 na oddzielnych płytkach hodowlanych. W przypadku linii o dużej przepuszczalności (≥80%) wystarczy 100 zwierząt F1.</li>
			<li>Utrzymywać płytki F1 w temperaturze 15-25 °C do czasu, gdy potomstwo osiągnie odpowiedni etap do obserwacji fluorescencyjnych zwierząt F2.</li>
			<li>Odrzucić wszystkie płytki F1 wykazujące albo i) brak potomstwa, co wskazuje, że zwierzę F1 było bezpłodne lub padło, albo ii) brak lub tylko kilka fluorescencyjnych zwierząt F2, co wskazuje, że zwierzę F1 nie przekazało transgenu w oczekiwanej szybkości. Ten krok jest szybki i stanowi prawdziwą zaletę w porównaniu ze standardowym protokołem, który wymaga oszacowania procentu fluorescencyjnych robaków F2 w celu wybrania płytek F1 wykazujących ≥75% fluorescencyjnego potomstwa (Tabela 1).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Selekcja zwierząt F2:
		<ol>
			<li>Pojedyncze cztery fluorescencyjne transgeniczne zwierzęta F2 z każdej wybranej płytki F1. W przypadku stosowania transgenów fluorescencyjnych (na przykład mCherry8, gfp9 lub dsRed10) należy wybrać robaki F2 o wysokim poziomie fluorescencji, ponieważ może to wskazywać, że zwierzęta te są homozygotyczne pod względem zintegrowanej macierzy. Należy pamiętać, że podczas wybierania zwierząt F2 bardzo ważne jest, aby nie nosić ze sobą jaj ani larw, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych w następnym kroku.</li>
			<li>Hoduj zwierzęta F2 w temperaturze 15-25 °C.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Izolacja i walidacja zintegrowanych szczepów transgenicznych:
		<ol>
			<li>Płytki przesiewowe F2 dla 100% fluorescencyjnych transgenicznych robaków F3. Ekran jest dość szybki, ponieważ obecność pojedynczego niefluorescencyjnego robaka wskazuje, że płytkę należy wyrzucić. Zwierzę F2 homozygotyczne pod względem zintegrowanego transgenu da 100% homozygotyczne fluorescencyjne potomstwo.</li>
			<li>Pobrano osiem fluorescencyjnych zwierząt F3 z wybranych płytek, aby potwierdzić 100% dziedziczenie transgenu. Teoretycznie na tym etapie wystarczy wybrać jedno zwierzę. Jednak wybranie ośmiu fluorescencyjnych zwierząt F3 może być konieczne, aby uniknąć wyboru zwierząt niepłodnych lub niezdrowych, ponieważ napromieniowanie może losowo wywołać mutacje, które wpływają na geny ważne dla fizjologii robaków.</li>
			<li>Jeśli to możliwe, należy zachować kilka niezależnych, zintegrowanych szczepów transgenicznych, tj. szczepów odzyskanych od różnych zwierząt F1.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WormBook%22">WormBook</a>. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+Fusion-Based+Approach+to+Create+Reporter+Gene+Constructs+for+Expression+Analysis+in+Transgenic+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans.</a> BioTechniques. 32, 728-730 (2002).</li>
<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+vector+kit+for+transgenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Worm+Meeting%22%5BJournal%5D)">A modular vector kit for transgenesis in C. elegans.</a> International Worm Meeting. , (2007).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Fleenor, J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discosoma+sp.+Red+Fluorescent+Protein+%28dsRED%29+as+a+reporter+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Worm+Breeder%27s+Gazette%22%5BJournal%5D)">Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans.</a> Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).</li>
<li>Lecroisey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZYX-1%2C+the+unique+zyxin+protein+of+Caenorhabditis+elegans%2C+is+involved+in+dystrophin-dependent+muscle+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration.</a> Mol. Biol. Cell. , (2013).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).</li>
<li>Frøkjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li>
<li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Opisany tutaj protokół zapewnia skuteczną metodę integracji pozachromosomalnych macierzy transgenicznych z genomem C. elegans. Korzystając z różnych linii niezintegrowanych, które przenosiły ten sam transgen Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) z różną szybkością (10-15%, 50-60% i >80%), wykazaliśmy, że liczba zintegrowanych szczepów odzyskanych po napromieniowaniu UV zależy od początkowego poziomu transmisji linii niezintegrowanej (Tabela 2). Dlatego transgeny są łatwiejsze do zintegrowania w l...

Transgeny są szeroko stosowane w C. elegans do szerokiego zakresu zastosowań. Szczepy transgeniczne są zwykle generowane przez wstrzyknięcie DNA do syncytialnej gonady hermafrodyty1,2. DNA przenoszące interesujący nas transgen jest koiniekowane wraz z plazmidami kodującymi markery koiniekcyjne1,3,4. Markery koiniekcyjne to ustalone transgeny prowadzące albo do ekspresji białka fluorescencyjnego, albo do określonego fenotypu behawioralnego lub morfologicznego. Wstrzyknięte DNA przegrupowują się, tworząc wielokopijne macierze pozachromosomowe; W ten sposób interesujący nas transgen i marker koiniekcji są przekazywane razem5,4. Linie transgeniczne są wybierane w pokoleniu F2 zwierząt, którym wstrzyknięto zastrzyki, kierując się fenotypem wywołanym ekspresją markera koiniekcyjnego (fluorescencja lub fenotyp specyficzny)1. Linie transgeniczne wykazują częściowe i zmienne szybkości transmisji macierzy pozachromosomalnych do następnego pokolenia. W zależności od szczepu, 10-100% (100% jest rzadkim zdarzeniem) zwierząt dziedziczy układy pozachromosomalne. Ponadto zwierzęta transgeniczne są mozaikowe i wyrażają transgen w zmiennej liczbie komórek. Ten mozaicyzm jest prawdopodobnie skorelowany z szybkością transmisji do następnego pokolenia. Rzeczywiście, zarówno w linii rozrodczej, jak i komórkach somatycznych szybkość transmisji zależy od segregacji macierzy pozachromosomalnych podczas podziałów komórkowych. Jednym ze sposobów uniknięcia tego problemu jest zintegrowanie transgenu z genomem. Klasycznie rzecz biorąc, integracja transgenu z chromosomem opiera się na napromieniowaniu (ultrafioletowym lub gamma) transgenicznych robaków przenoszących macierze pozachromosomowe3. Krótko mówiąc, 50-100 zwierząt hermafrodytycznych jest napromienianych w stadium larwalnym L4. W pokoleniu F1 wybiera się od 200 do 800 zwierząt transgenicznych, które są indywidualnie hodowane na płytkach. Zgodnie z segregacją mendlowską, transgeniczne zwierzęta F1 posiadające heterozygotyczną integrację transgenu z genomem wyprodukowałyby 1/2 transgenicznych potomków, którzy są heterozygotyczni pod względem zintegrowanej macierzy, 1/4 transgenicznych potomków będących homozygotycznymi pod względem zintegrowanej macierzy i 1/4 potomków, którzy nie zintegrowali macierzy (Figura 1). W ten sposób płytki zawierające pokolenie F2 są poddawane wizualnym badaniom przesiewowym pod kątem ≥75% zwierząt transgenicznych, co obserwuje się na podstawie ekspresji markera do iniekcji. Zakłada się, że około 1/3 zwierząt F2 wybranych jako kandydaci integrujący jest homozygotycznych pod względem zintegrowanej macierzy i produkuje 100% homozygotycznych zwierząt F3. W związku z tym z każdej wybranej płytki hoduje się indywidualnie od trzech do ośmiu transgenicznych zwierząt F2 i wybiera się płytki ze 100% transgenicznymi potomkami. Następnie osiem zwierząt F3 jest indywidualnie hodowanych, aby potwierdzić 100% dziedziczenie transgenu.
Główne wady tej metody to:
<ol type="ja">
	<li>wymaga wizualnego badania przesiewowego kilkuset płytek F1 dla ≥75% transgenicznego potomstwa F2, co jest czasochłonne ze względu na zmienny i nieprzewidywalny procent transmisji niezintegrowanych macierzy pozachromosomowych. Alternatywnie, aby uniknąć przesiewania płytek F1, po napromieniowaniu zwierząt P0 można przeprowadzić kilka kolejnych etapów głodzenia; Następnie wybrano 100 transgenicznych zwierząt i przeprowadzono badania przesiewowe pod kątem 100% transgenicznego potomstwa3.</li>
	<li>Nie jest przystosowany do szczepów wykazujących odsetek transmisji w macierzy pozachromosomalnej wyższy niż 60%, ponieważ odsetek ten jest trudny do odróżnienia od 75%.</li>
	<li>ponieważ można stosować tylko szczepy o stosunkowo niskim współczynniku transmisji, konieczna jest duża liczba napromieniowanych transgenicznych zwierząt P0, a także obserwacja wielu zwierząt F1 i F2, co jest bardzo czasochłonne i wymaga znacznej liczby płytek.</li>
</ol>
Napromienianie robaków przypuszczalnie powoduje pęknięcia dwuniciowych w DNA i integracja pozachromosomalnych układów w chromosomy następuje podczas naprawy DNA. W związku z tym prawdopodobne jest, że szanse na pomyślną integrację za pośrednictwem napromieniania są wprost proporcjonalne do liczby komórek linii rozrodczej noszących układ pozachromosomalny. Szczepy o wysokiej szybkości transmisji mogą zawierać więcej transgenicznych macierzy DNA niż szczepy o niskiej szybkości transmisji, jak sugerowano w2, i wykazywać większą liczbę komórek linii rozrodczej zawierających macierze pozachromosomowe. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że w liniach o wysokiej transmisji, transgeny mogą być łatwiejsze do zintegrowania niż w liniach o niskiej szybkości transmisji. Jednak standardowy protokół wyklucza możliwość integracji transgenów o wysokiej częstotliwości transmisji, ponieważ odsetek zwierząt transgenicznych z niezintegrowaną matrycą pozachromosomalną jest trudny do odróżnienia od odsetka potomstwa zwierzęcia F1 niosącego heterozygotyczną integrację transgenu z genomem (ryc. 1).
Tutaj pokazujemy, że dla konkretnego transgenu, liczba zintegrowanych linii odzyskanych po naświetleniu światłem ultrafioletowym (UV) zależy od początkowego procentu transmisji niezintegrowanej matrycy. Przedstawiamy ulepszony protokół integracji transgenu za pośrednictwem promieniowania UV, który jest szczególnie istotny dla linii wykazujących wysoką szybkość transmisji w macierzy transgenowej.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Prolabo</td><td>20768.292</td><td>do przygotowania NGM (pożywki dla nicieni) (6,7)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chimie-Plus</td><td>40045</td><td>do przygotowania NGM</td></tr><tr><td>Bacto-pepton</td><td>BD</td><td>211820</td><td>do przygotowania NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904-1</td><td>do przygotowania NGM</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Prolabo</td><td>26930.293</td><td>do przygotowania NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Roth</td><td>P027.2</td><td>do przygotowania NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Prolabo</td><td>22317.297</td><td>do przygotowania NGM</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Rectapur</td><td></td><td>do przygotowania</td></tr><tr><td>NGM LB-bulion</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>do hodowli OP50 bakterie</td></tr><tr><td>SPRZĘT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Usieciowanie UV</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td>Długość fali 254 nm</td></tr><tr><td>Mikroskop SteREO Discovery V8</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego, 60 mm</td><td>CML</td><td>BPS55E6</td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowy 0,25 mm</td><td>Alfa Aesar</td><td>7440-06-4</td><td>Do zrobienia kilofa do robaków (7)</td></tr></tbody></table>

szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem c. elegans

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Mikroiniekcja DNA do cytoplazmy syncytialnej gonady Caenorhabditis elegans jest główną techniką używaną do ustanowienia linii transgenicznych, które wykazują częściowe i zmienne tempo transmisji układów pozachromosomowych do następnego pokolenia. Ponadto zwierzęta transgeniczne są mozaikowe i wyrażają transgen w zmiennej liczbie komórek. Macierze pozachromosomalne można zintegrować z genomem C. elegans za pomocą promieniowania UV w celu stworzenia niemozaikowych szczepów transgenicznych ze 100% szybkością transmisji transgenu. W tym zakresie potomstwo F1 zwierząt transgenicznych napromieniowanych promieniowaniem UV jest badane pod kątem zwierząt z heterozygotyczną integracją transgenu, co prowadzi do 75% szybkości transmisji mendlowskiej do potomstwa F2. Jednym z wyzwań tej metody jest rozróżnienie procentu transmisji transgenicznej w populacji przed (X% zwierząt transgenicznych) i po integracji (≥75% transgenicznych zwierząt F2). W związku z tym metoda ta wymaga wyboru niezintegrowanej linii transgenicznej z odsetkiem zwierząt transgenicznych, który jest znacznie niższy niż segregacja mendlowska wynosząca 75%. W związku z tym niezintegrowane linie transgeniczne z szybkością transmisji w układzie pozachromosomalnym do następnego pokolenia ≤60% są zwykle preferowane do integracji, a integracja transgenowa w szczepach wysoce transmisyjnych jest trudna. Tutaj pokazujemy, że efektywność integracji macierzy pozachromosomalnych z genomem wzrasta przy użyciu wysoce transgenicznych linii transgenicznych (≥80%). Opisany protokół pozwala na łatwą selekcję kilku niezależnych linii z homozygotyczną integracją transgenową do genomu po naświetlaniu promieniowaniem UV transgenicznych robaków wykazujących wysoki wskaźnik transmisji w macierzy pozachromosomalnej. Co więcej, ta metoda jest dość szybka i mało materiałochłonna. Możliwość szybkiego generowania różnych linii, które wyrażają określony zintegrowany transgen, jest bardzo interesująca dla badań koncentrujących się na wzorcu i regulacji ekspresji genów, lokalizacji białek i nadekspresji, a także dla rozwoju markerów subkomórkowych.

Integracje transgenów w dwóch różnych liniach przekazujących macierze pozachromosomalne z niemal taką samą częstotliwością (50-60%) przeprowadzono przy użyciu protokołu standardowego i ulepszonego (Tabela 1). Protokół standardowy pozwolił na uzyskanie trzech niezależnych linii zintegrowanych po naświetlaniu UV 91 transgenicznych zwierząt w stadium L4, natomiast protokół ulepszony pozwolił na uzyskanie jednej linii zintegrowanej po naświetlaniu UV 30 transgenicznych zwierząt w stadium L4. Sugeruje to, że ...

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest integracja transgenicznych macierzy pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans przy użyciu naświetlania promieniami ultrafioletowymi. Najpierw należy wybrać linię transgeniczną o jak najwyższym współczynniku transmisji, idealnie powyżej 80%. Następnie wyselekcjonowane larwy L4 linii transgenicznej należy naświetlić promieniami UV, a z każdej wybranej płytki F1 wyizolować po cztery fluorescencyjne zwierzęta transgeniczne F2. W kolejnym kroku należy przebadać płytki F2 w celu wyłonienia osobników transgenicznych wykazujących 100% fluorescencji.Krzyżowano pokolenie F3 robaków. Ostateczny wybór zwierząt fluorescencyjnych z pokolenia F3 może wykazać 100% dziedziczenia transgenu. To podejście eksperymentalne jest odpowiednie dla linii transgenicznych, które przekazują dodatkowe macierze chromosomowe z wysoką częstotliwością.Procedurę zaprezentuje Stephanie Belman, technik z naszego laboratorium. Należy rozpocząć od przygotowania 500 dużych szalek Petri zawierających podłoże do wzrostu nicieni. Na każdą płytkę należy zasiać 0,3 ml nasyconej zawiesiny Escherichia coli.Kultura OP 50. Ocenić stopień transmisji linii transgenicznej przeznaczonej do integracji dla każdej z linii. Za pomocą fluorescencyjnego stereomikroskopu przenieść 10 fluorescencyjnych dorosłych osobników na 10 osobnych płytek z pożywką.Zwierzęta umieścić w inkubatorze do nicieni ustawionym w temperaturze umożliwiającej reprodukcję tła genetycznego. Monitorować potomstwo każdego dnia, aby ocenić, na którym etapie rozwoju marker z ko-iniekcji ulega ekspresji i może być najlepiej zaobserwowany przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Ocenić stopień transmisji u potomstwa poprzez wyznaczenie procentowej liczby potomstwa fluorescencyjnego.W celu integracji transgenu należy wybrać linię transgeniczną o najwyższym współczynniku transmisji. Należy uzyskać populację zwierząt transgenicznych zsynchronizowanych w czwartym stadium larwalnym (L4). Do integracji należy przenieść 30 fluorescencyjnych osobników dorosłych GRA na pięć płytek hodowlanych.Po tym, jak nicienie znosiły jaja przez trzy do czterech godzin w temperaturze 15 °C, sprawdź obecność co najmniej 30 jaj na płytce, a następnie usuń osobniki dorosłe z płytek i hoduj zwierzęta w inkubatorze dla nicieni, aż potomstwo osiągnie stadium larwalne L4. Umieść każdą płytkę zawierającą od 15 do 20 fluorescencyjnych transgenicznych osobników w stadium L4 w urządzeniu do sieciowania UV (UV crosslinker) po zdjęciu pokrywek, a następnie naświetl nicienie w celu regeneracji. Inkubuj naświetlone nicienie przez noc w temperaturze 15 °C.Sprawdź liczbę zwierząt, które przeżyły. Wskaźnik przeżywalności na poziomie około 80 do 90% jest odpowiedni dla efektywnego napromieniowania. Hoduj napromieniowane zwierzęta w temperaturze od 15 do 25 °C, aż potomstwo osiągnie stadium rozwojowe umożliwiające obserwację ekspresji markera współwstrzykniętego.Przenieś pojedyncze fluorescencyjne osobniki F1 na oddzielne płytki hodowlane. Przechowuj te płytki F1 w temperaturze od 15 do 25 °C, aż potomstwo osiągnie odpowiedni etap rozwoju umożliwiający obserwację fluorescencyjnych osobników F2, w zależności od zastosowanego markera współobecnego. W tym konkretnym przypadku obserwowaliśmy nicienie w stadium dorosłym i odrzuciliśmy wszystkie płytki F1 wykazujące albo jeden: brak potomstwa, co wskazywało na to, że osobnik F1 był sterylny lub padł, albo dwa: brak lub tylko niewielką liczbę fluorescencyjnych osobników F2, co wskazywało, że osobnik F1 nie przekazał transgenu z oczekiwaną częstotliwością.Wybierz cztery fluorescencyjne zwierzęta transgeniczne F two z każdej wybranej płytki F1. W przypadku stosowania transgenów fluorescencyjnych należy wybierać nicienie F two o wysokim poziomie fluorescencji, ponieważ może to wskazywać, że zwierzęta te są homozygotami pod kątem zintegrowanego zestawu (array). Należy pamiętać, że podczas wybierania zwierząt F two kluczowe jest, aby nie przenieść wraz z nimi jaj lub larw, co pozwoli uniknąć wyników fałszywie ujemnych w następnym kroku.Po wyhodowaniu zwierząt w pokoleniu F2, przejrzyj płytki F2 w poszukiwaniu w 100% fluorescencyjnych transgenicznych nicieni w pokoleniu F3. Przegląd ten jest dość szybki, ponieważ obecność pojedynczego niefluorescencyjnego nicienia oznacza, że płytkę należy odrzucić. Wybierz osiem fluorescencyjnych zwierząt F3 z wybranych płytek, aby potwierdzić 100% dziedziczenia transgenu. Jeśli to możliwe, zachowaj kilka niezależnych zintegrowanych szczepów transgenicznych.Wykonano integracje transgenów w dwóch różnych liniach, przenoszących pozachromosomalne macierze z podobną częstotliwością. Porównując standardowy i ulepszony protokół, zoptymalizowano w tym drugim czas oraz liczbę płytek niezbędnych dla każdej zintegrowanej linii. Następnie przetestowano hipotezę, według której wyższa częstotliwość przenoszenia transgenu w linii niezintegrowanej ułatwia jego integrację z genomem.Jeden konkretny transgen został zintegrowany w liniach wykazujących różną wydajność transmisji, przy czym w przypadku linii o najwyższej wydajności zastosowano ulepszony protokół. Odzyskano trzy linie zintegrowane z zaledwie 90 wybranych osobników F1, natomiast w przypadku linii transgenicznej o transmisji na poziomie 50 do 60% odzyskano jedną linię zintegrowaną ze 110 wybranych osobników F1. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić różne metody w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak określenie ekspresji, wzorca i regulacji genu, lokalizacja białka i nadekspresja białka lub opracowanie markerów subkomórkowych.

a-rapid-protocol-for-integrating-extrachromosomal-arrays-with-high

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybki protokół integracji pozachromosomowych tablic o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

W niniejszym materiale opisujemy molekularny odczyt długotrwałej adaptacji węchowej u Caenorhabditis elegans. Kinaza białkowa G, EGL-4, jest niezbędna do stabilnych odpowiedzi adaptacyjnych w parze pierwotnych neuronów sensorycznych zwanych AWC. Podczas długotrwałej ekspozycji na zapach EGL-4 przemieszcza się z cytozolu do jądra komórkowego neuronu AWC.

Molekularny odczyt długoterminowej adaptacji węchowej u C. elegans

Ten film opisuje technikę szybkiego badania pojedynczego nicienia pod kątem markera genetycznego za pomocą badania przesiewowego PCR. W przykładowym protokole przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem edycji genomu opartej na CRISPR.

PCR z pojedynczym robakiem: metoda ekstrakcji i amplifikacji genomowego DNA

Mikroiniekcja transgenów zwykle skutkuje powstawaniem szczepów C. elegans z dużymi matrycami pozachromosomalnymi, co skutkuje zmienną ekspresją i transgenem. Promieniowanie UV może wywołać integrację chromosomalną macierzy i bardziej stabilną transgenową transmisję.

Naświetlanie promieniami UV: metoda integracji macierzy pozachromosomowych

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Prezentowany tutaj jest opis prostej i stosunkowo szybkiej izolacji genomowego DNA Caenorhabditis elegans od jednego lub kilku zwierząt przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu tkanek. Otrzymany preparat gDNA jest odpowiednią matrycą do PCR.

Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę

Protokół ten zapewnia metodę pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania podczas mejozy u Caenorhabditis elegans. Do określenia pochodzenia chromosomów wykorzystano genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Mapowanie 4-punktowe pozwoliło określić rozkłady krzyżowe regionów lewego, środkowego i prawego ramienia każdego chromosomu. ...

Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Poznaj szybką metodę integracji macierzy pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans przy użyciu promieniowania UV. Protokół ten umożliwia tworzenie stabilnych linii transgenicznych z wysoką szybkością transmisji.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Przeglądaj więcej filmów