Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Ogólnym celem tej procedury jest zintegrowanie transgenicznych dodatkowych matryc chromosomowych z genomem elegancji serratus za pomocą promieniowania ultrafioletowego. Najpierw wybierz linię transgeniczną o najwyższym możliwym współczynniku transmisji, najlepiej większym niż 80%, a następnie naświetl UV wybrane transgeniczne larwy L four, wyodrębniając cztery fluorescencyjne transgeniczne zwierzęta F dwa z każdej wybranej płytki F1. Następny ekran, dwie płytki F dla 100% fluorescencyjnego transgenicznego.

F trzy robaki. Ostatecznie, wybór fluorescencyjnych zwierząt z pokolenia F może wykazać 100% dziedziczenie transgenu. To eksperymentalne podejście dobrze nadaje się do linii transgenicznych, które przesyłają dodatkowe macierze chromosomów z dużą szybkością.

Procedurę zademonstruje Stephanie Belman, technik z naszego laboratorium. Zacznij od 500 dużych szalek Petriego zawierających nicienie. Średnie: Zasiej każdą płytkę 0,3 mililitra nasyconej isia coli.

OP 50 kultura. Oceń szybkość transmisji linii transgenicznej, która ma być zintegrowana dla każdej linii transgenicznej. Wybierz 10 dorosłych fluorescencyjnych osobników grawitacyjnych na 10 oddzielnych płytek hodowlanych pod fluorescencyjną kulturą stereoskopową.

Zwierzęta w inkubatorze robaków ustawiono w temperaturze pozwalającej na rozmnażanie tła genetycznego. Monitoruj potomstwo każdego dnia, aby ocenić, na jakim etapie rozwoju wyrażony jest marker wstrzyknięcia co i który najlepiej można zaobserwować za pomocą oskopii fluorescencyjnej. Oceń szybkość transmisji potomstwa, określając procent potomstwa fluorescencyjnego.

Do integracji transgenu wybierz linię transgeniczną o najwyższym współczynniku transmisji. Uzyskać populację zwierząt transgenicznych zsynchronizowanych w stadium larwalnym L cztery. W celu integracji wybierz 30 fluorescencyjnych dorosłych GRA na pięć płytek hodowlanych.

Po tym, jak robaki złożą jaja przez trzy do czterech godzin w temperaturze 15 stopni Celsjusza, sprawdź, czy na płytce znajduje się co najmniej 30 jaj, a następnie wyeliminuj dorosłe osobniki z hodowli zwierząt na płytkach w inkubatorze robaków, aż potomstwo osiągnie stadium larwalne L cztery. Umieść każdą płytkę zawierającą od 15 do 20 fluorescencyjnych transgenicznych L czterech zwierząt w sieciowniku UV ze zdjętymi pokrywkami, naświetlić robaki w celu odzyskania. Napromieniowane robaki należy inkubować przez noc w temperaturze 15 stopni Celsjusza.

Sprawdź, ile zwierząt żyje w naszych rękach. Wskaźnik przeżycia wynoszący około 80 do 90% jest przystosowany do skutecznego napromieniania. Hodować napromieniowane zwierzęta w temperaturze od 15 do 25 stopni Celsjusza, aż potomstwo osiągnie stadium rozwojowe, co pozwoli na obserwację ekspresji markera wstrzyknięcia ko.

Przenieść pojedyncze fluorescencyjne zwierzęta F1 na oddzielne płytki hodowlane. Przechowywać te płytki F1 w temperaturze od 15 do 25 stopni Celsjusza, aż potomstwo osiągnie odpowiedni etap do obserwacji fluorescencyjnych zwierząt F, w zależności od użytego markera CO. W tym konkretnym przypadku zaobserwowaliśmy, że robaki jako dorosłe osobniki odrzucają wszystkie płytki F1 wykazujące albo jedną, bez potomstwa, co wskazuje, że zwierzę F1 było bezpłodne lub zdechło, albo dwie nie, lub tylko kilka fluorescencyjnych zwierząt F dwóch, co wskazuje, że zwierzę F1 nie przekazało transgenu w oczekiwanej szybkości.

Wyróżnij cztery fluorescencyjne transgeniczne F, dwa zwierzęta z każdej wybranej płytki F1. Używając transgenów fluorescencyjnych, wybierz F dwa robaki o wysokim poziomie fluorescencji, ponieważ może to wskazywać, że zwierzęta te są homozygotyczne pod względem zintegrowanej macierzy. Należy pamiętać, że podczas wybierania zwierząt F dwa bardzo ważne jest, aby nie zabierać ze sobą jaj ani larw, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych W następnym kroku.

Po wyhodowaniu F dwa zwierzęta przesiewają dwie płytki F pod kątem 100% fluorescencyjnych transgenicznych F trzech robaków. Badanie przesiewowe jest dość szybkie, ponieważ obecność pojedynczego niefluorescencyjnego robaka wskazuje, że płytkę należy wyrzucić, wyodrębnić osiem fluorescencyjnych F trzy zwierzęta z wybranych płytek, aby potwierdzić 100% dziedziczenie transgenu. Jeśli to możliwe, zachowaj kilka niezależnych, zintegrowanych szczepów transgenicznych.

Przeprowadzono integracje transgenów w dwóch różnych liniach, przekazujących dodatkowe macierze chromosomowe z mniej więcej tą samą częstotliwością. Korzystając ze standardowych i ulepszonych protokołów, czas i liczba płyt niezbędnych na zintegrowaną linię są optymalizowane w ulepszonym protokole. Następnie przetestowaliśmy hipotezę, że wyższa szybkość transmisji transgenu w linii niezintegrowanej ułatwia integrację transgenu z genomem.

Jeden konkretny transgen został zintegrowany z liniami transmitującymi z różną szybkością przy użyciu ulepszonego protokołu dla najwyższej linii transmisyjnej. Trzy zintegrowane linie zostały odzyskane od zaledwie 90 wybranych zwierząt F1, podczas gdy w przypadku linii transgenicznej nadającej z prędkością od 50 do 60%Jedna zintegrowana linia została odzyskana od 110 wybranych zwierząt F1. Po tej procedurze można zastosować różne metody, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak określenie ekspresji genów, wzorca i regulacji, lokalizacja białka i nadekspresja białka lub rozwój markerów subkomórkowych.