Name: Badanie oddziaływań Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę badania aktywacji neutrofilów przez PSM z Staphylococcus aureus przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala analizować odpowiedź immunologiczną in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RN został częściowo sfinansowany z Europejskiego Grantu na Reintegrację (ERG) Marie Curie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej, numer projektu 268324.

1. Izolacja PMN z ludzkiej krwi przez wirowanie gęstości
<ol>
 <li>Pobierz 5 probówek po 9 ml heparynizowanej krwi żylnej.</li>
 <li>Przygotować dwuwarstwowe gradienty Ficoll (4 gradienty na 5 probówek krwi) w następujący sposób: Wlać 12 ml roztworu fikolu o gęstości 1,119 g/ml do probówki o pojemności 50 ml i ostrożnie nałożyć na wierzch 10 ml roztworu fikolu o gęstości 1,077 g/ml.</li>
 <li>Rozcieńczyć krew równą objętością PBS.</li>
 <li>Rozcieńczoną krew należy ostrożnie nałożyć na dwuwarstwowy gradient Ficoll; 20-25 ml na gradient.</li>
 <li>Wirować 20 min przy 396 x g w obracającym się wirniku kubełkowym, 22 °C bez hamowania.</li>
 <li>Przygotuj zimny RPMI zawierający 0,05% albuminy ludzkiej surowicy (RPMI-HSA). Przygotuj również 9 ml sterylnego dejonizowanegoH2O. Wstępnie schłodzić zarówno RPMI, jak iH2Ona lodzie.</li>
 <li>Za pomocą pompy próżniowej odessać górną warstwę Ficollu zawierającą osocze (o barwie żółtej) i PBMC oraz drugą warstwę Ficollu (o barwie białej) (na pipetę nałożyć sterylną końcówkę pipety).</li>
 <li>Zebrać PMN do probówek o pojemności 50 ml za pomocą małej plastikowej pipety (1 probówka na frakcje PMN na każde 2 gradienty) i umieścić je na lodzie.</li>
 <li>Dodać zimny RPMI-HSA do całkowitej objętości 50 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 249 x g w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Zdjąć supernatant za pomocą pompy próżniowej i delikatnie wymieszać osad (erytrocyty i PMN).</li>
 <li>Dodaj 9 ml sterylnego dejonizowanegoH2Oi uruchom stoper. Zatrzymaj wstrząs hiperosmotyczny dokładnie po 30 sekundach, dodając 1 ml 10-krotnie stężonego PBS. Uwaga: 30 sekund jest bardzo krytyczne.</li>
 <li>Dodać zimny RPMI-HSA do całkowitej objętości 50 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 249 x g w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Zdjąć supernatant za pomocą pompy próżniowej i zebrać granulat PMN do 1 probówki o określonej objętości (1-2 ml) RPMI-HSA.</li>
 <li>Określ ilość komórek i dostosuj stężenie do 1,107 komórek/ml. W zależności od dawcy, wydajność izolowanych PMN będzie wynosić od 5 x 10 6 do 3 x 107 PMN z każdej probówki krwi o pojemności 9 ml</li>
</ol>
2. Test cytometrii przepływowej do oceny mobilizacji wapnia w ludzkich PMN
<ol>
 <li>Załaduj ogniwa (5 x 106 komórek/ml) 2 μM Fluo-3-AM w RPMI-HSA i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, kołysząc się powoli, używając na przykład wytrząsarki z platformą kołyszącą, chronioną przed światłem.</li>
 <li>W międzyczasie należy przygotować seryjne rozcieńczenie (np. 3-krotne) bodźca o stężeniu 10-krotnym od końcowego. W tym protokole używany jest PSMα3; jednak każdy bodziec GPCR, który działa na neutrofile, jest odpowiedni.</li>
 <li>Przygotuj 10x skoncentrowany inhibitor receptora w RPMI-HSA. Gdy inhibitor działa na bodziec (np. HDL na PSMα3), należy wstępnie inkubować 25 μl bodźca z równą objętością inhibitora przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Umyj komórki, dodając 10 ml RPMI-HSA i odwiruj przez 249 x g w temperaturze pokojowej. Ponownie zawieś komórki na 5 x 106 komórek/ml.</li>
 <li>Tuż przed eksperymentem rozcieńczyć komórki do 2x106 komórek/ml w RPMI-HSA i dodać 200 μl komórek na probówkę FACS. Rozcieńczone PMN są bardzo delikatne. Utrzymywanie ich zbyt długo w tym stężeniu doprowadzi do automatycznej aktywacji; To samo dotyczy energicznego potrząsania lub pipetowania.</li>
 <li>Podłącz rurkę do cytometru przepływowego, odczekaj 3 sekundy i rozpocznij akwizycję. Po upływie określonego czasu (np. 8 sekund) zdjąć probówkę i szybko dodać do próbki 50 μl bodźca. Natychmiast ponownie przymocuj probówkę do uchwytu próbki i kontynuuj akwizycję.</li>
 <li>Zacznij od najniższego i skończ na najwyższym stężeniu bodźca. Regularnie myj igłę cytometru przepływowego po każdym uruchomieniu za pomocą RPMI-HSA.</li>
 <li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. Porównać średni sygnał fluorescencji przed dodaniem bodźca z sygnałem po dodaniu bodźca i użyć odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych do obliczenia siły aktywacji dla każdego mierzonego rozcieńczenia.</li>
</ol>
Alternatywnie, gdy inhibitor działa na receptor, wstępnie inkubuj komórki z inhibitorem.
3. Analiza mikroskopii fluorescencyjnej ekspresji GFP bakterii po fagocytozie za pomocą PMN
<ol>
 <li>Hoduj szczepy S. aureus zawierające interesujący konstrukt reporterowy przez noc w bulionie (z antybiotykami, jeśli jest to wymagane do utrzymania plazmidu reporterowego). W tym przypadku stosuje się szczep MW2 zawierający konstrukt reporterowy PSMα GFP 10, wyhodowany w 50 ml plastikowej probówce z 5 ml pożywki hodowlanej LB.</li>
 <li>Aby usunąć całą GFP z ekspresji O/N, rozcieńczyć kultury do OD660 0,01 i wyhodować do OD660 0,1. Ponownie rozcieńcz tę kulturę 1:30 i monitoruj wzrost, aż kultura osiągnie OD660 0,1. Zebrać bakterie przez odwirowanie i umyć raz w DPBS. Zawiesić ponownie w stosunku 1:10 pierwotnej objętości, aby uzyskać OD660 1,0 lub około 5,108 jtk/ml.</li>
 <li>Wymieszać bakterie (1,107/ml) ze świeżo wyizolowanymi PMN (1,106/ml) w RPMI-HSA (stosunek 10:1) w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i dodać zbiorczą surowicę ludzką do końcowego stężenia 10%. Wstrząsać na platformie wstrząsającej przez 10 minut w temperaturze 37 °C w celu pobudzenia fagocytozy. Rozcieńczyć PMN wypełnione bakteriami do 5,105 PMN/ml i odpipetować 250 μl do studzienki z 8-komorowym szkiełkiem nakrywkowym.</li>
 <li>Zobrazuj PMN z bakteriami pod mikroskopem. Mikroskop odwrócony wyposażony w obiektyw 40X/0,85 NA działa dobrze i powinien być zamknięty w komorze ciemnego środowiska, aby utrzymać środowisko stabilnie na poziomie 37 °C. Uzyskuj obrazy dla kilku wstępnie ustawionych pozycji za pomocą kamery co 5-10 minut zarówno w jasnym polu, jak i w kanale GFP, aby śledzić produkcję GFP w czasie.</li>
</ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W opisanych tutaj metodach niektóre kroki są bardzo krytyczne. Podkreślimy je tutaj.
W przypadku izolacji neutrofili przez wirowanie w gradiacji gęstości ważne jest, aby nie naruszać warstw w trakcie lub po etapach wirowania. Podczas zasysania neutrofili za pomocą plastikowej pipety należy uważać, aby nie ściskać balonu w warstwie komórek, ponieważ wyrzucenie cieczy naruszy warstwy. Sprawdź również wzrokowo osady neutrofili po etapie szoku osmotycznego i wirowania. Jeśli osad jest nadal czerw...

Neutrofile (PMN) to profesjonalne fagocyty, które odgrywają kluczową rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej przeciwko Staphylococcus aureus 1. Ciągła walka między gospodarzem a mikrobem doprowadziła do wyścigu zbrojeń obu stron. Ostatnio pojawiły się szczepy S. aureus opornego na metycylinę (MRSA) związane ze społecznością (CA), które wydają się być bardzo skuteczne w obchodzeniu zabijania neutrofili 2,3. Nadmierna produkcja moduliny rozpuszczalnej w fenolu (PSM) CA-MRSA wiąże się z wyższą zjadliwością 4,5. Ludzkie neutrofile mogą rozpoznać te PSM za pomocą FPR2, co prowadzi do aktywacji tego receptora sprzężonego z białkiem G 6. Jednym z najwcześniejszych zdarzeń jest mobilizacja wewnątrzkomórkowych zapasów wapnia (Ca2+). Ca2+ działa jako wtórny przekaźnik dla różnych funkcji efektorowych PMN, w tym degranulacji i fagocytozy 7. Dlatego Ca2+ jest bardzo czułym wskaźnikiem funkcjonalnej zdolności PSM do aktywacji PMN. Aby zbadać wpływ PSM na neutrofile, świeże neutrofile są izolowane i ładowane barwnikiem, który fluoryzuje po mobilizacji wapnia. W eksperymencie cytometrii przepływowej można zmierzyć tę szybką mobilizację. Za pomocą tej metody można zbadać bezpośredni wpływ składników toksycznych i innych na neutrofile oraz określić najniższe stężenie, w którym są one aktywne. Dla nas jest to bardzo przydatne narzędzie do badania wpływu wielu białek wytwarzanych przez S. aureus zaangażowanych w unikanie odporności, takich jak białko hamujące FPR2 (FLIPr) 8, FLIPr-podobne 7 i białko hamujące chemotaksję Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Wykazano, że wszystkie te białka hamują mobilizację wapnia w neutrofilach poprzez wiązanie się z receptorem rozpoznającym agonistę.
Ostatnio nasza grupa opisała, że PSM są funkcjonalnie hamowane przez lipoproteiny w surowicy 10 . Te lipoproteiny są obficie obecne we krwi i tkance ludzkiej, co wskazuje, że PSM pełnią swoją funkcję przede wszystkim w środowisku wewnątrzkomórkowym. Dostępność testu mobilizacji wapnia pozwoliła nam na precyzyjny pomiar wpływu lipoprotein w surowicy na aktywację neutrofili przez PSM, na co wskazuje znaczne hamowanie przez bardzo niskie stężenia surowicy.
Ponieważ PSM są funkcjonalnie hamowane przez surowicę, postawiliśmy hipotezę, że istnieje ważna funkcja dla PSM jako toksyn wewnątrzkomórkowych. W związku z tym staraliśmy się określić rolę PSM po fagocytozie. Aby zbadać ekspresję PSM w przestrzeni międzykomórkowej, skonstruowaliśmy fuzje reporterowe promotora operonu psmα do GFP. Kiedy te reporterowe szczepy S. aureus były fagocytozowane przez neutrofile, indukcję ekspresji można było zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej 10. Oczywiście technika ta pozwala na badanie ekspresji dużej liczby genów w S. aureus lub innych patogenach po fagocytozie. Ponieważ dla S. aureus przetrwanie w niszy międzykomórkowej jest bardzo ważne dla pokonania wrodzonego układu odpornościowego11 10 12, badanie roli genów aktywowanych w tej niszy jest bardzo istotne dla zrozumienia jego zjadliwości.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Sondy molekularne / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>gęstość 1.077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>gęstość 1.119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>zawiera 25 mM HEPES i L-glutaminę</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems, Holandia</td><td>TCS SP5</td><td>obiektyw: HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>Bardzo ważne jest, aby rurkę można było wyjąć i wymienić podczas procesu pomiaru</td></tr></tbody></table>

badanie oddziaływań staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Prezentujemy metody badania wpływu modulin rozpuszczalnych w fenolu (PSM) i innych toksyn wytwarzanych i wydzielanych przez Staphylococcus aureus na neutrofile. Aby zbadać wpływ PSM na neutrofile, izolujemy świeże neutrofile za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. Te neutrofile są naładowane barwnikiem, który fluoryzuje po mobilizacji wapnia. Aktywacja neutrofili przez PSM inicjuje szybki i przejściowy wzrost stężenia wolnego wewnątrzkomórkowego wapnia. W eksperymencie cytometrii przepływowej tę szybką mobilizację można zmierzyć, monitorując fluorescencję wstępnie załadowanego barwnika, który reaguje na zwiększone stężenie wolnego Ca2+. Za pomocą tej metody możemy określić stężenie PSM niezbędne do aktywacji neutrofili oraz zmierzyć działanie specyficznych i ogólnych inhibitorów aktywacji neutrofili.	
	Aby zbadać ekspresję PSM w przestrzeni wewnątrzkomórkowej, skonstruowaliśmy fuzje reporterowe promotora operonu PSMα do GFP. Kiedy te reporterowe szczepy S. aureus są fagocytozowane przez neutrofile, indukcję ekspresji można zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza cytometryczna przepływowa w celu oceny mobilizacji wapnia w ludzkich PMN
Inkubacja neutrofili z serią stężeń syntetycznego PSMα3 prowadzi do szybkiej aktywacji mierzonej za pomocą przepływu jonów wapnia, co objawia się wzrostem sygnału w kanale FL-1. Wstępna inkubacja syntetycznego PSMα3 z 0,01%, 0,1% lub 1% ludzką surowicą znacząco zahamowała zdolność do wywoływania przepływów wapnia (Rycina 1).
Analiza ekspresji GFP w bakteriach po fagocytozie p...

Prezentujemy metody badania wpływu PSM i innych toksyn wydzielanych przez Staphylococcus aureus na neutrofile za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej.

Badanie oddziaływań Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie wpływu gronkowcowych fenolopodobnych peptydów rozpuszczalnych (PSMs) na ludzkie neutrofile. Cel ten osiąga się najpierw poprzez wyizolowanie neutrofili z ludzkiej krwi do późniejszej analizy in vitro. Następnie neutrofile są albo obciążane barwnikiem fluorescencyjnym i mieszane z serią stężeń PSMs z dodatkiem inhibitorów lub bez nich, albo poddawane fagocytozie bakterii S. aureus zawierających konstrukt reporterowy GFP pod promotorem PSM alpha.Ostatecznie aktywację neutrofili pod wpływem stymulacji PSM można monitorować za pomocą cytometrii przepływowej, a ekspresję GFP w fagocytowanych bakteriach można analizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metodą tą można badać wpływ staphylococcal phenylglycine alanine (PSM) na neutrofile.Oczywiście metoda ta może być zastosowana do wielu innych typów komórek, bodźców i antagonistów. Pomysł na część mikroskopową tej metody pojawił się podczas dyskusji nad sposobem obserwacji efektów działania PSM wewnątrz neutrofili. Zastosowanie bakteryjnej konstrukcji ekspresyjnej GFP oraz mikroskopii poklatkowej pozwala nam osiągnąć właśnie taki cel.Po pobraniu pięciu probówek heparynowanej krwi żylnej, wlać 12 mililitrów roztworu FiCall o gęstości 1,119 g/ml do probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie ostrożnie nałożyć 10 mililitrów roztworu FiCall o gęstości 1,077 g/ml. Następnie krew rozcieńczyć równą objętością PBS i ostrożnie nałożyć od 20 do 25 mililitrów krwi na każdy dwuwarstwowy gradient FiCall. Wirować gradienty przez 20 minut przy 396 ×g i 22 °C bez hamowania.Następnie należy użyć pompy próżniowej z założoną sterylną końcówką do pipety, aby odessać górną żółtą warstwę osocza oraz warstwę PBMC. Następnie odessać trzecią, białą warstwę. Teraz należy użyć małej plastikowej pipety, aby przenieść frakcję neutrofili polimorfonuclearnych (PMN) z każdej probówki do nowej probówki o pojemności 50 ml.Do każdej probówki dodaj świeżo przygotowane, schłodzone podłoże RPMI uzupełnione o albuminę surowicy ludzkiej (RPMI-HSA), tak aby uzyskać całkowitą objętość 50 ml. Następnie odwiruj komórki, odessij nadsącz za pomocą pompy próżniowej i delikatnie wymieszaj w wirówce (vortex) osad zawierający erytrocyty oraz granulocyty obojętnofilne (PMN). Następnie dodaj do komórek 9 ml sterylnej wody dejonizowanej i uruchom stoper.Odczekaj dokładnie 30 seconds. Dodaj jeden milliliter 10-krotnie stężonego PBS, aby zatrzymać szok hiperosmotyczny. Następnie przemyj komórki w całkowitej objętości 50 milliliters zimnego R-P-M-I-H-S-A.Po usunięciu supernatantu, dodaj jeden mililitr R-P-M-I-H-S-A do każdego wgłębienia, które jest teraz białe z powodu lizy erytrocytów. Następnie resuspenduj osad poprzez pipetowanie i połącz wszystkie osady w jednej probówce. Teraz policz komórki i dostosuj ich stężenie do 1 × 10⁷ komórek na mililitr.Następnie nanieś 5 × 10⁶ komórek/ml z 2 µM fluo-3 AM w pożywce RPMI-1640. Przykryj probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Następnie inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej przy mieszaniu.W międzyczasie przygotować trzykrotne rozcieńczenie seryjne stymulatora w stężeniu 10-krotnie przekraczającym stężenie końcowe. Następnie 30 µL stymulatora inkubować wstępnie z równą objętością świeżo przygotowanego, 10-krotnie skoncentrowanego inhibitora lub buforu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki przemyć w 10 mL R-P-M-I-H-S-A i resuspenderować w świeżym R-P-M-I-H-S-A w stężeniu 5 × 10⁶ komórek/mL.Bezpośrednio przed analizą przepływową rozcieńczyć komórki w medium R-P-M-I-H-S-A do stężenia 2 × 10⁶ komórek/ml i nanieść 200 µL zawiesiny komórkowej do każdej probówki do FACS. Ostrożnie, aby nie aktywować komórek poprzez wstrząsanie lub pipetowanie, załadować pierwszą probówkę do cytometru przepływowego. Odczekać trzy sekundy, a następnie rozpocząć akwizycję; po ustalonym czasie, na przykład osiem sekund, wyjąć probówkę i szybko dodać do próbki 50 µL najniższego rozcieńczenia stymulatora.Natychmiast ponownie załaduj probówkę i kontynuuj akwizycję. Po zakończeniu serii rozcieńczeń przemyj igłę cytometru przepływowego świeżym medium R-P-M-I-H-S-A przed pomiarem nowej serii. Po przeanalizowaniu ostatniej próbki, przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, aby ocenić ekspresję GFP bakterii.Po fagocytozie przez PMN należy przez noc hodować w bulionie szczep S. ous zawierający interesującą konstrukcję reporterową, a następnie usunąć GFP wykazane podczas hodowli nocnej, rozcieńczając komórki do OD 600 0,01. Hodować kulturę do osiągnięcia OD 600 0,1. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:30, a następnie monitorować wzrost, aż kultura ponownie osiągnie OD 600 0,1.Następnie należy zebrać bakterie poprzez wirowanie. Komórki należy raz przemyć w DPBS i zawiesić kulturę.Dodaj od 1 do 10 objętości pierwotnych, aby uzyskać OD₆₀₀ równą 1,0 lub około 5×10⁸ CFU na ml. Następnie zmieszaj bakterie ze świeżo wyizolowanymi PNS w R-P-M-I-H-S-A w stosunku 10:1. Następnie dodaj pulę surowicy ludzkiej, tak aby stanowiła 1/10 całkowitej objętości końcowej surowicy ludzkiej w roztworze komórkowym.Stymuluj fagocytozę, wstrząsając mieszaniną komórkową przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie rozcieńcz PMN obciążone bakteriami do stężenia 5 × 10⁵ komórek/ml i przenieś 250 µL komórek do każdej studzienki ośmiostudniowej szkiełka nakrywkowego z komorami. Na koniec obrazuj komórki za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw 40x i umieszczonego w komorze ciemności; wykonuj obrazy w wielu miejscach w komorach szkiełka nakrywkowego co 5–10 minut zarówno w polu jasnym, jak i w kanale GFP, aby śledzić produkcję GFP bakterii w czasie rzeczywistym. Inkubacja neutrofili z serią stężeń syntetycznego PSM α3 prowadzi do zależnej od dawki szybkiej aktywacji komórek, mierzonej za pomocą przepływu jonów wapnia.Preinkubacja peptydu PSM alpha three z 0,01%, 0,1% lub 1% surowicy ludzkiej znacząco zahamowała zdolność bodźca do wywołania odpowiedzi wapniowej. Ponownie, w sposób zależny od dawki, przy zastosowaniu 1% surowicy. Przy tych stężeniach PSM alpha three niemal nie obserwuje się żadnej aktywacji.Na przedstawionych obrazach widoczne są dwa neutrofile zawierające fagocytowane bakterie z konstruktem reporterowym PSM alpha GFP. Bakterie zaczynają fluorescować około godziny po fagocytozie, co wskazuje na ekspresję GFP z promotora PSM Alpha. Bakterie znajdujące się poza neutrofilami nie fluorescują, co oznacza, że ekspresja PSM alpha zostaje szybko aktywowana wyłącznie w momencie fagocytozy bakterii.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby w celu uzyskania optymalnych wyników zawsze używać świeżych neutrofili. Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli dobrą wiedzę na temat pomiaru przepływu wapnia metodą cytometrii przepływowej oraz pomiaru ekspresji genów bakteryjnych wewnątrz komórek eukariotycznych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie interakcji Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii czasowej

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Ten film demonstruje test in vitro do badania interakcji neutrofil-biofilm. Bakterie chorobotwórcze osadzone w biofilmie i wyizolowanych neutrofilach oznaczono za pomocą znaczników fluorescencyjnych, a odpowiedź immunologiczną neutrofili i unikanie odpowiedzi immunologicznej przez bakterie oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Test in vitro do badania interakcji między neutrofilami a biofilmem

Film demonstruje metodę badania wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów. W modelu komory z przepływem równoległym cytokiny prozapalne indukują ekspresję receptorów adhezyjnych przez komórki śródbłonka, ułatwiając rekrutację i migrację neutrofili. Wzajemne oddziaływanie między komórkami zrębu a komórkami śródbłonka zmniejsza rekrutację neutrofili do komórek śródbłonka.

Badanie przepływu in vitro wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Zdolność śródbłonka w stanie zapalnym do rekrutacji leukocytów z przepływu jest regulowana przez mezenchymalne komórki zrębu. Opisujemy dwa modele in vitro obejmujące pierwotne komórki ludzkie, które można wykorzystać do oceny rekrutacji neutrofili na podstawie przepływu i zbadania roli, jaką mezenchymalne komórki zrębu odgrywają w regulacji tego procesu.

Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

To badanie opisuje mikroskopowe monitorowanie przylegania pneumokoków do ciągów czynnika von Willebranda wytwarzanych na powierzchni zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających w określonych warunkach przepływu. Protokół ten można rozszerzyć o szczegółową wizualizację określonych struktur komórkowych i kwantyfikację bakterii poprzez zastosowanie różnicowych procedur barwienia immunologicznego.

Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Obecny protokół opisuje badanie interakcji neutrofil-biofilm. Biofilmy Staphylococcus aureus tworzy się in vitro i inkubuje z neutrofilami ludzkimi pochodzącymi z krwi obwodowej. Odpowiedź oksydacyjna neutrofili jest określana ilościowo, a lokalizacja neutrofili w biofilmie jest określana za pomocą mikroskopii.

Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus

Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

W tym manuskrypcie udostępniamy kompleksowy protokół oceny przeżywalności antybiotyków dla Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, przekształcając plazmidy w P. aeruginosa i S. aureus w celu stworzenia szczepów reporterowych i wizualizacji wariantów fenotypowych, takich jak uporczywe, za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Poznaj metodę badania aktywacji neutrofilów przez PSM z Staphylococcus aureus przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala analizować odpowiedź immunologiczną in vitro.

Badanie oddziaływań Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej

Przeglądaj więcej filmów