Hodowla i utrzymanie Clostridium difficile w środowisku beztlenowym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie C. difficile z próbek kału w celu hodowli C. difficile do przygotowania zapasów w glicerolu do długoterminowego przechowywania oraz przygotowanie i zliczenie zapasów przetrwalników do różnych zastosowań analitycznych. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację C. difficile z próbek kału za pomocą wysiewu na podłoże selektywne. Drugim krokiem jest hodowla C. difficile w podłożu płynnym oraz utrzymywanie długoterminowych zapasów C. difficile w glicerolu.

Następnie C difficile jest pobierana z zamrożonych zapasów w glicerolu i wysiewana na płytki agarowe. W ostatnim kroku, zgodnie z poniższymi protokołami, przygotowywane są i mianowane zapasy przetrwalników C difficile. C difficile może być hodowana na różnych pożywkach w celu weryfikacji i potwierdzenia jej tożsamości, a także w celu skutecznego namnażania i utrzymywania kultury.

Te stokiki glicerynowe oraz kultury mogą być dalej wykorzystywane w licznych aplikacjach następczych, w tym w badaniach na zwierzętach oraz dodatkowych badaniach z zakresu biologii molekularnej. Główną zaletą wykorzystania winylowej komory anaerobowej do hodowli c difficile w porównaniu z innymi metodami, takimi jak słoiki świecowe, jest możliwość utrzymania rygorystycznie beztlenowego środowiska, co pozwala na spójny i niezawodny wzrost c difficile. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi technikami mogą napotkać trudności wynikające z ograniczonej sprawności manualnej wewnątrz komory spowodowanej rękawicami, a także z krytycznej potrzeby planowania eksperymentów z wyprzedzeniem.

Procedury te zaprezentuje technik z mojego laboratorium, Jose Suarez In. Procedurę tę można przeprowadzić w warunkach tlenowych. W pierwszej kolejności należy zważyć próbkę kału.

Jest to niezbędne do wyliczenia liczby c difficile w kale. Następnie zawiesić próbkę kału w 1 XPBS i wymieszać w wirówce vortex, aby upewnić się, że próbka kału została całkowicie resuspendowana. Następnie wykonać rozcieńczenia seryjne resuspendowanej próbki kału w 1 XPBS w celu odpowiedniej izolacji lub wyliczenia jednostek tworzących kolonie lub CFU na gram kału w dalszych etapach.

Procedurę należy przeprowadzić w warunkach beztlenowych, aby upewnić się, że komórki wegetatywne C difficile nie są narażone na działanie tlenu. Komora beztlenowa użyta w tym eksperymencie jest utrzymywana w temperaturze 37 °C. Należy stosować techniki aseptyczne.

Nanieś 100 µL każdego rozcieńczenia seryjnego na płytki z agarem Toro collate oxetane, cyclo Seine, fructose agar lub T-C-C-F-A. Płytki te były wstępnie redukowane przez co najmniej jedną do dwóch godzin w komorze beztlenowej, aby zapewnić usunięcie resztkowego tlenu. Pozwoli to na wyizolowanie kolonii do dokładnego przeliczenia lub do innych dalszych zastosowań.

Za pomocą sterylnej pętli do szczepienia równomiernie rozprowadź naniesioną kulturę na powierzchni płytki T-C-C-F-A. Inkubuj płytki beztlenowo przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Po upływie 48 godzin zidentyfikuj kolonie c difficile na podstawie ich płaskiego, nieregularnego wyglądu przypominającego szkło matowe, aby upewnić się, że wegetatywne formy c difficile nie zostały zniszczone przez kontakt z tlenem.

Szalki do izolowania kolonii na potrzeby dalszych zastosowań muszą być przez cały czas przechowywane w komorze beztlenowej. W przypadku enumeracji kolonii szalki można wyjąć z komory beztlenowej. Należy pamiętać, że po wyjęciu szalki z komory wegetatywne formy c difficile zostaną wystawione na działanie tlenu i zginą.

Tych kolonii C difficile nie można odzyskać, nawet jeśli płytka zostanie zwrócona do komory. Należy policzyć kolonie C difficile dla każdego rozcieńczenia i obliczyć liczbę CFU na gram próbki kału, aby przeprowadzić hodowlę i przygotować zapasy glicerolowe C difficile. Za pomocą sterylnej pętli szczepiącej należy pobrać pojedynczą kolonię i wysiać ją na podłoże pre-reduced brain heart infusion.

Na płytkę z agarem BHIS uzupełnionym ekstraktem drożdżowym lub cysteiną 0,03% należy wysiać pojedyncze kolonie metodą rozchodzenia w kwadrantach, używając nowej sterylnej pętli do każdego kwadrantu. Płytki inkubować beztlenowo w temperaturze 37°C przez 16 do 24 godzin. Po pojawieniu się odizolowanych kolonii na płytkach z agarem BHIS, należy pobrać pojedynczą odizolowaną kolonię i zawiesić ją w 10 ml uprzednio zredukowanego płynnego medium BHIS uzupełnionego cysteiną 0,03%, a następnie inkubować przez noc.

Tlenowo w temperaturze 37 °C lub do momentu zmętnienia hodowli. Następnego dnia należy przenieść 333 µl 50% glicerolu oraz 666 µl hodowli C. difficile do probówki kriogenicznej o pojemności 1,8 ml. Aby przygotować zapas izolowanego szczepu w 15% glicerolu, należy szczelnie zakręcić probówkę kriogeniczną i wymieszać zawartość.

Następnie należy niezwłocznie wyjąć stok z komory beztlenowej i umieścić go w zamrażarce w temperaturze -80 °C do długoterminowego przechowywania. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyjąć zamrożony stok glicerolowy c difficile z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Aby zapobiec rozmrożeniu.

Zamrożony stok glicerolowy należy natychmiast umieścić w statywie chłodzącym, który przed użyciem był przechowywany w temperaturze -80 °C. Przenieść zamrożony stok glicerolowy w statywie chłodzącym do komory beztlenowej, stosując technikę aseptyczną i sterylną pętlę do szczepienia. Nanieść niewielką ilość stoku na płytkę i wykonać posiew w jednym kwadrancie płytki.

Obrócić płytkę o 90 stopni i za pomocą nowej sterylnej pętli do posiewu wykonać posiew w drugim kwadrancie. Powtórzyć czynność dla trzeciego i czwartego kwadrantu, aby zapewnić izolację pojedynczych kolonii. Natychmiast wyjąć zamrożony stok glicerolowy z komory beztlenowej i przenieść go z powrotem do zamrażarki w temperaturze -80 °C.

Inkubować płytkę beztlenowo przez noc w temperaturze 37°C, aby oczyścić przetrwalniki z hodowli c difficile. Szczepy z mrożonych zapasów glicerolowych przenieść na wstępnie zredukowane płytki BHIS, postępując zgodnie z procedurą przedstawioną w poprzednim segmencie.

Inkubować beztlenowo przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia wyizolować pojedyncze kolonie na kilka przedredukowanych płytek z agarem 70 30. Inkubować beztlenowo w temperaturze 37 °C przez 24 do 48 godzin.

Po utworzeniu się przetrwalników wyjmij płytki z komory beztlenowej. Zeskrob zawartość płytek za pomocą sterylnej pętli do szczepienia i resuspenduj komórki w 10 mililitrach sterylnego 1x PBS. Płytki wyrzuć, a komórki sypiecie w wirówce przy 3000 G przez 15 minut.

Usunąć nadosad, dodać 1 mL zawiesiny w 1xPBS, zawiesić i ponownie odwirować w ten sam sposób. Przemyć komórki dwukrotnie w PBS, inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, aby wspomóc lizę komórek wegetatywnych i matecznych następnego dnia, a następnie inkubować w temperaturze 70 °C przez 20 minut w celu zniszczenia wszelkich pozostałych komórek wegetatywnych. Aby określić liczbę CFU na mililitr, wykonać rozcieńczenia seryjne każdego preparatu zarodników w 1xPBS i wysiać na podłoże BHIS z dodatkiem 0,1% taurocholanu sodu w warunkach redukcyjnych; płytki inkubować w temperaturze 37 °C przez minimum 24 godziny przed przeliczeniem kolonii.

Zarodniki można przechowywać w roztworze XPBS w temperaturze pokojowej w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku przechowywania długoterminowego. A. Tutaj przedstawiono przykład wzrostu C. difficile na podłożu BHIS oraz beztlenowym agarze z krwią owczą Columbia.

C difficile tworzy nieregularne kolonie, które są płaskie i mają wygląd szkła matowego, co jest widoczne na obu podłożach. Panel A przedstawia wrażliwy na erytromycynę izolat kliniczny C difficile 630 E wyhodowany przez 24 godziny na agarze BHIS, który jest wzbogaconym podłożem nieselektywnym. W temperaturze 37°C kolonie na beztlenowym agarze krwi owczej Columbia, pokazane w panelu B, wyglądają podobnie do tych wyhodowanych na BHIS w świetle białym.

Jednakże zastosowanie tego podłoża umożliwia również wykrycie zielonkawego lub cytrynowego fluorescencji wykazywanej przez C difficile w świetle ultrafioletowym o długiej fali, co pokazano w panelu C po przeprowadzeniu tej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania z zakresu biologii molekularnej można zastosować inne metody, takie jak krzywe wzrostu w medium płynnym, analiza DNA i RNA, izolacja kolonii, PCR oraz inne techniki biologii molekularnej i manipulacje odpowiednie dla C difficile, a także wykorzystanie przetrwalników C difficile w badaniach na zwierzętach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować, hodować i utrzymywać komórki wegetatywne oraz przetrwalniki C difficile w środowisku beztlenowym.

Należy pamiętać, że C. difficile jest patogenem ludzkim i zwierzęcym, który może wywoływać choroby układu pokarmowego. Eksperymenty z C. difficile muszą być przeprowadzane w odpowiednich warunkach poziomu biosafety level two.