Badanie oddziaływań Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie wpływu gronkowcowego fenolu, rozpuszczalnej modliny lub PSM na ludzkie neutrofile. Osiąga się to poprzez wyizolowanie neutrofili z ludzkiej krwi w celu późniejszej analizy in vitro. Następnie neutrofile są albo ładowane barwnikiem fluorescencyjnym i mieszane z serią stężeń PSM z inhibitorami i bez, albo pozwala się im fagocytozy bakterii S reus zawierających konstrukt reporterowy promotora PSM alfa GFP.

Ostatecznie aktywacja neutrofili przez stymulację PSM może być monitorowana za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji GFP przez fagocytozę. Bakterie można analizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej Tą metodą. Możesz badać działanie gronkowców, fenylu, soi, molinów lub neutrofili.

Oczywiście metodę tę można zastosować do wielu innych typów komórek, bodźców i antagonistów. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł mikroskopowej części tej metody, gdy omawialiśmy sposób obserwacji wpływu PSM wewnątrz neutrofili. Użycie bakteryjnego konstruktu ekspresji GFP i mikroskopii poklatkowej pozwala nam to zrobić.

Po pobraniu pięciu probówek heparynizowanej krwi żylnej, wlej 12 mililitrów roztworu fial o gęstości 1,119 grama na mililitr do probówki o 50 mililitrach, a następnie ostrożnie nałóż 10 mililitrów roztworu FI o gęstości 1,077 grama na mililitr. Następnie rozcieńczyć krew równą objętością PBS i ostrożnie nałożyć od 20 do 25 mililitrów krwi na każdy dwuwarstwowy gradient ficall. Wirować gradienty przez 20 minut w temperaturze 396 razy G i 22 stopnie Celsjusza bez łamania.

Następnie użyj pompy próżniowej wyposażonej w sterylną końcówkę pipety, aby zassać górne warstwy żółtego osocza i PBMC. A potem trzecia biała warstwa. Teraz użyj małej plastikowej pipety, aby przenieść wielojądrzaste neutrofile lub frakcję PMN z każdej probówki do nowej 50-mililitrowej probówki.

Dodaj do każdej probówki świeżo przygotowany, wstępnie schłodzony nasz PMI uzupełniony albuminą ludzkiej surowicy lub R-P-M-I-H-S-A, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 mililitrów. Następnie odwiruj komórki, odessaj supernatant za pomocą pompy próżniowej i delikatnie zawiruj czerwony erytrocyt i osad zawierający PMN. Następnie dodaj dziewięć mililitrów sterylnej wody dejonizowanej do komórek i uruchom minutnik.

Dodaj dokładnie 30 sekund. Dodaj jeden mililitr 10-krotnie stężonego PBS, aby zatrzymać wstrząs hiperosmotyczny. Następnie umyj komórki w łącznej objętości 50 mililitrów zimnego R-P-M-I-H-S-A.

Po usunięciu supernatantu dodaj jeden mililitr R-P-M-I-H-S-A do każdego podniebienia, które jest teraz białe z powodu lizy erytrocytów. Następnie zregeneruj, zawiesić przez pipetowanie i połącz granulki w jednej probówce. Teraz policz komórki i dostosuj stężenie do jednego razy 10 do siódmych komórek na mililitr.

Teraz załaduj pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr dwiema grypami mikromolowymi oh 3:00 AM w R-P-M-I-H-S-A. I przykryj rurkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Następnie inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze pod mieszaniem.

W międzyczasie należy przygotować trzykrotne seryjne rozcieńczenie bodźca przy 10-krotnym stężeniu końcowym. Następnie wstępnie inkubować 30 mikrolitrów bodźca z równą objętością świeżo przygotowanego 10-krotnie stężonego inhibitora lub buforu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki w 10 mililitrach R-P-M-I-H-S-A i ponownie zawieś komórki w świeżym R-P-M-I-H-S-A w ilości pięć razy od 10 do szóstej komórki na mililitr.

Tuż przed analizą przepływu rozcieńczyć komórki dwa razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w R-P-M-I-H-S-A i dodać 200 mikrolitrów komórek na rurkę faksową. Uważając, aby nie aktywować komórek przez potrząsanie lub pipetowanie, załaduj pierwszą probówkę na cytometrze przepływowym. Odczekaj trzy sekundy, a następnie rozpocznij akwizycję po ustalonym czasie, na przykład ośmiu sekundach, zdejmij probówkę i szybko dodaj do próbki 50 mikrolitrów najniższego rozcieńczenia bodźca.

Natychmiast załaduj rurkę i kontynuuj akwizycję. Po zakończeniu serii rozcieńczeń przemyć igłę cytometru przepływowego świeżym R-P-M-I-H-S-A przed pomiarem nowej serii. Po uruchomieniu ostatniej próbki przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, aby przeanalizować ekspresję GFP bakterii.

Po fagocytozie PMN wyhoduj szczep S ous zawierający interesujący nas konstrukt reporterowy przez noc w bulionie, usuń GFP wyrażony podczas hodowli przez noc, rozcieńczając komórki do OD 6 60 0 0,01. Wyhoduj kulturę do OD 6 60 0 0,1. Rozcieńczyć komórki od 1 do 30, a następnie monitorować wzrost, aż kultura ponownie osiągnie OD 60 0,1.

Następnie zbierz bakterie przez odwirowanie. Umyj komórki raz w DPBS i Resus. Zawieś kulturę.

Dodaj jeden do 10 oryginalnej objętości, aby uzyskać OD sześć 60 1,0 lub mniej więcej pięć razy 10 do ósmej CFU na mililitr. Teraz wymieszaj bakterie ze świeżo wyizolowanym PNS w R-P-M-I-H-S-A w stosunku 10 do jednego. Następnie dodać zebraną surowicę ludzką do jednej dziesiątej całkowitej objętości końcowej połączonej surowicy ludzkiej w roztworze komórkowym.

Stymuluj fagocytozę, potrząsając mieszaniną komórek przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie rozcieńczyć bakterie załadowane PMN do pięć razy od 10 do piątej komórki na mililitr i przenieść 250 mikrolitrów komórek do każdej studzienki ośmiokomorowego szkiełka nakrywkowego. Na koniec zobrazuj komórki na odwróconym mikroskopie wyposażonym w obiektyw 40x i zamkniętym w komorze ciemnego środowiska i uzyskuj obrazy w wielu miejscach w komorach szkiełek nakrywkowych co pięć do 10 minut zarówno w jasnym polu, jak i kanale GFP, aby śledzić produkcję bakteryjnego GFP w czasie rzeczywistym, inkubacja neutrofili z serią stężeń syntetycznego PSM alfa trzy powoduje zależną od dawki szybką aktywację komórki mierzone strumieniem wapnia.

Wstępna inkubacja peptydu PSM alfa three z 0,01%0,1% lub 1% surowicą ludzką znacząco hamowała zdolność bodźca do wywoływania odpowiedzi wapniowej. Ponownie w sposób zależny od dawki w 1% surowicy. Prawie żadna aktywacja nie jest widoczna przy tych stężeniach PSM alfa trzy.

Na tych obrazach pokazano dwa neutrofile zawierające bakterie fagocytozy zawierające konstrukt reporterowy A PSM alfa GFP. Bakterie zaczynają fluoryzować około godziny po fagocytozie, co wskazuje na ekspresję GFP z promotora PSM Alpha. Bakterie na zewnątrz neutrofili nie fluoryzują, co wskazuje, że ekspresja PSM alfa jest szybko włączana tylko wtedy, gdy bakterie są fagocytozy.

Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, aby zawsze używać świeżych neutrofili w celu uzyskania optymalnych wyników. Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak mierzyć strumień wapnia za pomocą cytometrii przepływowej i jak mierzyć ekspresję genów bakteryjnych w komórkach eukariotycznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.