Name: Hodowla i utrzymanie Clostridium difficile w środowisku beztlenowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-14T21:25:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metody izolacji i hodowli Clostridium difficile w warunkach beztlenowych. Naucz się przygotowywać stoki glicerolowe oraz sporowe do długoterminowego przechowywania tego patogennego bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Coy Laboratories za uprzejme udostępnienie zdjęć komory beztlenowej. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health grant DK087763 (S.M. M.) oraz stypendium STEP/HHMI Curriculum Development Fellowship (A.N.E.).

<ol><li>Hall, I. C., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+flora+in+new-borin+infants+-+With+a+description+of+a+new+pathogenic+anaerobe%2C+Bacillus+difficilis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Dis.+Child%22%5BJournal%5D)">Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis.</a> Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).</li>
<li>Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clindamycin-Associated+Colitis+-+Prospective+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study.</a> Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).</li>
<li>Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+30+years+on%3A+what+has%2C+or+has+not%2C+changed+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).</li>
<li>Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Treatment of Clostridium difficile infection.</a> Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).</li>
<li>Dubberke, E. R., Olsen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+on+the+healthcare+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile on the healthcare system.</a> Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).</li>
<li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).</li>
<li>Peery, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+gastrointestinal+disease+in+the+United+States%3A+2012+update%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update.</a> Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).</li>
<li>Deakin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+difficile+spo0A+gene+is+a+persistence+and+transmission+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor.</a> Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).</li>
<li>Drasar, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+anaerobic+intestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of anaerobic intestinal bacteria.</a> J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).</li>
<li>Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+CO+2+cabinet+for+the+cultivation+of+strict+anerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes.</a> Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).</li>
<li>Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+anaerobic+systems+for+the+isolation+of+anaerobic+bacteria+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens.</a> Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).</li>
<li>Bacic, M. K., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+and+cultivation+of+bacteroides+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11(2008).</li>
<li>Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proficiencies+of+three+anaerobic+culture+systems+for+recovering+periodontal+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).</li>
<li>Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultivation+of+Treponema+microdentium+as+surface+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies.</a> Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+differential+medium+for+isolation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile.</a> J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).</li>
<li>Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Clostridium+difficile+by+normal+hamster+cecal+flora+and+prevention+of+antibiotic-associated+cecitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis.</a> Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).</li>
<li>Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sodium+taurocholate+to+enhance+spore+recovery+on+a+medium+selective+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile.</a> J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).</li>
<li>Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cycloserine-cefoxitin-fructose+agar+%28CCFA%29+and+taurocholate-CCFA+for+recovery+of+Clostridium+difficile+during+surveillance+of+hospitalized+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).</li>
<li>Marler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+cultural+procedures+for+isolation+of+Clostridium+difficile+from+stools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools.</a> J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).</li>
<li>Sorg, J. A., Dineen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).</li>
<li>Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).</li>
<li>Lemee, L., Pons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for Clostridium difficile.</a> Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).</li>
<li>Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+gram-stained+stool+smears+in+diagnosis+of+Clostridium+difficile+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis.</a> J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).</li>
<li>Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferable+tetracycline+resistance+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).</li>
<li>Permpoonpattana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+layers+of+Clostridium+difficile+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Surface layers of Clostridium difficile endospores.</a> J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).</li>
<li>Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpoIVA+and+SipL+are+Clostridium+difficile+spore+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins.</a> J. Bacteriol. , (2013).</li>
<li>Burns, D. A., Minton, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+studies+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sporulation studies in Clostridium difficile.</a> J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).</li>
<li>Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clospore%3A+a+liquid+medium+for+producing+high+titers+of+semi-purified+spores+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile.</a> J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+initiation+of+Clostridium+difficile+spore+germination+using+analogs+of+chenodeoxycholic+acid%2C+a+bile+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid.</a> J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).</li>
<li>O'Connor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+chromosomal+Clostridium+difficile+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants.</a> Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).</li>
<li>Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+recovery+of+Clostridium+difficile+from+an+environmental+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface.</a> J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).</li>
<li>Koch, C. J., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+oxygen+from+polystyrene+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">The release of oxygen from polystyrene Petri dishes.</a> Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).</li>
<li>Ethapa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+modulate+biofilm+formation+by+the+anaerobic+pathogen+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile.</a> J. Bacteriol. , (2012).</li>
<li>Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic cell culture.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).</li>
<li>Lyras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin+B+is+essential+for+virulence+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile.</a> Nature. 458, 1176-1179 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisane tutaj metody pozwalają na proste i szybkie odzyskanie C. difficile z różnych próbek kału, w tym ludzi, myszy i chomików, a także na długotrwałe przechowywanie C. difficile w postaci glicerolu lub zapasów zarodników. C. difficile może być organizmem trudnym w uprawie, ale staranne utrzymanie środowiska beztlenowego i stosowanie technik aseptycznych może zapewnić silny wzrost i zmniejszenie zanieczyszczenia.
Komory beztlenowe: uwagi i konserwacja
<p class="jov...

Clostridium difficile to Gram-dodatnia, przetrwalnikowa bakteria, która jest obowiązkowym beztlenowcem i potencjalnie śmiertelnym patogenem przewodu pokarmowego dla ludzi i zwierząt. Początkowo opisany w 1935 roku jako organizm komensalny znaleziony w próbkach kału od noworodków1, później wykazano, że C. difficile jest czynnikiem sprawczym rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego związanego z leczeniem antybiotykami2. Zakażenia C. difficile (CDI) są zwykle poprzedzone antybiotykoterapią, która powoduje zakłócenie normalnej flory okrężnicy, tworząc niszę dla rozwoju C. difficile 2. C. difficile jest przenoszony jako uśpiony zarodnik drogą fekalno-oralną, a następnie kiełkuje w przewodzie pokarmowym, wytwarzając komórki wegetatywne zdolne do wytwarzania kilku toksyn i powodując ciężką chorobę i zapalenie jelita grubego3. CDI są często oporne na konwencjonalne metody leczenia, a infekcje te często nawracają4. W rezultacie, CDI są odpowiedzialne za do 4,8 miliarda dolarów kosztów opieki zdrowotnej w Stanach Zjednoczonych5-7.	
	C. Difficile jest bardzo wrażliwy nawet na niski poziom tlenu w środowisku. Aby C. difficile przetrwała w środowisku i mogła być skutecznie przenoszona z gospodarza na żywiciela, kluczowe znaczenie ma utworzenie metabolicznie nieaktywnych zarodników8. Ponieważ laboratoryjne utrzymanie i manipulowanie C. difficile wymaga kontrolowanego, beztlenowego środowiska, techniki te wymagają użycia komory beztlenowej. Zastosowanie komór beztlenowych doprowadziło do zwiększonego odzysku i izolacji obligatoryjnych beztlenowców9-11 oraz umożliwiło przeprowadzenie szeregu technik molekularnych w atmosferze beztlenowej.	
	Oprócz C. difficile, opisane tutaj użytkowanie i utrzymanie w komorze beztlenowej mają zastosowanie do innych obligatoryjnych beztlenowców, takich jak inne gatunki Clostridium (np. C. perfringens), inne gatunki przewodu pokarmowego (np. gatunki Bacteroides 12) i patogeny przyzębia (np. gatunki Peptostreptococcus 13).

<table><tbody><tr><td>Pepton proteozy nr 2</td><td>BD</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (bezwodny)</td><td>Fisher</td><td>M65</td><td></td></tr><tr><td>á'...-Fruktoza</td><td>Fisher</td><td>L96</td><td></td></tr><tr><td>Taulocholan sodu</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td></td></tr><tr><td>á'...-cykloseryna</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Cefoksytyna</td><td>Fluka</td><td>C4786</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do naparu serca mózgu</td><td>BD</td><td>237300</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>proteozy BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Agar z krwią owiec kolumbijskich</td><td>Fisher</td><td>L21928</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP2291</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pętle inokulacyjne</td><td>Fisher</td><td>22363596</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne waciki</td><td>Fisher</td><td>1495990</td><td></td></tr><tr><td>Coy Vinyl Anaerob Chamber i akcesoria</td><td>Coy Laboratory Products, Inc</td><td>Określony przez klienta</td><td>Te elementy są zamawiane na zamówienie według potrzeb</td></tr><tr> laboratorium<td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td colspan="4">TCCFA agar Pepton proteozy nr 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (bezwodny) 0,1 g Fruktoza 6 g Agar 20 g Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i autoklawować w temperaturze 121 stopni; C przez 20 minut do sterylizacji. Po autoklawowaniu dodaj: 10 ml 10% (w/v) taurocholanu sodu, sterylizowanego filtrem (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe 0,1%) 25 ml 10 mg/ml á'...-cykloseryny, sterylizowanej filtrem (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 250 &mu; g/ml) 1,6 ml 10 mg/ml cefoksytyny, sterylizowanej filtrem (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 16 &mu; g/ml) BHIS Medium Napar z mózgu serca 37 g Ekstrakt drożdżowy 5 g Na talerze dodaj 15 g agaru. Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i przelać do autoklawu w temperaturze 121 °; C przez 20 minut do sterylizacji. Opcjonalnie (dodać po autoklawowaniu): 3 ml 10% (w/v) L-cysteiny (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 0,03%) 10 ml 10% (w/v) taurocholanu sodu (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 0,1%) <silny>SMC Pożywka zarodnikowa</mocna> Bactopeptone 90 g Pepton proteazy 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1,5 g Agar 15 g Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i autoklawować w temperaturze 121 &deg; C przez 20 minut do sterylizacji. Opcjonalnie (dodać po autoklawowaniu): 3 ml 10% (w/v) L-cysteiny (rozpuścić w wodzie; stężenie końcowe, 0,03%) 70:30 Medium Bactopeptone 63 g Pepton proteazy 3,5 g Napar z mózgu serca 11,1 g Ekstrakt drożdżowy 1,5 g (NH4)2SO4 0,7 g Tris base 1,06 g Na talerze dodaj 15 g agaru. Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i przelać do autoklawu w temperaturze 121 °; C przez 20 minut do sterylizacji. Po autoklawowaniu dodać 3 ml 10% (w/v) L-cysteiny (stężenie końcowe, 0,03%). Blood agar Zaleca się stosowanie gotowych beztlenowych płytek agarowych z krwią owczą Columbia (Fisher Scientific, L21928)35. 1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) NaCl 8,01 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,27 g Doprowadzić do 1 l wodą dejonizowaną i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl. Filtr Sterylizować przed użyciem.</td></tr></tbody></table>

hodowla i utrzymanie clostridium difficile w środowisku beztlenowym

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile to Gram-dodatnia, beztlenowa, sporogenna bakteria, która jest przede wszystkim odpowiedzialna za biegunkę antybiotykową (AAD) i jest znaczącym patogenem szpitalnym. C. Difficile jest niezwykle trudny do wyizolowania i uprawy i jest niezwykle wrażliwy nawet na niski poziom tlenu w środowisku. W tym miejscu przedstawiono metody izolowania C. difficile z próbek kału, a następnie hodowli C. difficile w celu przygotowania zapasów glicerolu do długotrwałego przechowywania. Opisano również techniki przygotowywania i liczenia stad zarodników w laboratorium do różnych dalszych zastosowań, w tym mikroskopii i badań na zwierzętach. Techniki te wymagają komory beztlenowej, która utrzymuje stałe środowisko beztlenowe, aby zapewnić odpowiednie warunki dla optymalnego C. trudny wzrost. Zapewniamy protokoły przenoszenia materiałów do i z komory bez powodowania znacznego zanieczyszczenia tlenem wraz z sugestiami dotyczącymi regularnej konserwacji wymaganej do utrzymania odpowiedniego środowiska beztlenowego dla wydajnego i spójnego C. Uprawa difficile.

Przykład C. difficile wyhodowanego na podłożach BHIS oraz beztlenowym agarze Columbia z krwią owczą przedstawiono na Rysunku 2. C. difficile tworzy nieregularne, płaskie kolonie o wyglądzie przypominającym szkło matowe, co jest widoczne na obu podłożach. Tutaj wrażliwy na erytromycynę izolat kliniczny C. difficile, 630E30, został wyhodowany na agarze BHIS, wzbogaconą pożywce nie selektywnej, przez 24 hr w 37 °C (Rysunek 2A). Kolonie na beztlenowym ag...

Clostridium difficile to bakteria chorobologiczna, która jest ściśle beztlenowca i powoduje biegunkę związaną z antybiotykami (AAD). Opisano tu metody izolacji, hodowli i utrzymania komórek wegetatywnych i zarodników C. difficile. Techniki te wymagają komory beztlenowej, która wymaga regularnej konserwacji w celu zapewnienia odpowiednich warunków do optymalnej uprawy C. difficile.

Hodowla i utrzymanie Clostridium difficile w środowisku beztlenowym

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie C. difficile z próbek kału w celu hodowli C. difficile do przygotowania zapasów w glicerolu do długoterminowego przechowywania oraz przygotowanie i zliczenie zapasów przetrwalników do różnych zastosowań analitycznych. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację C. difficile z próbek kału za pomocą wysiewu na podłoże selektywne. Drugim krokiem jest hodowla C. difficile w podłożu płynnym oraz utrzymywanie długoterminowych zapasów C. difficile w glicerolu.Następnie C difficile jest pobierana z zamrożonych zapasów w glicerolu i wysiewana na płytki agarowe. W ostatnim kroku, zgodnie z poniższymi protokołami, przygotowywane są i mianowane zapasy przetrwalników C difficile. C difficile może być hodowana na różnych pożywkach w celu weryfikacji i potwierdzenia jej tożsamości, a także w celu skutecznego namnażania i utrzymywania kultury.Te stokiki glicerynowe oraz kultury mogą być dalej wykorzystywane w licznych aplikacjach następczych, w tym w badaniach na zwierzętach oraz dodatkowych badaniach z zakresu biologii molekularnej. Główną zaletą wykorzystania winylowej komory anaerobowej do hodowli c difficile w porównaniu z innymi metodami, takimi jak słoiki świecowe, jest możliwość utrzymania rygorystycznie beztlenowego środowiska, co pozwala na spójny i niezawodny wzrost c difficile. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi technikami mogą napotkać trudności wynikające z ograniczonej sprawności manualnej wewnątrz komory spowodowanej rękawicami, a także z krytycznej potrzeby planowania eksperymentów z wyprzedzeniem.Procedury te zaprezentuje technik z mojego laboratorium, Jose Suarez In. Procedurę tę można przeprowadzić w warunkach tlenowych. W pierwszej kolejności należy zważyć próbkę kału.Jest to niezbędne do wyliczenia liczby c difficile w kale. Następnie zawiesić próbkę kału w 1 XPBS i wymieszać w wirówce vortex, aby upewnić się, że próbka kału została całkowicie resuspendowana. Następnie wykonać rozcieńczenia seryjne resuspendowanej próbki kału w 1 XPBS w celu odpowiedniej izolacji lub wyliczenia jednostek tworzących kolonie lub CFU na gram kału w dalszych etapach.Procedurę należy przeprowadzić w warunkach beztlenowych, aby upewnić się, że komórki wegetatywne C difficile nie są narażone na działanie tlenu. Komora beztlenowa użyta w tym eksperymencie jest utrzymywana w temperaturze 37 °C. Należy stosować techniki aseptyczne.Nanieś 100 µL każdego rozcieńczenia seryjnego na płytki z agarem Toro collate oxetane, cyclo Seine, fructose agar lub T-C-C-F-A. Płytki te były wstępnie redukowane przez co najmniej jedną do dwóch godzin w komorze beztlenowej, aby zapewnić usunięcie resztkowego tlenu. Pozwoli to na wyizolowanie kolonii do dokładnego przeliczenia lub do innych dalszych zastosowań.Za pomocą sterylnej pętli do szczepienia równomiernie rozprowadź naniesioną kulturę na powierzchni płytki T-C-C-F-A. Inkubuj płytki beztlenowo przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Po upływie 48 godzin zidentyfikuj kolonie c difficile na podstawie ich płaskiego, nieregularnego wyglądu przypominającego szkło matowe, aby upewnić się, że wegetatywne formy c difficile nie zostały zniszczone przez kontakt z tlenem.Szalki do izolowania kolonii na potrzeby dalszych zastosowań muszą być przez cały czas przechowywane w komorze beztlenowej. W przypadku enumeracji kolonii szalki można wyjąć z komory beztlenowej. Należy pamiętać, że po wyjęciu szalki z komory wegetatywne formy c difficile zostaną wystawione na działanie tlenu i zginą.Tych kolonii C difficile nie można odzyskać, nawet jeśli płytka zostanie zwrócona do komory. Należy policzyć kolonie C difficile dla każdego rozcieńczenia i obliczyć liczbę CFU na gram próbki kału, aby przeprowadzić hodowlę i przygotować zapasy glicerolowe C difficile. Za pomocą sterylnej pętli szczepiącej należy pobrać pojedynczą kolonię i wysiać ją na podłoże pre-reduced brain heart infusion.Na płytkę z agarem BHIS uzupełnionym ekstraktem drożdżowym lub cysteiną 0,03% należy wysiać pojedyncze kolonie metodą rozchodzenia w kwadrantach, używając nowej sterylnej pętli do każdego kwadrantu. Płytki inkubować beztlenowo w temperaturze 37°C przez 16 do 24 godzin. Po pojawieniu się odizolowanych kolonii na płytkach z agarem BHIS, należy pobrać pojedynczą odizolowaną kolonię i zawiesić ją w 10 ml uprzednio zredukowanego płynnego medium BHIS uzupełnionego cysteiną 0,03%, a następnie inkubować przez noc.Tlenowo w temperaturze 37 °C lub do momentu zmętnienia hodowli. Następnego dnia należy przenieść 333 µl 50% glicerolu oraz 666 µl hodowli C. difficile do probówki kriogenicznej o pojemności 1,8 ml. Aby przygotować zapas izolowanego szczepu w 15% glicerolu, należy szczelnie zakręcić probówkę kriogeniczną i wymieszać zawartość.Następnie należy niezwłocznie wyjąć stok z komory beztlenowej i umieścić go w zamrażarce w temperaturze -80 °C do długoterminowego przechowywania. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyjąć zamrożony stok glicerolowy c difficile z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Aby zapobiec rozmrożeniu.Zamrożony stok glicerolowy należy natychmiast umieścić w statywie chłodzącym, który przed użyciem był przechowywany w temperaturze -80 °C. Przenieść zamrożony stok glicerolowy w statywie chłodzącym do komory beztlenowej, stosując technikę aseptyczną i sterylną pętlę do szczepienia. Nanieść niewielką ilość stoku na płytkę i wykonać posiew w jednym kwadrancie płytki.Obrócić płytkę o 90 stopni i za pomocą nowej sterylnej pętli do posiewu wykonać posiew w drugim kwadrancie. Powtórzyć czynność dla trzeciego i czwartego kwadrantu, aby zapewnić izolację pojedynczych kolonii. Natychmiast wyjąć zamrożony stok glicerolowy z komory beztlenowej i przenieść go z powrotem do zamrażarki w temperaturze -80 °C.Inkubować płytkę beztlenowo przez noc w temperaturze 37°C, aby oczyścić przetrwalniki z hodowli c difficile. Szczepy z mrożonych zapasów glicerolowych przenieść na wstępnie zredukowane płytki BHIS, postępując zgodnie z procedurą przedstawioną w poprzednim segmencie.Inkubować beztlenowo przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia wyizolować pojedyncze kolonie na kilka przedredukowanych płytek z agarem 70 30. Inkubować beztlenowo w temperaturze 37 °C przez 24 do 48 godzin.Po utworzeniu się przetrwalników wyjmij płytki z komory beztlenowej. Zeskrob zawartość płytek za pomocą sterylnej pętli do szczepienia i resuspenduj komórki w 10 mililitrach sterylnego 1x PBS. Płytki wyrzuć, a komórki sypiecie w wirówce przy 3000 G przez 15 minut.Usunąć nadosad, dodać 1 mL zawiesiny w 1xPBS, zawiesić i ponownie odwirować w ten sam sposób. Przemyć komórki dwukrotnie w PBS, inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, aby wspomóc lizę komórek wegetatywnych i matecznych następnego dnia, a następnie inkubować w temperaturze 70 °C przez 20 minut w celu zniszczenia wszelkich pozostałych komórek wegetatywnych. Aby określić liczbę CFU na mililitr, wykonać rozcieńczenia seryjne każdego preparatu zarodników w 1xPBS i wysiać na podłoże BHIS z dodatkiem 0,1% taurocholanu sodu w warunkach redukcyjnych; płytki inkubować w temperaturze 37 °C przez minimum 24 godziny przed przeliczeniem kolonii.Zarodniki można przechowywać w roztworze XPBS w temperaturze pokojowej w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku przechowywania długoterminowego. A. Tutaj przedstawiono przykład wzrostu C. difficile na podłożu BHIS oraz beztlenowym agarze z krwią owczą Columbia.C difficile tworzy nieregularne kolonie, które są płaskie i mają wygląd szkła matowego, co jest widoczne na obu podłożach. Panel A przedstawia wrażliwy na erytromycynę izolat kliniczny C difficile 630 E wyhodowany przez 24 godziny na agarze BHIS, który jest wzbogaconym podłożem nieselektywnym. W temperaturze 37°C kolonie na beztlenowym agarze krwi owczej Columbia, pokazane w panelu B, wyglądają podobnie do tych wyhodowanych na BHIS w świetle białym.Jednakże zastosowanie tego podłoża umożliwia również wykrycie zielonkawego lub cytrynowego fluorescencji wykazywanej przez C difficile w świetle ultrafioletowym o długiej fali, co pokazano w panelu C po przeprowadzeniu tej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania z zakresu biologii molekularnej można zastosować inne metody, takie jak krzywe wzrostu w medium płynnym, analiza DNA i RNA, izolacja kolonii, PCR oraz inne techniki biologii molekularnej i manipulacje odpowiednie dla C difficile, a także wykorzystanie przetrwalników C difficile w badaniach na zwierzętach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować, hodować i utrzymywać komórki wegetatywne oraz przetrwalniki C difficile w środowisku beztlenowym.Należy pamiętać, że C. difficile jest patogenem ludzkim i zwierzęcym, który może wywoływać choroby układu pokarmowego. Eksperymenty z C. difficile muszą być przeprowadzane w odpowiednich warunkach poziomu biosafety level two.

culturing-maintaining-clostridium-difficile-an-anaerobic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kultywowanie i utrzymywanie Clostridium difficile w środowisku beztlenowym

Źródło: Li, J., et al., Opracowanie modelu infekcji larwalnego danio pręgowanego dla Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje izolację i hodowlę bakterii Clostridioides difficile z jelita larw danio pręgowanego. Zakażone jelito jest preparowane, homogenizowane i inkubowane w selektywnych pożywkach beztlenowych zawierających antybiotyki. Warunki te hamują konkurencyjne drobnoustroje i sprzyjają wzrostowi żywotnych komórek.

Izolacja i hodowla bakterii Clostridioides difficile z jelita larwalnego danio pręgowanego

Źródło: Anwar, Z., et al. Wzbogacanie i wykrywanie toksyn Clostridium perfringens w detalicznych próbkach żywności. J. Vis. Exp. (2019).W tym filmie bakterie redukujące siarczyny są hodowane w pożywce agarowej zawierającej siarczyny, gdzie rosną beztlenowo i redukują siarczyn do siarkowodoru, tworząc czarne osady z jonami żelaza. Czarne kolonie są izolowane z głębokości agaru przy użyciu technik aseptycznych i przenoszone do świeżej pożywki w celu kontynuacji inkubacji beztlenowej.

Hodowla bakterii beztlenowych redukujących siarczyny z kultury agarowej

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Skuteczność antybiotyku jest najczęściej określana poprzez przeprowadzanie badań kinetycznych zabijania i pomiar jednostek tworzących kolonie (CFU). Integrując skaningową mikroskopię elektronową (SEM) z tymi standardowymi metodami, możemy rozróżnić efekty farmakologiczne leczenia między różnymi antybiotykami.

Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

Ponieważ organizmy beztlenowe nie są w stanie rosnąć po ekspozycji na tlen, niezbędne jest stosowanie technik hodowli beztlenowej. W tym miejscu demonstrujemy prostą i skuteczną metodę uprawy mieszanej kultury pochodzącej z biogazowni, od przygotowania pożywki do ilościowego oznaczania gazu i lotnych kwasów tłuszczowych.

Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych

Tematem tego artykułu jest szczegółowe opisanie najlepszych praktyk tworzenia pożywek dla wymagających mikroorganizmów beztlenowych pozyskanych ze środowiska. Metody te pomagają w zarządzaniu kulturami beztlenowymi i mogą być stosowane do wspomagania wzrostu nieuchwytnych mikroorganizmów niehodowlanych, "mikrobiologicznej ciemnej materii".

Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku

Protokół przedstawia dwie metodologie poprawy izolacji beztlenowych bakterii jelitowych. Pierwszy z nich koncentruje się na izolacji różnych bakterii przy użyciu różnych pożywek hodowlanych. Drugi koncentruje się na etapach uprawy określonej grupy drobnoustrojów, ewentualnie asymilując mio-inozytol, aby w pełni zrozumieć jego znaczenie ekologiczne.

Strategie mające na celu poprawę hodowli bakterii beztlenowych z przewodu pokarmowego kurczaka

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Poznaj metody izolacji i hodowli Clostridium difficile w warunkach beztlenowych. Naucz się przygotowywać stoki glicerolowe oraz sporowe do długoterminowego przechowywania tego patogennego bakterii.

Hodowla i utrzymanie Clostridium difficile w środowisku beztlenowym

Przeglądaj więcej filmów