Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie pierwotnych neuronów szczurów w taki sposób, aby ich neurony nadawały się do wizualizacji za pomocą mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw naczyń z siatkami EM do posiewu neuronów pierwotnych. Drugim krokiem jest przygotowanie i umieszczenie pierwotnych neuronów na siatkach EM.

Następnie przeprowadza się witryfikację neuronów na siatkach EM. Ostatnim krokiem jest zebranie obrazów za pomocą mikroskopii krioelektronowej, a następnie obróbka końcowa i adnotacja. Ostatecznie mikroskopia krioelektronowa i tomografia są wykorzystywane do pokazania ultrastruktury neurytów w zamrożonym stanie uwodnionym.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że można ją wykorzystać do wizualizacji 3D zamrożonych uwodnionych neurytów w rozdzielczości nanometrowej bez użycia chemicznych utrwalaczy. W związku z tym ułatwia ocenę cech morfologicznych, które są bliższe stanowi rodzimemu. Rozpocznij tę procedurę od zbadania integralności świętego węgla na złotych siatkach EM.

Używając mikroskopu świetlnego o powiększeniu co najmniej 25 razy, upewnij się, że otwory węglowe są większe niż 98% nienaruszone. Do posiewu neuronów pierwotnych użyj palnika Bunsena, aby wysterylizować płomieniowo siatki EM i jednocześnie uczynić je hydrofilowymi. Natychmiast przenieś siatkę stroną z włókna węglowego do środka szkła.

Dolne naczynie, umieść jedną siatkę EM na naczynie i używaj tylko wstępnie wysterylizowanych szklanych naczyń dolnych. Następnie użyj mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić integralność siatki, nadal utrzymując siatkę EM wewnątrz szklanego naczynia dolnego w kapturze do hodowli tkankowych, nałóż 250 mikrolitrów odpowiedniej substancji powlekającej na centralną szklaną powierzchnię szalki Petriego. Powoli i ostrożnie upewnij się, że odpowiednia substancja powłokowa pokrywa całą siatkę E EM.

Następnie przykryj szalkę Petriego pokrywką i inkubuj próbki przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie odessać całą mieszaninę polioli lizyny z naczyń za pomocą sterylnej końcówki pipety przymocowanej do rurki próżniowej w kapturze. Unikać bezpośredniego kontaktu z siatką E EM.

Następnie użyj pipety z regulowanym wyporem powietrza, aby ostrożnie nałożyć 250 mikrolitrów sterylnego PBS, aby całkowicie pokryć siatkę EM w centralnym obszarze szklanym każdej szalki Petriego. Następnie odessaj PBS z każdej płytki. Następnie powtórz procedurę trzy razy.

Pozostaw naczynia z kratkami EM do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych przez 15 minut. Sprawdzanie pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że są całkowicie suche, a w siatce nie ma pęcherzyków wilgoci.

W przeciwnym razie ostrożnie zasysaj obok siatki EM, aby wyeliminować tę dodatkową wilgoć, powlekana siatka powinna być natychmiast użyta do poszycia neuronów. W tej procedurze należy obliczyć odpowiednią objętość komórek dla każdej potrawy, aby osiągnąć stężenie 50 000 komórek na mililitr na naczynie. Maksymalna ilość aplikacji powinna wynosić 250 mikrolitrów, aby wypełnić tylko środkową powierzchnię szkła, a nie całe naczynie.

Następnie inkubuj naczynia przez 30 minut w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby komórki mogły się zregenerować i przylegać, po 30 minutach powoli dodaj 1,5 mililitra podgrzanej pożywki komórkowej do każdej pożywki i unikaj dotykania siatki EM neuronów hipokampa. Zmień nośnik następnego dnia, a następnie zmieniaj połowę nośnika co dwa dni przez 14 dni. W tej procedurze przygotuj sprzęt i wszystkie materiały do zamrażania i przechowywania złotych siatek EM w temperaturze kriogenicznej, które obejmują urządzenie do witryfikacji z komorą wilgotnościową, bibułę filtracyjną bez wapnia, parę długich płaskich pęset, parę specjalistycznych pęset z cienkimi końcówkami do maszyny do witryfikacji, środek do ciekłego azotu, pojemnik na chłodziwo i skrzynkę do przechowywania siatki EM.

Następnie włącz urządzenie do witryfikacji. Ustaw wilgotność na 100%, a temperaturę na 32 stopnie Celsjusza. W sekcji opcji ustaw czas bloku na zero sekund.

Pozwala to na ręczne osuszanie przez boczne okienko komory wilgotnościowej. Następnie ułóż trzy bibuły filtracyjne bez wapnia. Pokrój stos na paski o szerokości 0,5 centymetra, które mają około dwóch centymetrów długości, a następnie zegnij je pod kątem 90 stopni tak, aby jedna część papieru miała wymiary 0,5 centymetra na 0,5 centymetra.

Ta sekcja zostanie wykorzystana do osuszania próbki. Usuń środkową bibułę i umieść ją na innej bibule filtracyjnej bez wapnia do czasu użycia. Następnie użyj specjalistycznej pęsety do witryfikacji, aby ostrożnie wybrać siatkę EM z naczynia.

Zwróć uwagę na stronę siatki EM, na której rosną neurony, ponieważ pozycja będzie miała znaczenie dla następnego kroku. Następnie użyj czarnej blokady przesuwnej na pęsetie, aby bezpiecznie zablokować pęsetę na siatce EM. Teraz włóż pęsetę do maszyny do witryfikacji tak, aby strona siatki EM, do której przylegają neurony, była skierowana w lewo i od okrągłego otworu otwierającego z boku maszyny do witryfikacji.

Następnie wsuń pęsetę, która przytrzymuje siatkę EM, do maszyny do witryfikacji. Następnie umieść pojemnik na płyn chłodzący wypełniony odpowiednią ilością LN dwa i ciekłym etanem w odpowiednim uchwycie maszyny do witryfikacji, korzystając z odpowiedniego polecenia ekranowego maszyny do witryfikacji. Podnieś komorę chłodziwa do góry, aż zostanie przepłukana dnem komory wilgotności za pomocą płaskiej pęsety.

Chwyć jedną krawędź bibuły filtracyjnej tak, aby krótszy bok był prostopadły do pęsety. Ta powierzchnia będzie miała bezpośredni kontakt z siatką EM w celu osuszania. Teraz ostrożnie włóż bibułę filtracyjną do bocznego otworu komory wilgotności stabilnie Przytrzymaj papier przy siatce EM przez 10 sekund, wyrzuć papier i natychmiast zanurz.

Zamrozić próbkę w ciekłym etanie za pomocą automatyzacji maszyny do witryfikacji. Następnie ostrożnie przenieś zamrożoną, uwodnioną siatkę EM do jednego ze szczelin w magazynie sieciowym. Jest to obraz z mikroskopu świetlnego centralnego obszaru siatki EM w 10-krotnym powiększeniu, na którym od dwóch tygodni rosną pierwotne neurony szczura.

Oto powiększony widok pudełka wodnego, w którym obserwuje się neurony i ich projekcje neurytów. Jest to mikrofotografia elektronowa neurytu wystającego na zewnątrz z ciała neuronu w powiększeniu 4K. Niebieska ramka jest oglądana z bliska, gdzie wewnętrzne cechy neurytów są wyraźnie widoczne w powiększeniu 20 K.

Ten film pokazuje zrekonstruowany w 3D stos mikrofotografii neurytu z pierwotnej hodowli neuronów hipokampa szczura. Jest on obrazowany za pomocą tomografii, a następnie następuje odpowiednia adnotacja kolorystyczna 3D. Oto kolejny film pokazujący zrekonstruowany w 3D stos obrazów aksonu zwoju korzenia grzbietowego szczura zebranych za pomocą tomografii krioelektronowej, po którym następuje odpowiednia adnotacja koloru 3D, a tutaj pokazano montaż czterech obrazów 2D cryo-EM oddzielnego aksonu zwoju korzenia grzbietowego szczura, wykonanych w powiększeniu 20 K.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować pierwotne neurony na siatkach mikroskopii elektronowej w taki sposób, aby był odpowiedni do wizualizacji ich neuronów w zamrożonym stanie uwodnionym za pomocą krioelektronowej tomografii.