Name: Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej i obrazowania wapnia w neuronach jądra nadskrzyżowaniowego. Technika patch clamp z wskaźnikiem bis-fura-2 umożliwia badanie dynamiki jonów wapnia w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace zostały sfinansowane z grantu Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych (GM096972).

1. Przygotowanie wycinków mózgu z podwzgórza
<ol>
	<li>Uzyskaj z góry zgodę Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na jakąkolwiek procedurę z udziałem zwierząt. Opisane tutaj procedury na zwierzętach są zgodne z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt z 2013 r. i zostały wcześniej zatwierdzone przez IACUC Oregon Health & Science University.</li>
	<li>Przygotować 500 ml buforu do krojenia bez MgCl2 i CaCl2 (Tabela 1). Bąbelkować roztwór 95%O2 i 5% CO2 w temperaturze pokojowej, a następnie dodać MgCl2 i CaCl2, kontynuując napowietrzanie. Dostosować osmolarność do 300 mOsm za pomocą sacharozy. Osmolarność mierzy się za pomocą osmometru prężności pary.</li>
	<li>Przygotować 1 l nośnika zapisu bez MgCl2 i CaCl2 (tabela 2). Roztwór z bąbelkami z 95%O2 i 5% CO2 , a następnie dodać MgCl2 i CaCl2, kontynuując napowietrzanie. Dostosować pH do 7,2-7,4 za pomocą NaOH (10 N), a osmolarność do 300 mOsm za pomocą sacharozy. Dodanie buforu HEPES jest opcjonalne i zostało użyte do dalszej stabilizacji pH.</li>
	<li>Roztwory do krojenia i nagrywania można przechowywać w lodówce przez kilka dni przed użyciem.</li>
	<li>Przygotuj 3% agarozy i wlej do sterylnej szalki Petriego (głębokość 6 mm) i wstaw do lodówki.</li>
	<li>Pokrój trzy kostki agarozy o wymiarach około 6 mm x 6 mm x 6 mm.</li>
	<li>Głęboko znieczulij cztero- do ośmiotygodniowego szczura Sprague-Dawley izofluranem. Przetestuj głębokość znieczulenia. Głębokość znieczulenia jest uważana za odpowiednią, gdy nie ma odruchu wycofania kończyny tylnej po uszczypnięciu w poduszkę stopy. Po odpowiednim znieczuleniu szczur jest poddawany eutanazji poprzez szybkie ścięcie głowy. </li>
	<li>Szybko usuń mózg, uważając, aby najpierw przeciąć nerwy wzrokowe, a następnie umieść w lodowatym roztworze do krojenia nasyconym 5% CO2 i 95% O2 i pozostaw do ostygnięcia na 2-3 minuty.</li>
	<li>Przytnij mózg. Umieść mózg za pomocą kleszczy na zwilżonej (roztworem do krojenia) okrągłej bibule filtracyjnej ustawionej na szklanej szalce Petriego spoczywającej na lodzie.</li>
	<li>Przetnij mózg koronalnie, aby usunąć pozostały móżdżek i pień mózgu, a następnie korę rostralną i boki, aby pozostawić blok mózgu zawierający podwzgórze, starannie zachowując stronę zawierającą SCN, nerwy wzrokowe i skrzyżowanie wzrokowe.</li>
	<li>Rozprowadź cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego wystarczająco dużą, aby przymocować bloki mózgu i agarozy w lodowato, ale suchej komorze do krojenia mikrotomów.</li>
	<li>Przenieś lodowatą stronę ogonową bloku mózgu w dół na klej tak, aby strona zawierająca SCN była ustawiona do cięcia jako pierwsza, z nerwami wzrokowymi tworzącymi literę "V" skierowaną do góry.</li>
	<li>Ułóż bloki agarozy z pozostałych 3 stron. Napełnij komorę lodowatym buforem do krojenia, w sposób ciągły bąbelkującym 5% CO2 i 95% O2 . Klej cyjanoakrylowy zestala się pod wpływem wilgoci, utrzymując bloki mózgu i agarozy na miejscu.</li>
	<li>Wytnij plastry podwzgórza koronalnego (o grubości 220-250 μm) zawierające SCN za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami. Zazwyczaj wycinek wybiera się tam, gdzie skrzyżowanie wzrokowe ma około 2-4 mm średnicy, wyglądając jak biały pasek, a SCN tylko na grzbiecie pojawia się jako dwa małe "wgłębienia" w skrzyżowaniu wzrokowym po obu stronach 3. komory (ryc. 1A).</li>
	<li>Umieść plastry w komorze nagrywającej (36 °C) zamontowanej na stoliku mikroskopu Leica DMLFS. Komora jest wypełniona stale przepływającym roztworem rejestrującym (2 ml/min) napowietrzonym 95%O2 i 5% CO2 i wstępnie podgrzanym grzałką liniową.</li>
	<li>Wykonaj zapisy obrazowania całych komórek i wapnia w neuronach SCN 0,5-8 godzin po przygotowaniu plasterka.</li>
</ol>
2. Nagrywanie z zaciskiem krosowym
<ol>
	<li>Przygotować roztwór elektrody (wewnątrzkomórkowy) w połowie całkowitej końcowej objętości wody.</li>
	<li>Doprowadzić roztwór do pH 7,3 za pomocą KOH (1 N).</li>
	<li>Dodaj pozostałą wodę. Ostateczna osmolarność roztworu powinna mieścić się w zakresie 280-290 mOsm.</li>
	<li>Przepuścić roztwór elektrody przez filtr 0,2 μm, podwielokrotność (0,5 ml) do probówek do mikrofuge i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować sondę wapniową Bis-fura-2 roztwór podstawowy soli heksapotasowej bis-fura-2 (10 mM), mieszając 1 mg soli sześciopotasowej bis-fura-2 z 99,29 μl przefiltrowanej wody o stężeniu 0,2 μm.</li>
	<li>Podzielić na osobne probówki (po 2-5 μl każda) i zamrozić (-20 °C).</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność roztworu wewnętrznego i sondę Ca2+ na krótko przed użyciem. Dodać 2 μl roztworu podstawowego bis-fura-2 do 400 μl roztworu wewnętrznego, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μM w sondie wapniowej. Krótko rozcierać, aby wymieszać roztwory. Stężenie w sondzie wapniowej (10-250 μM) różni się w zależności od projektu eksperymentu i systemu obrazowania. Należy zauważyć, że bis-fura-2 składa się z dwóch połączonych cząsteczek fura-2.</li>
	<li>Wyciągnąć elektrody krosowe z całokomórkowymi ogniwami, w dwóch etapach, do zewnętrznej średnicy końcówki około 1 μm i rezystancji 7-10 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.</li>
	<li>Wypełnić elektrodę kilkoma μl roztworu wewnętrznego zawierającego sondę wapniową przefiltrowaną filtrem strzykawkowym 4 mm (0,2 μm) dla próbek o małej objętości za pomocą probówki Microfil.</li>
	<li>Zastosuj niewielką ilość nadciśnienia do elektrody, gdy jest ona wprowadzana do komory nagrywania przy czerwonym oświetleniu podczas oglądania na monitorze wideo. </li>
	<li>Umieść mikroelektrodę nad SCN za pomocą obiektywu o małej mocy (4X). SCN identyfikuje się jako dwa półprzezroczyste obszary po obu stronach trzeciej komory i grzbietowo do skrzyżowania wzrokowego (ryc. 1A).</li>
	<li>Przełącz mikroskop na powiększenie o dużej mocy (40X lub 63X). Podregiony SCN i poszczególne neurony SCN mogą być ukierunkowane na zapis w większym powiększeniu.</li>
	<li>Zastosuj delikatny dodatni nacisk na mikroelektrodę, gdy jest ona przesuwana na powierzchnię neuronu.</li>
	<li>Zastosuj delikatne podciśnienie do mikroelektrody, aby utworzyć uszczelnienie o rezystancji 3-10 GΩ.</li>
	<li>Dostosuj napięcie membrany do -60 mV przy wzmacniaczu sterowanym za pomocą oprogramowania do akwizycji.</li>
	<li>Zastosuj dodatkowe podciśnienie do elektrody, aby rozerwać błonę komórkową w trybie całego ogniwa.</li>
	<li>Po wejściu w tryb całej komórki neuron SCN, soma i dendryty wypełniają się sondą fluorescencyjną.</li>
	<li>Napięcie membrany jest mierzone w trybie cęgowym prądowym lub prądu w trybie cęgowym napięciem, podczas gdy dane obrazu sondy wapniowej są monitorowane i przechowywane (opisane poniżej). Przeglądaj uzyskane obrazy wraz z wykresem danych fluorescencyjnych o stosunku 340 nm/380 nm podczas eksperymentu.</li>
</ol>
3. Pomiar wewnątrzkomórkowego Ca2+
<ol>
	<li>Ilościowe pomiary Ca2+ uzyskuje się poprzez zarejestrowanie pary obrazów poprzez szybkie wzbudzenie tkanki światłem UV o długości fali 340 nm i 380 nm za pomocą monochronometru o szerokości pasma 10 nm i przepuszczenie przez filtr optyczny UG11 w celu ograniczenia długości fal harmonicznych powyżej 400 nm, dichroicznego DCLP 400 nm i wyemitowane światło przez filtr emisyjny 510±40 nm.</li>
	<li>Obrazy są rejestrowane za pomocą chłodzonej kamery CCD z czasem akwizycji i binningiem dostosowanym w celu zminimalizowania fotowybielania i maksymalizacji prędkości nagrywania.</li>
	<li>Oprogramowanie do obrazowania ilościowego służy do pozyskiwania i wyświetlania obrazów.</li>
	<li>Wybierz obszary zainteresowania z początkowego obrazu, które mają zostać przekonwertowane na dane jednostki względnej intensywności fluorescencji (np. soma, dendryt itp.). Wybierz również obszar do pomiaru fluorescencji tła (rysunek 1B).</li>
	<li>Surowe obrazy i ilościowe dane optyczne są stale zapisywane podczas eksperymentu. Po eksperymencie zapisane obrazy są zazwyczaj ponownie analizowane, gdy można poświęcić więcej czasu na dokładniejsze wybranie obszarów zainteresowania do ilościowego określenia.</li>
	<li>Dane można przedstawić jako szacowane wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia (Est[Ca2+]i). Doobliczenia stężenia wapnia stosuje się stosunek (R) światła emitowanego po wzbudzeniu i odjęciu tła przy 340 nm podzielony przez 380 nm wraz z maksymalną i minimalną fluorescencją przy 340 nm i 380 nm 4. Odejmowanie tła i inne obliczenia są wykonywane za pomocą oprogramowania do analizy danych.</li>
	<li>Oznaczenie in vitro maksymalnej i minimalnej fluorescencji bis-fury-2 można przeprowadzić przy użyciu 10 mM CaCl2 dla Ca2+ związanego i 10 mM EGTA dla warunków wolnych od Ca2+. Przyjmuje się, że stała dysocjacji Ca2+, Kd sondy wynosi 370 nM dla bis-fury-2 (Invitrogen).</li>
</ol>

<ol><li>Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+in+hippocampal+neurons+by+distinct+calcium+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways.</a> Science. 260, 181-186 (1993).</li>
<li>Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+gene+expression+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of gene expression in neuronal cells.</a> J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high+resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Higley, M. J., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+dendrites+and+spines%3A+practical+and+functional+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations.</a> Neuron. 59, 902-913 (2008).</li>
<li>Colwell, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+calcium+levels+in+cells+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).</li>
<li>Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+circadian+changes+in+Ca2%2B+mobilization+mediated+by+GABAA+and+NMDA+receptors+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+signaling+induces+divergent+neuronal+Ca2%2B+responses+in+the+suprachiasmatic+nucleus+network%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).</li>
<li>Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+by+retinal+ganglion+cells+that+set+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock.</a> Science. 295, 1070-1073 (2002).</li>
<li>Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-containing+retinal+ganglion+cells%3A+architecture%2C+projections%2C+and+intrinsic+photosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity.</a> Science. 295, 1065-1070 (2002).</li>
<li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Evoked+Calcium+Responses+of+Isolated+Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells.</a> J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).</li>
<li>Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-like+immunoreactivity+in+retinal+terminals+of+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).</li>
<li>Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCard%2C+JP+%22In+Suprachiasmatic+Nucleus+-+The+Mind%27s+Clock%22">In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock</a>. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).</li>
<li>Shigeyoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+resetting+of+a+mammalian+circadian+clock+is+associated+with+rapid+induction+of+the+mPer1+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript.</a> Cell. 91, 1043-1053 (1997).</li>
<li>Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+response+of+two+putative+mammalian+circadian+regulators%2C+mper1+and+mper2%2C+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light.</a> Cell. 91, 1055-1064 (1997).</li>
<li>Yan, L., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+and+localization+of+mPer1+and+mPer2+during+advancing+and+delaying+phase+shifts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts.</a> Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).</li>
<li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+mammalian+circadian+system%3A+Photic+entrainment%2C+circadian+pacemaker+mechanisms%2C+and+posttranslational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation.</a> Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+Mediation+of+nocturnal+circadian+shifts+by+glutamate+and+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO.</a> Science. 266, 1713-1717 (1994).</li>
<li>Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+the+biological+clock%3A+mediation+of+nocturnal+CREB+phosphorylation+via+light%2C+glutamate%2C+and+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide.</a> J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).</li>
<li>Ding, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+ryanodine+receptor+mediates+light-induced+phase+delays+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock.</a> Nature. 394, 381-384 (1998).</li>
<li>Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Ca2%2B+influx+mediated+by+three+different+pathways+during+synaptic+transmission+at+a+calyx-type+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse.</a> J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).</li>
<li>Irwin, R. P., Allen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Response+to+Retinohypothalamic+Tract+Synaptic+Transmission+in+Suprachiasmatic+Nucleus+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons.</a> J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).</li>
<li>Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+action+potentials+in+neuronal+populations+with+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging.</a> Methods. 18, 215-221 (1999).</li>
<li>Spruston, N., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforated+patch-clamp+analysis+of+the+passive+membrane+properties+of+three+classes+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons.</a> J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li>
<li>Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+A+%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).</li>
<li>Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-escin+diminishes+voltage-gated+calcium+current+rundown+in+perforated+patch-clamp+recordings+from+rat+primary+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).</li>
<li>Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+properties+of+fluorescence+dye+fura-2+with+various+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations.</a> Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).</li>
<li>Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+intracellular+Fura-2+fluorescence+by+viscosity%3A+a+simple+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction.</a> Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane powyżej metody stanowią potężne narzędzie do jednoczesnego rejestrowania związku między aktywnością elektryczną błony neuronalnej a wewnątrzkomórkowym stężeniem wapnia. Metoda ma szereg zalet w tym, że łączy w sobie dwie bardzo dobrze scharakteryzowane metody - rejestrację kropek krosowych całych komórek oraz pomiar wewnątrzkomórkowego wapnia za pomocą barwników fluorescencyjnych. Nasze podejście jest podobne do tych opisanych przez innych badaczy6,23.
Podczas kor...

Wiadomo, że zmiany w ekspresji genów występują w neuronach jako konsekwencja sygnalizacji synaptycznej. Sygnalizacja przez pobudzający neuroprzekaźnik glutaminian może depolaryzować potencjał błony neuronalnej, ostatecznie prowadząc do transkrypcji i translacji genów1,2. Aktywacja receptorów jonotropowych przez glutaminian umożliwia zewnątrzkomórkowym jonom wapnia przedostanie się do komórki, która uważa się za odgrywającą kluczową rolę jako drugi przekaźnik w aktywacji transkrypcji genów. Ocena związku między aktywnością elektryczną błony, taką jak częstotliwość wyzwalania potencjału czynnościowego, a zmianami wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wymaga połączenia dwóch metod - zaciskania całych komórek i obrazowania ilościowego fluorescencyjnych sond wapniowych3-5, co pozwala na zbadanie związku w poszczególnych neuronach. Technika rejestracji pojedynczej komórki pozwala na rejestrację aktywności poszczególnych neuronów w możliwych do zidentyfikowania częściach mózgu. Technika zapisu całej komórki pozwala na kontrolowanie napięcia lub prądu membrany, co pozwala na eksperymentalną manipulację określonymi prądami kanałów jonowych. Korzystanie z mikropipet wypełnionych fluorescencyjnymi sondami wapniowymi zapewnia również, że neuron jest dobrze wypełniony sondą wapniową. Technika ta ma wyraźną przewagę podczas pracy z preparatami wycinków mózgu z preparatów dla dorosłych, ponieważ neurony te są szczególnie trudne do załadowania przy użyciu bardziej powszechnych sond komórkowych i zmniejszają potencjalne problemy z fluorescencją tła6-8.
Światło jest głównym sposobem regulacji zegara dobowego ssaków, który znajduje się w jądrze nadskrzyżowaniowym podwzgórza (SCN). Informacja świetlna przekazywana w siatkówce jest przekazywana 9-11 przez przewód siatkówkowo-podwzgórzowy (RHT), gdzie glutaminian jest uwalniany w SCN12,13. Glutaminian otwiera receptory jonotropowe NMDA i AMPA zlokalizowane na neuronach SCN, powodując napływ wapnia i sodu oraz inicjując wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną, która ostatecznie prowadzi do zmiany ekspresji rodziny genów zegara14-17 i przesunięć w fazie zegara okołodobowego18-20. Jednak wapń może dostać się do neuronów albo bezpośrednio przez jonotropowe receptory glutaminianu, albo poprzez depolaryzację błony i aktywację kanałów wapniowych zależnych od napięcia (VDCC)21. W związku z tym opracowaliśmy protokół eksperymentalny w celu zbadania związku między wewnątrzkomórkowym stężeniem wapnia a aktywnością elektryczną błony w neuronach SCN, taką jak ma to miejsce w przypadku wystrzeliwania potencjału czynnościowego i z wejścia synaptycznego22.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull; H2O</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific Co.</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glukonian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Sól dipotasowa 5&-trifosforanu adenozyny dwuwodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Sól trisowa 5&trifosforanu guanozyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (ultraczysta)</td><td>Życie Technologie</td><td>15510-027</td><td>Żel porowany w sterylną szalkę Petriego Warstwa o grubości 6 mm</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>Bis-fura-2, sól heksapotasowa</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>Nieprzepuszczalna</td></tr><tr><td>komórka Nazwa</td><td>firmy</td><td>Sprzęt Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy do krojenia tkanek (Roti-Coll1)</td><td>Carl Roth GmbH+Co</td><td>Art-Nr. 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikroelektrod</td><td>Narshige International USA</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne z mikroelektrodami</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 g</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Mikroskop Corning</td><td>#431212</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>DM LFS</td><td>z obiektywami UV 4X, 40X i UV 63X oraz kamerą CCD z epifluorescencją</td></tr><tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA ER</td><td>12-bitowa</td></tr><tr><td>kostka filtra CCD Fura-2 Chroma</td><td>71500A</td><td>Zestaw z filtrem UG11</td><td></td></tr><tr><td>Monochronometr</td><td></td><td></td> Polychrome IV Till Photonics GmBH <td></td></tr><tr><td>Okulary ochronne blokujące promieniowanie ultrafioletowe</td> Produkty <td></td><td></td><td>ultrafioletowe</td></tr><tr><td>Wzmacniacz EPC-9</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>Urządzenia</td><td></td> molekularne <td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td></tr><tr><td>Igor wersja 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Elektrofizjologia i Ca2+ Analiza danych</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Westcor</td><td></td><td>Osmometr ciśnienia pary</td></tr></tbody></table>

jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Równoczesne metody zapisu elektrofizjologicznego i fluorescencyjnego zostały wykorzystane do zbadania roli zmian potencjału błonowego lub prądu w regulacji wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Zmieniające się warunki środowiskowe, takie jak cykl światło-ciemność, mogą modyfikować aktywność sieci neuronalnych i neuronowych oraz ekspresję rodziny genów zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN), lokalizacji głównego zegara okołodobowego w mózgu ssaków. Pobudzająca transmisja synaptyczna prowadzi do wzrostu postsynaptycznego stężenia Ca2 +, które, jak się uważa, aktywuje szlaki sygnałowe, które zmieniają rytmiczną ekspresję genów zegara okołodobowego. Plastry podwzgórza zawierające SCN zaciśnięto za pomocą mikroelektrod wypełnionych wewnętrznym roztworem zawierającym wskaźnik wapnia bis-fura-2. Po utworzeniu uszczelnienia między mikroelektrodą a błoną neuronalną SCN, błona została rozerwana za pomocą delikatnego zasysania, a sonda wapniowa dyfundowała do neuronu, wypełniając zarówno somę, jak i dendryty. Ilościowe pomiary ratiometryczne wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia rejestrowano jednocześnie z potencjałem błonowym lub prądem. Za pomocą tych metod możliwe jest zbadanie roli zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wywołanych aktywnością synaptyczną i wypalaniem potencjału czynnościowego poszczególnych neuronów. W tej prezentacji przedstawiono metody jednoczesnego rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej wraz z wewnątrzkomórkowym wapniem z pojedynczych neuronów SCN utrzymywanych w wycinkach mózgu.

Wykorzystując skrawki mózgu z obszaru podwzgórza, jednocześnie rejestrowaliśmy zmiany poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego w trybie whole-cell, zarówno w warunkach clampowania napięcia, jak i clampowania prądu. Mikroelektrodę pokazaną na Rysunku 1A opuszczano na pozycję przy dużym powiększeniu (obiektywy UV 40X lub 63X), stosując niewielkie dodatnie ciśnienie. Po zetknięciu z neuronem, za pomocą delikatnego ssania, tworzono uszczelnienie gigaohmiczne. W trybie clampowania napięcia, po ustawieniu potencjału...

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie interakcji między zmianami napięcia lub prądu, takimi jak zmiany w działaniu, potencjalna częstotliwość wypalania i wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia w neuronach jądra nadmatycznego. Osiąga się to poprzez przygotowanie wycinka mózgu do rejestracji neuronów jądra SMA za pomocą mikroelektrody wypełnionej sondą wrażliwą na wapń. W drugim etapie mikroelektroda jest uszczelniana błoną neuronalną.Następnie błona neuronalna uszczelniona mikroelektrodą zostaje rozerwana w celu wprowadzenia sondy fluorescencyjnej wapnia do poszczególnych neuronów i zarejestrowania wraz z błoną uzyskiwanych wyników aktywności elektrycznej, które pokazują pomiary napięcia lub prądu oraz obrazy fluorescencji sondy wapniowej na dwóch długościach fal zmiana stosunku fluorescencji na tych długościach fal odzwierciedla zmianę wewnątrzkomórkowego wapnia w obrębie neuronu. Można przeprowadzić dalszą analizę w celu określenia stężenia wapnia w komórce. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmiany w aktywności elektrycznej błony i wewnątrzkomórkowym wapniu wytwarzanym przez aktywację synaptyczną mogą być jednocześnie mierzone w poszczególnych neuronach jądra nadkosmetycznego.Technikę tę zademonstruje mój kolega dr Robert Irwin. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia mózgu szczura na okrągłej bibule filtracyjnej zwilżonej roztworem do krojenia na szklanej szalce Petriego, spoczywającej na lodzie, przeciąć koronę mózgu tylko po to, aby usunąć móżdżek i pień mózgu, a następnie odciąć części prawej i lewej strony kory, pozostawiając blok mózgu zawierający podwzgórze i starannie zachowując brzuszną stronę mózgu zawierającą nerwy wzrokowe SCN i skrzyżowanie wzrokowe. Następnie rozprowadź cienką warstwę kleju akrylowego Sano, wystarczająco dużą, aby przymocować bloki mózgu i aros w lodowatej komorze do krojenia mikrotomu.Przenieś lodowaty blok mózgu stroną co w dół na klej stroną zawierającą SCN ustawioną do cięcia jako pierwszą, a nerwy wzrokowe tworzą literę v skierowaną do góry, umieszczając bloki aros po trzech innych stronach. Następnie napełnij komorę lodowatym buforem do krojenia i ciągle bąbelkuj karbogenem. Klej akrylowy Sano zestala się pod wpływem wilgoci i utrzymuje bloki mózgu i aros na miejscu.Następnie pokrój koronalne plastry podwzgórza zawierające SCN o grubości od 220 do 250 mikronów. Zwróć uwagę, że lewy blok aros odczepił się podczas cięcia. Może się to zdarzyć, jeśli zostanie nałożona niewystarczająca ilość kleju.Następnie zidentyfikuj wycinek zawierający SCN. Zazwyczaj wycinek wybiera się tam, gdzie skrzyżowanie wzrokowe ma około dwóch do czterech milimetrów średnicy, wyglądając jak biały pasek, a SCN tylko grzbietowo wygląda jak dwa małe wgłębienia w skrzyżowaniu wzrokowym po obu stronach trzeciej komory. Przenieś plasterek do komory rejestracyjnej o temperaturze 36 stopni Celsjusza zamontowanej na stoliku mikroskopu.Komora jest wypełniona płynem nagrywającym o przepływie ciągłym w ilości dwóch mililitrów na minutę. Napowietrzony 95% karbogenem i podgrzany za pomocą wbudowanej grzałki. Zidentyfikuj SCN, obserwując dwa półprzezroczyste jądra SCN po obu stronach trzeciej komory, grzbietowo do skrzyżowania wzrokowego, które wygląda jak pasek, gdy jest oświetlone światłem przechodzącym.Aby przygotować mikroelektrodę do zapisu, należy ją wypełnić wewnętrznym roztworem zawierającym sondę wapniową przefiltrowaną czteromilimetrowym filtrem strzykawkowym przez rurkę do mikronapełniania. Następnie umieść mikroelektrodę w uchwycie mikroelektrody. Następnie przyłóż niewielką ilość ciągłego nadciśnienia do elektrody.Opuść mikroelektrodę do komory nagrywającej zgodnie z kierunkiem oświetlenia światłem czerwonym. Następnie umieść mikroelektrodę nad SCN za pomocą obiektywu o małej mocy. Następnie przełącz mikroskop na powiększenie o dużej mocy, aby wybrać podregion SCN i pojedynczy neuron SCN.Kontynuuj wywieranie delikatnego nadciśnienia na mikroelektrodę, gdy jest ona przesuwana na powierzchnię ogniwa. Gdy znajdzie się na powierzchni, zastosuj delikatne podciśnienie, aby utworzyć uszczelkę o rezystancji od trzech do 10 gigaomów. Następnie dostosuj napięcie membrany do minus 60 miliwoltów.Następnie zastosuj dodatkowe podciśnienie do elektrody, aby rozerwać błonę komórkową w celu uformowania zacisku całej łaty ogniwa. Po wejściu w tryb całej komórki, soma i dendryty neuronu SCN zostaną wypełnione sondą fluorescencyjną. Zmierz napięcie membrany w trybie cęgów prądowych lub prąd w trybie cęgów napięciowych.Podczas gdy dane obrazowe sondy wapniowej są monitorowane i przechowywane, uzyskane obrazy można przeglądać wraz z wykresem danych fluorescencyjnych o współczynniku 340 nanometrów i 380 nanometrów. Podczas eksperymentu używany jest chronometr monochromatyczny do ilościowego uzyskiwania pomiarów wapnia poprzez szybkie wystawienie SCN na działanie światła UV. Przy 340 nanometrach i 380 nanometrach światło wzbudzające przechodzi przez filtr optyczny UG 11 w celu ograniczenia długości fal harmonicznych powyżej 400 nanometrów, a 400-nanometrowe zwierciadło dichroiczne DCLP odbija światło na tkankę.Emitowane światło przechodzi przez filtr emisyjny o długości fali 510 nanometrów i jest rejestrowane przez kamerę. Aby przeanalizować wynik, wybierz obszar zainteresowania z obrazu początkowego i obszar tła, który ma zostać przekonwertowany na względne jednostki intensywności fluorescencji. Dane dotyczące obszaru zainteresowania są wyświetlane w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu.Tło jest wykorzystywane później w późniejszej analizie danych. Oto obraz jasnego pola koronalnego wycinka podwzgórza zawierającego SCN i skrzyżowanie wzrokowe. Szklana mikroelektroda wypełniona wewnętrznym roztworem zawierającym BISRA dwa jest uszczelniona na pojedynczym neuronie.Pokazano tutaj reakcje wapnia na serię 50 kroków napięcia zarejestrowanych z zaciśniętego napięciem neuronu SCN. Prądy sodowe bramkowane napięciem zostały zahamowane za pomocą 0,5 mikromolowego TTX, a jest to obraz zrzutu ekranu interesujących obszarów somatycznych i dendrytycznych odpowiadających odpowiedziom wapniowym. Są to przykłady reakcji wapnia na zmienną liczbę kroków napięcia.Ten rysunek pokazuje jednoczesny zapis napięcia błony i wewnątrzkomórkowego wapnia. W neuronie SCN obecny eksperyment z klamrą przeprowadzono w obecności 50 mikromolowych rytoksyn. Niewielka depolaryzacja potencjału błonowego wywołała kilka napadów działania, wystrzeliwanie potencjału z odpowiednim wzrostem, a następnie spadkiem wewnątrzkomórkowego wapnia.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować zdrowe plastry mózgu z jądra kosmetycznego oraz wykonywać jednocześnie eksperymenty elektrofizjologiczne i obrazowe. Nie zapominaj, że praca ze światłem ultrafioletowym może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniej ochrony oczu.

simultaneous-electrophysiological-recording-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Współbieżne rejestrowanie elektrofizjologiczne i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadkomorowego

Opracowaliśmy metodę jednoczesnego wykonywania funkcjonalnego obrazowania rezonansem magnetycznym oraz rejestracji elektrofizjologicznej w mózgu gryzoni, co stanowi platformę do badania zależności między aktywnością neuronalną a sygnałem fMRI zależnym od poziomu utlenowania krwi (BOLD).

Jednoczesne badanie fMRI i elektrofizjologii w mózgu gryzoni

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Zrozumienie funkcji ośrodkowego układu nerwowego kręgowców wymaga rejestracji aktywności wielu neuronów, ponieważ funkcje kory powstają na poziomie populacji neuronów. Opisujemy tutaj optyczną metodę rejestracji nadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów (spikes), zwaną skanowaniem z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning). Metoda ta rejestruje somatyczne sygnały fluorescencji wapnia z maksymalnie 100 neuronów z...

Optyczna rejestracja ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Ten protokół opisuje prostą metodę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanej elektroencefalografii (EEG) i wielolaminarnego potencjału pola lokalnego u znieczulonego szczura. Wykazano, że otwór w czaszce wywiercony w czaszce w celu wprowadzenia mikroelektrody powoduje znikome zniekształcenia sygnału EEG.

Jednoczesna rejestracja kolokalizowanej elektroencefalografii i lokalnego potencjału pola u gryzoni

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Poznaj metodę jednoczesnego rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej i obrazowania wapnia w neuronach jądra nadskrzyżowaniowego. Technika patch clamp z wskaźnikiem bis-fura-2 umożliwia badanie dynamiki jonów wapnia w czasie rzeczywistym.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Przeglądaj więcej filmów