Name: Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj metodę przygotowania pierwotnych neuronów szczura do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej. Technika ta umożliwia uzyskanie obrazów ultrastruktury neuronalnej w rozdzielczości nanometrycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez granty NIH (PN2EY016525 i P41GM103832). S.H.S. było wspierane przez stypendium z Nanobiology Interdisciplinary Graduate Training of the W. M. Keck Center for Interdisciplinary Bioscience Training of the Gulf Coast Consortia (NIH Grant No. T32EB009379).
S.H.S. przeprowadził, wyhodował i zeszklono DRG i komórki hipokampa; zebrał dane cryo-EM i cryo-ET DRG i aksonów hipokampa; zrekonstruował i opatrzył kolorami serię pochyleń. M.R.G. przeprowadził sekcję i dostarczył komórki hipokampa w laboratorium M.N.R. S.C. asystował w adnotacji serii pochyleń. S.H.S. został przeszkolony przez C.W. w zakresie preparowania i hodowli neuronów. S.H.S., W.C.M. i W.C. byli pomysłodawcami eksperymentów. S.H.S. przygotował manuskrypt przy udziale innych autorów.
Ten film został nakręcony w Centrum Obrazowania Komórkowego i Nanoanalizy (C-CINA) Biozentrum Uniwersytetu w Bazylei. C-CINA jest zintegrowana z Wydziałem Nauk i Inżynierii Biosystemów (D-BSSE) ETH Zürich, z siedzibą w Bazylei w Szwajcarii.

1. Przygotowanie potraw z siatkami EM do posiewu pierwotnych neuronów
<ol>
	<li>Zbadaj integralność dziurawego węgla na złotych siatkach EM za pomocą mikroskopu świetlnego przy powiększeniu co najmniej 25X. Upewnij się, że otwory węglowe są w >98% nienaruszone.</li>
	<li>Do powlekania neuronów pierwotnych użyj palnika Bunsena, aby wysterylizować płomieniowo siatki EM i jednocześnie nadać im hydrofilowość. Użyj pęsety, aby podnieść siatkę EM za jej krawędź, a nie za centralny obszar siatki. UWAGA: Nigdy nie pozostawiaj zapalonego palnika Bunsena bez nadzoru i nie używaj rękawiczek ani pęsety z plastikowymi elementami podczas wykonywania następujących czynności:
	<ol>
		<li>Przed zapaleniem palnika Bunsena należy ustawić regulacje powietrza i gazu w pozycji minimalnie otwartej.</li>
		<li>Zapal palnik Bunsena za pomocą zapalniczki krzesiwowej lub butanowej.</li>
		<li>Zmodyfikuj regulacje powietrza i gazu, aby uzyskać mały, niebieski płomień wewnętrzny w wyższym, jaśniejszym niebiesko-fioletowym płomieniu. Końcówka wewnętrznego płomienia jest najgorętszą częścią płomienia. Pokrętło pod palnikiem reguluje ilość gazu wpływającego do rurki palnika, natomiast bęben palnika można obracać, aby regulować ilość powietrza wchodzącego do palnika. Przekręcenie regulacji powietrza zgodnie z ruchem wskazówek zegara zmniejsza powietrze (powodując fioletowy płomień) i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara zwiększa powietrze (powodując żółty płomień).</li>
		<li>Używając metalowej pęsety (bez plastikowych części) do przytrzymania siatki EM, dwukrotnie szybko przepuść ją przez płomień, stroną węglową do góry. Strona węglowa będzie wydawała się bardziej matowa (mniej błyszcząca) i z bardziej szarawym odcieniem niż druga strona.</li>
		<li>Natychmiast przenieś ruszt (stroną węglową do góry) na środek naczynia ze szklanym dnem umieszczonego w odległości nie większej niż 10 cm od palnika Bunsena. Użyj jednej siatki EM na naczynie (Rysunek 1). Używaj wyłącznie naczyń ze szklanym dnem, które są wstępnie wysterylizowane, tj. poprzez promieniowanie gamma.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić integralność siatki (nienaruszone otwory węglowe), jednocześnie utrzymując siatkę EM wewnątrz naczynia ze szklanym dnem (aby uniknąć zanieczyszczenia). Podczas nakładania jakiejkolwiek substancji na siatkę lub czegokolwiek, co będzie miało kontakt z neuronami, należy stosować sterylną procedurę i sterylne końcówki pipet.</li>
	<li>W kapturze do hodowli tkankowej, stosując sterylną procedurę, powoli i ostrożnie nanieść 250 μl odpowiedniej substancji powlekającej na centralną szklaną powierzchnię szalki Petriego. Upewnij się, że odpowiednia substancja powłokowa pokrywa całą siatkę EM.
	<ol>
		<li>W przypadku neuronów hipokampa należy użyć poli-L-lizyny (PLL, 1 mg/ml) jako substancji powlekającej, przygotowanej zgodnie z wcześniejszym opisem19. Należy pamiętać, że potrzeba 250 μl na siatkę EM, na naczynie, więc odpowiednio skaluj partię. W przypadku neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) należy użyć galaretowatej mieszaniny białek wydzielanych przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) (patrz Tabela materiałów i odczynników) jako substancji powlekającej, przygotować w następujący sposób. Należy pamiętać, że potrzeba 250 μl na siatkę EM, na naczynie, więc odpowiednio skaluj partię.
		<ol>
			<li>Rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C butelkę podstawową galaretowatej mieszaniny białek wydzielanych przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).</li>
			<li>Przechowywać w chłodzie galaretowatą mieszaninę białek wydzielaną przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) oraz wszystkie składniki użyte do przygotowania roztworu, tj. utrzymując je na lodzie.</li>
			<li>Będąc na lodzie, rozcieńczyć tę galaretowatą mieszaninę białek w podłożu Neurobasel, aby uzyskać rozcieńczenie 1:20 (tj. rozcieńczyć 500 μl galaretowatej mieszaniny białek w 10 ml Neurobasal).</li>
			<li>Rozcieńczoną galaretowatą mieszaninę białek podzielić na 1 ml porcji i natychmiast przechowywać wszelkie dodatkowe porcje w temperaturze -20 °C.</li>
			<li>Zastosować 250 μl na siatkę EM na naczynie, jak opisano w sekcji 1.4.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryć szalkę Petriego wierzchem i inkubować (albo z PLL dla próbek hipokampa, ALBO z galaretowatą mieszaniną białek dla próbek DRG) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Odessać wszystkie PLL (dla próbek hipokampa) lub galaretowatą mieszaninę białek (dla próbek DRG) z szalek. Aby to zrobić, użyj systemu próżniowego w kapturze do hodowli tkankowych. Użyj sterylnej końcówki pipety dołączonej do rurki próżniowej. Unikaj bezpośredniego kontaktu z siatką EM.</li>
	<li>Za pomocą pipety o regulowanym wydatku powietrza ostrożnie nanieść 250 μl sterylnego PBS (soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) na siatkę EM w centralnej szklanej powierzchni każdej płytki Petriego, tak aby siatka EM była całkowicie pokryta PBS. Następnie odessaj PBS z każdej płytki. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Pozostaw naczynia z kratkami EM do wyschnięcia pod kapturem do hodowli tkankowej przez 15 minut. Upewnij się, że są całkowicie suche, sprawdzając pod mikroskopem świetlnym w pomieszczeniu do hodowli tkankowych. Upewnij się, że w siatce nie ma pęcherzyków wilgoci. Jeśli tak, ostrożnie zasysaj obok siatki EM, aby wyeliminować tę dodatkową wilgoć. Powlekana siatka powinna być natychmiast użyta do posiewu neuronów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i posiewanie pierwotnych neuronów na siatkach EM
<ol>
	<li>Aby pokryć neurony pierwotne, najpierw rozbior, trypsynizuj (używając 2,5% trypsyny) i dziel w celu dysocjacji hipokampa (lub zwoju korzenia grzbietowego 18-dniowych zarodków szczurów) na pojedyncze komórki, jak opisano wcześniej19.
	<ol>
		<li>Triturate to powszechny termin używany przez neurobiologów do opisania dysocjacji skupisk komórek na pojedyncze komórki, szczególnie przy użyciu szklanej pipety z polerowaną ogniowo końcówką. Rezultat uzyskuje się poprzez ostrożne i powolne przeciąganie i uwalnianie komórek, w górę i w dół, wiele razy (~30) przez pipetę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi wcześniej dla rozwarstwienia DRG i izolacji komórek24, zwracając uwagę, aby użyć 0,25% trypsyny (w HBSS) do wyizolowania neuronów DRG szczura, zamiast używać sugerowanych enzymów (papaina, kolagenaza / dyspaza), które są bardziej odpowiednie dla mysich neuronów DRG.</li>
	<li>Oblicz liczbę izolowanych neuronów (tj. za pomocą hemocytometru) i użyj tej wartości do obliczenia odpowiedniej objętości komórek, którą należy zastosować do każdej płytki, aby osiągnąć stężenie 50 000 komórek/ml na naczynie. Maksymalna objętość do zastosowania to 250 μl. Należy pamiętać, że wypełnia to tylko środkową powierzchnię szkła, a nie całe naczynie.</li>
	<li>Inkubować szalki przez 30 minut w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Pozwolić komórkom zregenerować się i przylgnąć.</li>
	<li>Powoli dodawaj 1,5 ml podgrzanego podłoża do każdego naczynia, uważając, aby nie naruszyć siatki EM. Rodzaj pożywki zależy od typu komórki (hipokamp lub DRG).
	<ol>
		<li>Przygotować odpowiednie podłoże dla neuronów hipokampa19 lub neuronów zwojowych korzenia grzbietowego24, które przed użyciem należy ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Inkubować szalki przez noc w inkubatorze CO2 .</li>
		<li>W przypadku neuronów hipokampa zmień pożywkę następnego dnia. Wymieniaj połowę nośnika co dwa dni przez 14 dni. Przed użyciem podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W przypadku neuronów DRG, następnego dnia po rozebraniu/posiale, należy przygotować świeży materiał z pożywką ze środkiem antymitotycznym (urydyna i 5'-fluoro-2'-deoksyurydyna), oddzielnie przygotować 10 mM roztwór podstawowy każdego z nich; dla każdego z nich należy użyć końcowego stężenia 10 μM. Usunąć połowę pożywki DRG (875 μl) i dodać 875 μl świeżej pożywki ze środkiem antymitotycznym.
		<ol>
			<li>W przypadku neuronów DRG, co dwa dni przez pierwszy tydzień, zmieniaj pożywkę na przemian z pożywki antymitotycznej na standardową pożywkę DRG. Przez drugi tydzień zmieniaj standardowe nośniki DRG co dwa dni.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zeszklenie neuronów na siatkach EM
<ol>
	<li>Przygotuj sprzęt i wszystkie materiały do zamrażania i przechowywania złotych siatek EM w temperaturze kriogenicznej: urządzenie do witryfikacji z komorą wilgotnościową17, specjalistyczna pęseta drobnopunktowa do maszyny do witryfikacji, długa pęseta z płaskim punktem, dewar(y) ciekłego azotu (LN2), pojemnik na płyn chłodzący, skrzynka do przechowywania siatki EM, bibuła filtracyjna bez wapnia.</li>
	<li>Uruchom urządzenie do witryfikacji. Ustaw wilgotność na 100%, a temperaturę na 32 °C. W sekcji "Konsola" ustaw czas blot na zero sekund. Pozwala to na ręczne osuszanie przez boczne okienko komory wilgotnościowej maszyny do witryfikacji.</li>
	<li>Z bibułą filtracyjną bez wapnia należy obchodzić się w rękawiczkach, układając je warstwami tak, aby trzy bibuły były ułożone w stos. Pokrój stos na paski o szerokości 0,5 cm i długości ~2 cm. Zegnij je pod kątem 90° tak, aby jedna strona papieru miała powierzchnię 0,5 cm x 0,5 cm (Rysunek 2). Za pomocą pęsety usuń środkowy papier i umieść go na innej bibule filtracyjnej bez wapnia do czasu użycia.</li>
	<li>Umieść przycisk przechowywania siatki w uchwycie przycisku w komorze witryfikacyjnej. Napełnij wewnętrzną komorę pojemnika płynu chłodzącego ciekłym azotem i poczekaj na całkowite odparowanie. Napełnij zewnętrzną komorę pojemnika płynu chłodzącego ciekłym azotem, aż osiągnie stabilną temperaturę, aby przejść do następnego kroku. Napełnij komorę wewnętrzną gazowym etanem o wysokiej czystości, który skondensuje się do stanu ciekłego w chłodzonej komorze.</li>
	<li>Przenieść szalkę (naczynia) z inkubatora do dużego naczynia z polistyrenu o średnicy 100 mm w celu transportu do pomieszczenia do witryfikacji, jeśli nie znajduje się w bezpośrednim sąsiedztwie. Użyj specjalistycznej pęsety do witryfikacji, aby ostrożnie wybrać siatkę EM z naczynia. Zwróć uwagę, po której stronie neurony rosną na siatce EM; Pozycja będzie miała znaczenie dla następnego kroku. Użyj czarnej blokady przesuwnej na pęsetie, aby bezpiecznie zablokować pęsetę na siatce EM.</li>
	<li>Włóż pęsetę do maszyny do witryfikacji tak, aby ta strona siatki EM, do której przylegają neurony, była skierowana w lewo, z dala od bocznego otworu maszyny do witryfikacji. Wsuń specjalistyczną pęsetę do maszyny do witryfikacji.</li>
	<li>Umieść pojemnik na płyn chłodzący w odpowiednim uchwycie maszyny do witryfikacji. Powinien być wypełniony odpowiednią ilością LN2 i ciekłym etanem. Używając odpowiedniego polecenia ekranu maszyny do witryfikacji, podnieś komorę chłodziwa do góry, aż zostanie zpłukana z dnem komory wilgotnościowej.</li>
	<li>Za pomocą pęsety z płaską końcówką chwyć jedną krawędź bibuły filtracyjnej tak, aby krótszy bok (powierzchnia 0,5 cm x 0,5 cm) był prostopadły do pęsety. Ta powierzchnia będzie miała bezpośredni kontakt z siatką EM w celu osuszania (Rysunek 2B). Ostrożnie włóż bibułę filtracyjną do bocznego otworu komory wilgotnościowej maszyny do witryfikacji (Rysunek 2A). Stabilnie przyłóż papier do siatki EM (stroną odwróconą od próbki) przez 10 sekund. Następnie wyrzuć papier i natychmiast zanurz próbkę w ciekłym etanie za pomocą automatyzacji maszyny do witryfikacji.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś zamrożoną, uwodnioną siatkę EM do jednego z gniazd w jednym z przycisków do przechowywania siatki. Powtórz ten proces dla dodatkowych siatek EM w naczyniach. Przyciski do przechowywania siatki EM używane w tych eksperymentach mogą przechowywać wiele zamrożonych i uwodnionych siatek EM.</li>
</ol>
4. Zbieranie, przetwarzanie i opisywanie obrazów
<ol>
	<li>Przystąp do zbierania mikrofotografii elektronowych 2D i/lub serii 3-D pochylenia5 neurytów za pomocą mikroskopu krioelektronowego w warunkach niskiej dawki. Obrazy 2D miały na celu ocenę jakości siatki pod względem grubości lodu i możliwych obszarów, które mogą być przydatne w seriach pochylenia 3D.
	<ol>
		<li>W tym przypadku wszystkie obrazy zostały zebrane za pomocą kamery CCD 4k x 4k podłączonej do mikroskopu elektronowego 200 kV wyposażonego w pojedynczy uchwyt do transferu kriogenicznego ciekłego azotu, przy powiększeniu mikroskopu 20k przy docelowym niedoogniskowaniu 7 μm i próbkowaniu 4,4 A / piksel.</li>
		<li>Aby uzyskać tomogram 3D próbki, należy wykonać serię obrazów projekcyjnych, stopniowo przechylając próbkę wzdłuż jednej osi transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). Biorąc pod uwagę kąty nachylenia i inne ustawienia eksperymentalne, dostępnych jest kilka różnych programów, które automatycznie zbierają nachylenie serii5. Pokazane tutaj serie nachylenia 3D zostały zebrane pod tym samym mikroskopem przy użyciu półautomatycznego oprogramowania do akwizycji serii pochylenia 26 w zakresie od -60° do 60° w krokach co 5° z łączną dawką ~60 e/Å 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrekonstruuj szereg nachylenia neurytów za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu21, jak opisano wcześniej dla innych próbek5,29.</li>
	<li>Oznacz kolorami cechy 3D neurytów, najpierw segmentując tomogram i tworząc model powierzchni za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów 3D, jak opisano wcześniej5.</li>
</ol>

<ol><li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li>
<li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li>
<li>Binks, B. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBinks%2C+BP+%22Modern+characterization+methods+of+surfactant+systems%22">Modern characterization methods of surfactant systems</a>. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).</li>
<li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of bacterial cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277, 1990-1993 (1997).</li>
<li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+aqueous+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).</li>
<li>Fernández-Busnadiego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+molecular+organization+of+the+neuron+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography.</a> J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).</li>
<li>Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+membrane-bound+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of membrane-bound cellular organelles.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).</li>
<li>Garvalov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+particles+within+cellular+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Luminal particles within cellular microtubules.</a> J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).</li>
<li>Grünewald, K., Cyrklaff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+complex+viruses+and+virus-infected+cells+by+electron+cryo+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).</li>
<li>Gu, J., Bourne, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGu%2C+J+%22Structural+bioinformatics%22">Structural bioinformatics</a>. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).</li>
<li>De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Hoop%2C+MJ+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329(2004).</li>
<li>Fink, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+neurite+extension+and+synapse+formation+by+the+beta+but+not+the+alpha+isoform+of+CaMKII%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII.</a> Neuron. 39, 283-297 (2003).</li>
<li>Jacob, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+matrix+granules%3A+their+behavior+during+changing+metabolic+situations+and+their+relationship+to+contact+sites+between+inner+and+outer+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes.</a> Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).</li>
<li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Ibiricu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+Electron+Tomography+of+Herpes+Simplex+Virus+during+Axonal+Transport+and+Secondary+Envelopment+in+Primary+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons.</a> PLoS Pathog. 7, e1002406(2011).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Koning, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+electron+tomography+of+vitrified+fibroblasts%3A+microtubule+plus+ends+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ.</a> J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%3A+dopamine%2C+vesicles+and+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).</li>
<li>Lucić, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+imaging+of+neurons+grown+in+culture%3A+from+light+microscopy+to+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 160, 146(2007).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and.</a> 2, 152-160 (2007).</li>
<li>Marsh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+tomographic+studies+of+the+mammalian+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+actin+networks+in+intact+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of actin networks in intact filopodia.</a> Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).</li>
<li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770(2011).</li>
<li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li>
<li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li>
<li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li>
<li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li>
<li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSquire%2C+LR+%22Fundamental+neuroscience%22">Fundamental neuroscience</a>. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).</li>
<li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li>
<li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+expression+of+glycine+and+GABA%28A%29+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pokazujemy, że neurony embrionalne szczurów (zwój korzenia grzbietowego i hipokamp) mogą być hodowane na siatkach ze złotej mikroskopii elektronowej (EM) i zamrażane w szklistym lodzie wystarczająco cienkim, aby ich neuryty można było obrazować za pomocą 2-D cryo-EM i 3-D cryo-ET. Podczas gdy neuryty hipokampa były wcześniej obrazowane za pomocą cryo-ET8,10,18,23, brakowało protokołu wystarczająco szczegółowego, aby można było go pomyślnie replikować przy użyciu dostępnych na rynku urządzeń. Co więcej, podczas...

Neurony tworzą skomplikowane obwody niezbędne do funkcjonowania centralnego i obwodowego układu nerwowego, tworząc dendryty do odbierania informacji i aksony, często dość długie, do komunikowania się z neuronami znajdującymi się w dalszej części rzeki. Wyrost neurytów odgrywa fundamentalną rolę podczas rozwoju embrionalnego, a różnicowanie neuronów i utrzymanie neurytów wspiera krytycznie funkcjonowanie układu nerwowego. Procesy neurytyczne odgrywają również kluczową rolę w uszkodzeniach i regeneracji neuronów, a także w zaburzeniach układu nerwowego. Badanie architektury neuronalnej ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zarówno normalnego, jak i chorego mózgu. Na szczęście istnieją fizjologicznie istotne systemy hodowli komórek neuronalnych, które mogą rekapitulować złożone i niejednorodne struktury komórkowe. Opierając się na wyjaśnieniu solidnych platform eksperymentalnych, potrzebne są skuteczne strategie wizualizacji, które umożliwią jakościowe i ilościowe analizy morfologii neuronów. Szczególnie przydatna byłaby szczegółowa metodologia, która zapewnia spójną platformę do wizualizacji neurytów, zarówno aksonów, jak i dendrytów w skali nanometrowej.
Tradycyjna mikroskopia elektronowa wymaga użycia rozpuszczalnika organicznego podczas dehydratacji i zatapiania żywicy, co może wywołać zniekształcenia w próbkach w stosunku do ich prawdziwego stanu. Do tej pory większość charakterystyk strukturalnych w skali nanometrowej opiera się na większych komórkach lub tkankach, które są poddawane takim agresywnym substancjom chemicznym - ograniczając w ten sposób interpretację wyników4,9,25. Ponadto w przypadku penetracji wiązki elektronów wymagane jest cięcie w przypadku organizmów lub wypukłości komórkowych o grubości większej niż 1 μm 12. Wreszcie, pocięta lub zmielona tkanka powoduje zebranie dyskretnych zestawów danych specyficznych dla warstwy, co sprawia, że definicja wydłużonej cechy neurytów jest kłopotliwa. Nawet w przypadku cryo-EM, w którym możliwe jest cięcie zamrożonej i uwodnionej próbki, metoda wprowadza artefakty kompresji1.
W ostatnich latach badacze nauczyli się hodować neurony hipokampa bezpośrednio na siatkach EM i błyskawicznie zamrażać je w ciekłym etanie, aby następnie wizualizować neuryty za pomocą cryo-ET8,10,18,23. Jednak w takich badaniach albo wykorzystuje się specjalnie wykonane urządzenie10,23, albo brakuje szczegółów na temat etapu blottingu w celu wygenerowania wystarczająco cienkiego lodu szklistego do rutynowej wizualizacji8,18. Na przykład jedno z badań zaleca użycie 30-40 sekund do osuszania siatki EM10; Jednak wartość ta nie jest zoptymalizowana do ogólnego użytku, ale jest specyficzna dla tego wykonanego na zamówienie urządzenia do zamrażania wgłębnego. Użycie urządzenia wykonanego na zamówienie, a nie dostępnego na rynku,17 do utrzymania wilgotności przed zamrożeniem wgłębnym, próbka może stanowić przeszkodę dla powszechnej odtwarzalności.
Chociaż te badania były przełomowe w wizualizacji neurytów przez cryo-ET, poszliśmy o krok dalej, aby zbadać możliwość zastosowania cryo-ET do różnych próbek neuronów (neurony zwojowe hipokampa i korzenia grzbietowego). Dodatkowo omawiamy zarówno optymalne, jak i nieoptymalne wyniki, a także potencjalne artefakty, które można napotkać przy użyciu cryo-ET dla takich próbek.
Zdefiniowanie szczegółowej techniki zachowywania i wizualizacji całych neurytów w skali nanometrowej w stanie zbliżonym do natywnego zwiększyłoby zdolność większej liczby badaczy do prowadzenia badań ultrastrukturalnych. W tym celu opisujemy skuteczny i szczegółowy protokół wykorzystujący dostępny na rynku sprzęt do przygotowania nieutrwalonych, niebarwionych neuronów do wizualizacji neurytów. Jest to ważny pierwszy krok w kierunku szczegółowego zbadania ultrastruktury zdrowych neurytów i stworzenia podstaw do zrozumienia, jakie różnice strukturalne występują w modelach chorób układu nerwowego. Ponieważ cryo-ET może rozwiązywać nieutrwalone, niebarwione cechy neurytów w 3D w skali nanometrów, metoda ta umożliwi zdefiniowanie architektury neurytycznejjak nigdy dotąd.

<table><tbody><tr><td>Dumont #7 Pęseta</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72803-01</td><td>Do obsługi siatek EM</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>Do wzrostu próbki</td></tr><tr><td>Siatki do mikroskopii elektronowej</td><td>Quantifoil</td><td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td><td>Do próbki do uprawy</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna bez wapnia</td><td>Whatman</td><td>1541-055</td><td>Do bibuły</td></tr><tr><td>próbki Duża płaska pęseta długa</td><td>Excelta Corporation</td><td>E003-000590, 25-SA</td><td>Do blot próbki&nbsp;</td></tr><tr><td>Urządzenie do witryfikacji i pęseta</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark III</td><td>Do zamrażania próbek</td></tr><tr><td>Pudełka do przechowywania Minigrid</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>160-40</td><td>Do przechowywania siatek EM</td></tr><tr><td>Uchwyt transferowy</td><td>Cryo Gatan</td><td>626 Uchwyt do transferu kriogenicznego z ciekłym azotem z pojedynczym przechyleniem Do</td><td>próbkowania</td></tr><tr><td>próbek Półautomatyczne oprogramowanie do akwizycji serii pochylenia</td><td>SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td> <td>Do próbek obrazowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>IMOD eTomo</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td> <td>Do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy do cryoEM</td><td>JEOL, Tokio</td><td>JEM2100 Mikroskop elektronowy LaB6 200-kV 200 kV Do cyfrowego łączenia się z mikroskopem LaBsub6/sub</td> Do <td>próbkowania próbek</td></tr><tr><td>Kamera CCD 4k</td><td>Gatan</td><td>N/A</td><td>Do obrazowania próbek Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>3D</td><td>Visage Imaging GmbH</td><td>Amira/Avizo</td><td>Do przetwarzania danych 3D</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do cyfrowego łączenia obrazów 2D</td><td>Adobe</td><td>Adobe Photoshop</td><td>Do przetwarzania danych 2-D</td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td>Do hodowli hipokampa</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>Aldrich B-0252</td><td>Do hodowli hipokampa</td></tr><tr><td>Tetraboran sodu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich B-9876</td><td>Do hodowli hipokampa</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636-500MG</td><td>Do hodowli hipokampa</td></tr><tr><td>System filtrów</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>Do hodowli hipokampa</td></tr><tr><td>Pożywka neurobazalna</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Do hodowli DRG</td></tr><tr><td>Suplement B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Do hodowli DRG</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Do hodowli DRG</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Do hodowli DRG</td></tr><tr><td>Rekombinowany szczur b-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>556-NG</td><td>Do hodowli DRG</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003-5G</td><td>Do hodowli DRG</td></tr><tr><td>5'-Fluoro-2'-deoksyurydyna</td><td>Sigma</td><td>F0503-100MG</td><td>Do hodowli DRG</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Do hodowli DRG</td></tr></tbody></table>

przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neuryty, zarówno dendryty, jak i aksony, to neuronalne procesy komórkowe, które umożliwiają przewodzenie impulsów elektrycznych między neuronami. Zdefiniowanie struktury neurytów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób procesy te przenoszą materiały i sygnały, które wspierają komunikację synaptyczną. Mikroskopia elektronowa (EM) jest tradycyjnie stosowana do oceny cech ultrastrukturalnych w obrębie neurytów; Jednak narażenie na rozpuszczalnik organiczny podczas odwadniania i zatapiania żywicy może zniekształcać struktury. Ważnym, niezrealizowanym celem jest sformułowanie procedur, które pozwolą na ocenę strukturalną, na którą takie artefakty nie mają wpływu.
W tym miejscu ustaliliśmy szczegółowy i powtarzalny protokół hodowli i błyskawicznego zamrażania całych neurytów różnych pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, a następnie ich badania za pomocą kriotomografii elektronowej (cryo-ET). Technika ta pozwala na wizualizację 3D zamrożonych, uwodnionych neurytów w rozdzielczości nanometrowej, ułatwiając ocenę ich różnic morfologicznych. Nasz protokół daje bezprecedensowy wgląd w neuryty zwoju korzenia grzbietowego (DRG) oraz wizualizację neurytów hipokampa w ich stanie zbliżonym do rodzimego. W związku z tym metody te stanowią podstawę do przyszłych badań nad neurytami zarówno normalnych neuronów, jak i tych dotkniętych zaburzeniami neurologicznymi.

Przed zamrażaniem i obrazowaniem za pomocą cryo-ET należy wykonać zdjęcia mikroskopem świetlnym siatki EM, na której rosną neurony. Neuryty powinny być wyraźnie widoczne, bez znaczących nakładania się na siebie. Kolorowa ramka na Rysunku 3A reprezentuje obszar powiększony na Rysunku 3B, na którym neuryty rozciągają się wzdłuż konstrukcji siatki. Każde pole siatki składa się z dziurkowanej folii węglowej, która podtrzymuje neurony i ich neuryty. Otwory te są widoczne na obrazie cryo-EM wy...

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla pierwotnych neuronów szczura w sposób, który sprawi, że będą one odpowiednie do wizualizacji za pomocą kriomikroskopii elektronowej. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie szalek z siatkami EM do wysiewu pierwotnych neuronów. Drugim krokiem jest przygotowanie i wysianie pierwotnych neuronów na siatkach EM.Następnie przeprowadza się witryfikację neuronów na siatkach EM. Ostatnim krokiem jest wykonanie obrazowania za pomocą kriomikroskopii elektronowej, a następnie postprocessing i adnotacja. W końcowym etapie kriomikroskopia i kriotomografia elektronowa są wykorzystywane do ukazania ultrastruktury neurytów w zamrożonym stanie uwodnionym.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość trójwymiarowej wizualizacji zamrożonych i uwodnionych neurytów z rozdzielczością nanometrową bez użycia utrwalaczy chemicznych. Ułatwia to tym samym ocenę cech morfologicznych bardziej zbliżonych do stanu naturalnego. Procedurę należy rozpocząć od sprawdzenia integralności folii węglowej na złotych siatkach EM.Używając mikroskopu świetlnego przy powiększeniu co najmniej 25-krotnym, należy upewnić się, że otwory węglowe są w ponad 98% nienaruszone. W celu wysiewania neuronów pierwotnych należy użyć palnika Bunsena, aby wysterylizować siatki EM płomieniem, a jednocześnie uczynić je hydrofilowymi. Następnie należy niezwłocznie przenieść siatkę stroną węglową do góry na środek szkiełka.Do spodniej części naczynia włóż jedną siatkę EM na naczynie, używając wyłącznie wcześniej wysterylizowanych naczyń z szklanym dnem. Następnie, w komorze do hodowli tkankowych, użyj mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić integralność siatki, podczas gdy siatka EM wciąż znajduje się w naczyniu z szklanym dnem; nanieś 250 µL odpowiedniej substancji powlekającej na centralny szklany obszar szalki Petriego. Powoli i ostrożnie upewnij się, że odpowiednia substancja powlekająca pokrywa całą siatkę EM.Następnie przykryć szalkę Petriego pokrywką i inkubować preparaty przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Kolejnym krokiem jest odessanie całej mieszaniny poliolu i lizyny z szalek za pomocą sterylnego końcówki pipety przymocowanej do rurki próżniowej w dygestorium. Należy unikać bezpośredniego kontaktu z siatką E EM.Następnie, za pomocą regulowanej pipety automatycznej, ostrożnie nanieś 250 µL sterylnego PBS, aby całkowicie pokryć siatkę EM w centralnym szklanym obszarze każdej szalki Petriego. Następnie odessaj PBS z każdej szalki. Powtórz tę procedurę jeszcze trzy razy.Pozostaw szalki z siatkami EM do wyschnięcia w komorze do hodowli tkankowej na 15 minut. Sprawdź stan siatek pod mikroskopem świetlnym, upewniając się, że są całkowicie suche i że na siatkach nie ma pęcherzyków wilgoci.W przeciwnym razie należy ostrożnie odessać nadmiar wilgoci z obszaru obok siatki EM; powleczoną siatkę należy niezwłocznie wykorzystać do wysiewu neuronów. W tej procedurze należy obliczyć odpowiednią objętość komórek dla każdej szalki, aby uzyskać stężenie 50 000 komórek na mililitr na szalkę. Maksymalna objętość aplikowana powinna wynosić 250 µL, aby wypełnić jedynie centralny obszar szklany, a nie całą szalkę.Następnie inkubuj szalki przez 30 minut w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić komórkom regenerację i przyleganie; po 30 minutach powoli dodaj 1,5 ml podgrzanej pożywki komórkowej do każdej szalki, unikając dotykania siatki EM w przypadku neuronów hipokampa. Wymień pożywkę następnego dnia, a następnie wymieniaj połowę pożywki co dwa dni przez 14 dni. W tej procedurze przygotuj sprzęt i wszystkie materiały do mrożenia i przechowywania złotych siatek EM w temperaturze kriogenicznej, w tym urządzenie do witryfikacji z komorą wilgotności, papier filtracyjny wolny od wapnia, parę długich pęset o płaskich końcach, parę specjalistycznych pęset o cienkich końcach do urządzenia do witryfikacji, naczynie z ciekłym azotem, pojemnik chłodzący oraz pudełko do przechowywania siatek EM.Następnie włącz urządzenie do witryfikacji. Ustaw wilgotność na 100% oraz temperaturę na 32 °C. W sekcji opcji ustaw czas blokowania na zero sekund.Umożliwia to ręczne osuszanie przez boczny otwór komory wilgotnościowej. Następnie należy ułożyć stos trzech papierów filtracyjnych wolnych od wapnia. Stos należy pociąć w paski o szerokości 0,5 centymetra i długości około dwóch centymetrów, a następnie zagiąć je pod kątem 90 stopni tak, aby jedna sekcja papieru miała wymiary 0,5 centymetra na 0,5 centymetra.Ta sekcja będzie służyć do osuszania preparatu. Usuń środkowy papier i odłóż go na inny papier filtracyjny wolny od wapnia do czasu użycia. Następnie, używając specjalistycznej pęsety do witryfikacji, ostrożnie wyjmij siatkę EM z naczynia.Należy zwrócić uwagę, na której stronie siatki EM rosną neurony, ponieważ pozycja ta będzie miała znaczenie w następnym kroku. Następnie należy użyć czarnej przesuwanego blokady na pincecie, aby bezpiecznie zamocować pincetę do siatki EM. Teraz należy włożyć pincetę do urządzenia do witryfikacji w taki sposób, aby strona siatki EM, do której przylegają neurony, była skierowana w lewo i była odwrócona od okrągłego otworu po bokach urządzenia do witryfikacji.Następnie wsuń pęsetę trzymającą siatkę EM z powrotem do urządzenia do witryfikacji. Po tym czasie umieść pojemnik z chłodziwem wypełniony odpowiednią ilością LN2 i etanu w cieczy w odpowiednim uchwycie urządzenia do witryfikacji, korzystając z właściwej komendy na ekranie sterującym urządzenia. Za pomocą pęsety płaskiej podnieś komorę chłodzącą do góry, aż zrówna się ona z dnem komory wilgotności.Chwyć jedną krawędź papieru filtracyjnego w taki sposób, aby krótszy bok był prostopadły do pęsety. Ta powierzchnia będzie miała bezpośredni kontakt z siatką EM podczas osuszania. Następnie ostrożnie i stabilnie włóż papier filtracyjny do bocznego otworu komory wilgotności. Przytrzymaj papier przy siatce EM przez 10 sekund, wyrzuć go i natychmiast przeprowadź mrożenie w ciekłym etanie.Zamroź preparat w ciekłym etanie, korzystając z automatyzacji urządzenia do witryfikacji. Następnie ostrożnie przenieś zamrożoną, hydratowaną siatkę EM do jednego z gniazd w pojemniku do przechowywania siatek. Jest to obraz z mikroskopu świetlnego centralnej części siatki EM przy 10-krotnym powiększeniu, na której przez dwa tygodnie rosły pierwotne neurony szczura.Oto powiększony widok niebieskiej ramki, w której obserwowane są neurony i ich wypustki neurytowe. Jest to mikrografia elektronowa neurytu wyrastającego z ciała neuronu przy powiększeniu 4K. Tutaj przedstawiono zbliżenie obszaru zaznaczonego niebieską ramką, gdzie wewnętrzne struktury neurytów są wyraźnie widoczne przy powiększeniu 20 K.Niniejszy film przedstawia rekonstrukcję 3D stosu mikrografii neurytu z pierwotnej hodowli neuronów hipokampa szczura. Obraz został wykonany przy użyciu tomografii, a następnie uzupełniony odpowiadającą mu kolorową adnotacją 3D. Poniżej znajduje się kolejny film pokazujący rekonstrukcję 3D stosu obrazów aksonu z zwoju korzenia grzbietowego szczura, zarejestrowanych za pomocą kriotomografii elektronowej, wraz z odpowiadającą im kolorową adnotacją 3D; przedstawiono tutaj również montaż czterech dwuwymiarowych obrazów cryo-EM innego aksonu z zwoju korzenia grzbietowego szczura, wykonanych przy powiększeniu 20 K.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania pierwotnych neuronów na siatkach do mikroskopii elektronowej w sposób umożliwiający ich wizualizację w stanie zamrożonym i uwodnionym z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej.

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizowania neurytów w stanie mrożonego hydratu za pomocą krio-tomografii elektronowej

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Przedstawiamy protokół do użycia metody barwienia Golgiego-Coxa w grubych fragmentach mózgu, w celu wizualizacji neuronów z długimi drzewami dendrytycznymi zawartymi w pojedynczych próbkach tkanek. Przedstawiono również dwa warianty tego protokołu, które obejmują barwienie przeciwstawne fioletem krezylowym i zamrażanie nieprzetworzonych mózgów w celu długotrwałego przechowywania.

Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj metodę przygotowania pierwotnych neuronów szczura do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej. Technika ta umożliwia uzyskanie obrazów ultrastruktury neuronalnej w rozdzielczości nanometrycznej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Przeglądaj więcej filmów