Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie interakcji między zmianami napięcia lub prądu, takimi jak zmiany w działaniu, potencjalna częstotliwość wypalania i wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia w neuronach jądra nadmatycznego. Osiąga się to poprzez przygotowanie wycinka mózgu do rejestracji neuronów jądra SMA za pomocą mikroelektrody wypełnionej sondą wrażliwą na wapń. W drugim etapie mikroelektroda jest uszczelniana błoną neuronalną.

Następnie błona neuronalna uszczelniona mikroelektrodą zostaje rozerwana w celu wprowadzenia sondy fluorescencyjnej wapnia do poszczególnych neuronów i zarejestrowania wraz z błoną uzyskiwanych wyników aktywności elektrycznej, które pokazują pomiary napięcia lub prądu oraz obrazy fluorescencji sondy wapniowej na dwóch długościach fal zmiana stosunku fluorescencji na tych długościach fal odzwierciedla zmianę wewnątrzkomórkowego wapnia w obrębie neuronu. Można przeprowadzić dalszą analizę w celu określenia stężenia wapnia w komórce. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmiany w aktywności elektrycznej błony i wewnątrzkomórkowym wapniu wytwarzanym przez aktywację synaptyczną mogą być jednocześnie mierzone w poszczególnych neuronach jądra nadkosmetycznego.

Technikę tę zademonstruje mój kolega dr Robert Irwin. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia mózgu szczura na okrągłej bibule filtracyjnej zwilżonej roztworem do krojenia na szklanej szalce Petriego, spoczywającej na lodzie, przeciąć koronę mózgu tylko po to, aby usunąć móżdżek i pień mózgu, a następnie odciąć części prawej i lewej strony kory, pozostawiając blok mózgu zawierający podwzgórze i starannie zachowując brzuszną stronę mózgu zawierającą nerwy wzrokowe SCN i skrzyżowanie wzrokowe. Następnie rozprowadź cienką warstwę kleju akrylowego Sano, wystarczająco dużą, aby przymocować bloki mózgu i aros w lodowatej komorze do krojenia mikrotomu.

Przenieś lodowaty blok mózgu stroną co w dół na klej stroną zawierającą SCN ustawioną do cięcia jako pierwszą, a nerwy wzrokowe tworzą literę v skierowaną do góry, umieszczając bloki aros po trzech innych stronach. Następnie napełnij komorę lodowatym buforem do krojenia i ciągle bąbelkuj karbogenem. Klej akrylowy Sano zestala się pod wpływem wilgoci i utrzymuje bloki mózgu i aros na miejscu.

Następnie pokrój koronalne plastry podwzgórza zawierające SCN o grubości od 220 do 250 mikronów. Zwróć uwagę, że lewy blok aros odczepił się podczas cięcia. Może się to zdarzyć, jeśli zostanie nałożona niewystarczająca ilość kleju.

Następnie zidentyfikuj wycinek zawierający SCN. Zazwyczaj wycinek wybiera się tam, gdzie skrzyżowanie wzrokowe ma około dwóch do czterech milimetrów średnicy, wyglądając jak biały pasek, a SCN tylko grzbietowo wygląda jak dwa małe wgłębienia w skrzyżowaniu wzrokowym po obu stronach trzeciej komory. Przenieś plasterek do komory rejestracyjnej o temperaturze 36 stopni Celsjusza zamontowanej na stoliku mikroskopu.

Komora jest wypełniona płynem nagrywającym o przepływie ciągłym w ilości dwóch mililitrów na minutę. Napowietrzony 95% karbogenem i podgrzany za pomocą wbudowanej grzałki. Zidentyfikuj SCN, obserwując dwa półprzezroczyste jądra SCN po obu stronach trzeciej komory, grzbietowo do skrzyżowania wzrokowego, które wygląda jak pasek, gdy jest oświetlone światłem przechodzącym.

Aby przygotować mikroelektrodę do zapisu, należy ją wypełnić wewnętrznym roztworem zawierającym sondę wapniową przefiltrowaną czteromilimetrowym filtrem strzykawkowym przez rurkę do mikronapełniania. Następnie umieść mikroelektrodę w uchwycie mikroelektrody. Następnie przyłóż niewielką ilość ciągłego nadciśnienia do elektrody.

Opuść mikroelektrodę do komory nagrywającej zgodnie z kierunkiem oświetlenia światłem czerwonym. Następnie umieść mikroelektrodę nad SCN za pomocą obiektywu o małej mocy. Następnie przełącz mikroskop na powiększenie o dużej mocy, aby wybrać podregion SCN i pojedynczy neuron SCN.

Kontynuuj wywieranie delikatnego nadciśnienia na mikroelektrodę, gdy jest ona przesuwana na powierzchnię ogniwa. Gdy znajdzie się na powierzchni, zastosuj delikatne podciśnienie, aby utworzyć uszczelkę o rezystancji od trzech do 10 gigaomów. Następnie dostosuj napięcie membrany do minus 60 miliwoltów.

Następnie zastosuj dodatkowe podciśnienie do elektrody, aby rozerwać błonę komórkową w celu uformowania zacisku całej łaty ogniwa. Po wejściu w tryb całej komórki, soma i dendryty neuronu SCN zostaną wypełnione sondą fluorescencyjną. Zmierz napięcie membrany w trybie cęgów prądowych lub prąd w trybie cęgów napięciowych.

Podczas gdy dane obrazowe sondy wapniowej są monitorowane i przechowywane, uzyskane obrazy można przeglądać wraz z wykresem danych fluorescencyjnych o współczynniku 340 nanometrów i 380 nanometrów. Podczas eksperymentu używany jest chronometr monochromatyczny do ilościowego uzyskiwania pomiarów wapnia poprzez szybkie wystawienie SCN na działanie światła UV. Przy 340 nanometrach i 380 nanometrach światło wzbudzające przechodzi przez filtr optyczny UG 11 w celu ograniczenia długości fal harmonicznych powyżej 400 nanometrów, a 400-nanometrowe zwierciadło dichroiczne DCLP odbija światło na tkankę.

Emitowane światło przechodzi przez filtr emisyjny o długości fali 510 nanometrów i jest rejestrowane przez kamerę. Aby przeanalizować wynik, wybierz obszar zainteresowania z obrazu początkowego i obszar tła, który ma zostać przekonwertowany na względne jednostki intensywności fluorescencji. Dane dotyczące obszaru zainteresowania są wyświetlane w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu.

Tło jest wykorzystywane później w późniejszej analizie danych. Oto obraz jasnego pola koronalnego wycinka podwzgórza zawierającego SCN i skrzyżowanie wzrokowe. Szklana mikroelektroda wypełniona wewnętrznym roztworem zawierającym BISRA dwa jest uszczelniona na pojedynczym neuronie.

Pokazano tutaj reakcje wapnia na serię 50 kroków napięcia zarejestrowanych z zaciśniętego napięciem neuronu SCN. Prądy sodowe bramkowane napięciem zostały zahamowane za pomocą 0,5 mikromolowego TTX, a jest to obraz zrzutu ekranu interesujących obszarów somatycznych i dendrytycznych odpowiadających odpowiedziom wapniowym. Są to przykłady reakcji wapnia na zmienną liczbę kroków napięcia.

Ten rysunek pokazuje jednoczesny zapis napięcia błony i wewnątrzkomórkowego wapnia. W neuronie SCN obecny eksperyment z klamrą przeprowadzono w obecności 50 mikromolowych rytoksyn. Niewielka depolaryzacja potencjału błonowego wywołała kilka napadów działania, wystrzeliwanie potencjału z odpowiednim wzrostem, a następnie spadkiem wewnątrzkomórkowego wapnia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować zdrowe plastry mózgu z jądra kosmetycznego oraz wykonywać jednocześnie eksperymenty elektrofizjologiczne i obrazowe. Nie zapominaj, że praca ze światłem ultrafioletowym może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniej ochrony oczu.