Name: Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Poznaj automatyczny test zachowań żerowych u Drosophila melanogaster w neurobiologii. Ta metoda pozwala mierzyć zmiany behawioralne wywołane głodem i badanie obwodów nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty badawcze dla J.W.W. z National Institute of Health (R01DK092640) i National Science Foundation (0920668).

1. Zbieranie much i głód
<ol>
	<li>Hoduj eksperymentalne muchy w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności (np. 21 °C, 50-60% wilgotności względnej) w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności.</li>
	<li>Zbierz samice much w dniu zaniku i umieść je, wraz z 4-5 samcami, w nowych fiolkach z pokarmem (maksymalnie 30 na fiolkę). Wiek leci 2-5 dni.</li>
	<li>Przygotuj komory na głód much.
	<ol>
		<li>Wepchnij pojedynczą chusteczkę (4.8 x 8.4 cala) na dno pustej plastikowej fiolki. Całkowicie namocz tkankę wodą destylowaną. Użyj przedmiotu, aby docisnąć tkankę i delikatnie wyciśnij nadmiar wody.</li>
		<li>Odwrócić fiolkę, aby usunąć nadmiar wody. Powinno być wystarczająco dużo wody, aby muchy były nawodnione, a komora głodowa wilgotna, ale nie wystarczająca, aby utopić muchy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś muchy z fiolki z jedzeniem do komory głodowej i zatkaj fiolkę na około 18-24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Przechowywać fiolki w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności przez noc, aż do rozpoczęcia eksperymentu następnego dnia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zapachu żywności
<ol>
	<li>Przygotować 1% roztwór agarozy, dodając 0,1 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia do 10 ml wody destylowanej w szklanej kolbie. Podgrzej roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej, aż zacznie wrzeć, ale na długo przed wykipieniem.
	<ol>
		<li>Zatrzymaj kuchenkę mikrofalową i raz zakręć kolbą. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Utrzymywać roztwór agarozy w stanie ciekłym, utrzymując kolbę w cieple na płycie grzejnej ustawionej na 50 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 990 μl 1% roztworu agarozy i 10 μl octu jabłkowego do 1,5 ml probówki Eppendorf, aby uzyskać 1% roztwór octu jabłkowego. Zmieszać roztwór do momentu wymieszania i umieścić w inkubatorze do suchej kąpieli nastawionym na 50 °C.</li>
</ol>
3. Pomieszczenie testowe i konfiguracja komory zachowania
<ol>
	<li>Ustaw pomieszczenie testowe na żądane warunki (np. temperaturę i wilgotność).</li>
	<li>Włącz panel LED ( 660 nm).</li>
	<li>Opłucz sita i płytki testowe gorącą wodą i podgrzej je w suszarce, aż cała wilgoć wyparuje. Ostudzić sita i płytki do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
	<li>Umieść płytkie naczynie na płycie dyfuzora i napełnij je wodą, aby zwiększyć lokalną wilgotność i zamaskować wodę w kropli agarozy.</li>
	<li>Umieść sitka nad naczyniem na wodę.</li>
</ol>
4. Ładowanie muchy na płytkach testowych
Diagramy ze specyfikacjami płytek testowych można znaleźć w sekcji Pliki uzupełniające. Płytka testowa wykonana jest z przezroczystego akrylu i składa się z 6 aren testowych. Prosty suwak zawiera komory przetrzymujące, które umożliwiają ładowanie muchy, tymczasowe zabezpieczenie i jednoczesne wypuszczenie 6 much do odpowiednich komór na początku eksperymentu. Krzyżyk wytrawiony na środku każdej areny w płytce wskazuje, gdzie należy pipetować substancje zapachowe.
<ol>
	<li>Włóż suwaki do akrylowej płytki testowej.</li>
	<li>Delikatnie wsuń aspirator do fiolki obok bawełnianej zatyczki i pozwól około 6 muchom wejść do aspirator.it bardzo ważne jest, aby obchodzić się z nimi tak delikatnie, jak to możliwe. Można wykorzystać fototaktyczne zachowanie muchy, aby skłonić muchy do czołgania się w kierunku aspiratora, kierując otwór fiolki w stronę słabego źródła światła. W razie potrzeby można również zastosować delikatne ssanie, aby zassać około 6 samic much.</li>
	<li>Włóż końcówkę aspiratora do pierwszego otworu płytki testowej. Pozwól, aby pojedyncza mucha przeszła do komórki trzymającej i delikatnie przesuń suwak do przodu, aby załadować muchę do następnego otworu. Kontynuuj, aż muchy zajmą wszystkie 6 komórek podtrzymujących płytkę.</li>
	<li>Odpipetować 5 μl 1% octu jabłkowego i roztworu agarozy bezpośrednio na środek krzyża nitkowego po wewnętrznej stronie płytki testowej.</li>
</ol>
5. Ustawianie płytki testowej
<ol>
	<li>Aby wyśrodkować płytkę testową, otwórz plik o nazwie "Pozycjonowanie Tool.vi". "LabVIEW VI for Positioning Tool. vi można znaleźć w sekcji Pliki uzupełniające. Uruchom plik, klikając białą strzałkę w lewym górnym rogu ekranu.</li>
	<li>Umieść płytkę testową na górze sita w taki sposób, aby otwór areny był skierowany w stronę podłogi sita, a cel zapachu znajdował się na suficie płyty. Dopasuj krzyżyk nitkowy wytrawiony z tyłu płytki testowej do krzyżyka na ekranie monitora.</li>
	<li>Po zakończeniu wyrównywania przerwij wykonywanie, klikając czerwoną kropkę znajdującą się w pobliżu lewego górnego rogu monitora.</li>
</ol>
6. Zapisz pozycję lotu podczas eksperymentu
<ol>
	<li>Aby śledzić i rejestrować współrzędne muchy podczas każdej próby wyszukiwania żywności, otwórz plik oprogramowania do akwizycji "Fly Tracking--Six Zones.vi". VI LabVIEW dla "Fly Tracking--Six Zones.vi" można znaleźć w sekcji Pliki uzupełniające. Uruchom plik, klikając białą strzałkę w lewym górnym rogu monitora.</li>
	<li>Przypisz plikowi nazwę i kliknij "OK".</li>
	<li>Przesuń suwaki w komorach testowych, aby wypuścić muchy na areny testowe. Uważaj, aby nie przesuwać komór testowych, ponieważ doprowadzi to do nieprawidłowego wyrównania ze współrzędnymi oprogramowania analitycznego.</li>
	<li>Kliknij "Start" (rozpocznie się nagrywanie) i upewnij się, że jedynym źródłem światła w komorze testowej jest panel LED 660 nm.</li>
	<li>Po zakończeniu próby wyjmij sito i komorę behawioralną. Zdejmij płytkę testową z sita i usuń muchy, zanurzając płytkę w lodzie. Delikatnie wyczyść płytkę gorącą wodą i usuń wszelkie zanieczyszczenia agarozy. Umieść płytki testowe w suszarce w celu usunięcia wilgoci.</li>
	<li>Przewietrzyć obszar testowy, włączając mały wentylator na około 2 minuty. Wyłącz wentylator i załaduj następną grupę much na następną płytkę testową.</li>
</ol>
7. Analiza danych za pomocą niestandardowego oprogramowania
"Analiza danych do śledzenia lotów - Sześć stref" można znaleźć w sekcji Pliki uzupełniające. Podczas akwizycji danych oprogramowanie do akwizycji rejestruje indywidualne współrzędne pozycji lotu dla każdego punktu czasowego w pliku tekstowym. Pojedyncza kamera cyfrowa umieszczona nad płytkami testowymi rejestruje obrazy z częstotliwością odświeżania 0,5 Hz. Program do analizy "Data Analysis for Fly Tracking-Six Zones" wydobywa informacje z tego pliku tekstowego, aby a) obliczyć średnią prędkość, b) określić punkt czasowy, w którym mucha pomyślnie zlokalizowała źródło zapachu, oraz c) zbudować okna graficzne, które pozwalają użytkownikowi zobaczyć: lokalizację lotu, odległość muchy od źródła zapachu w czasie i średnią prędkość lotu w czasie. Formatuje również dane w celu łatwego eksportu do programu do arkuszy kalkulacyjnych. W tym makrze opóźnienie wyszukiwania żywności jest definiowane jako punkt czasowy, w którym muchy spędzają co najmniej 5 sekund w promieniu 5 mm od środka areny.
<ol>
	<li>Otwórz plik oprogramowania analitycznego "Data Analysis for Fly Tracking - Six Zones". W zakładce "Windows" kliknij "Utwórz nową tabelę". Powtarzaj ten krok, aż zostanie utworzonych sześć tabel.</li>
	<li>W zakładce "Makra" kliknij "Foodfinding". Powinien pojawić się panel główny z następującymi opcjami: Otwórz plik danych surowych dla układu; Otwórz plik danych RAW dla pliku danych; Lokalizacja lotu; Odległość; Szybkość; Układ; FormatDataFile.</li>
	<li>Aby wyświetlić surowe dane bez dołączania wartości do pliku tekstowego, kliknij "Otwórz plik danych RAW dla układu". Zlokalizuj i wybierz plik danych eksperymentalnych w wyświetlonym oknie przeglądarki. Kliknij "Otwórz".</li>
	<li>Kliknij "Lokalizacja lotu", aby wyświetlić lokalizację każdej muchy na każdej z sześciu aren (na ekranie powinno pojawić się sześć wykresów X-Y przedstawiających pozycję każdej muchy w czasie).</li>
	<li>Kliknij "Odległość", aby wyświetlić odległość każdej muchy od źródła zapachu (na ekranie powinno pojawić się sześć wykresów przedstawiających odległość muchy od źródła zapachu w czasie). Linia pozioma na wysokości y = 5 mm wskazuje próg, przy którym uważa się, że mucha znajduje się przy źródle pożywienia.</li>
	<li>Kliknij "Prędkość", aby wyświetlić średnią prędkość każdej muchy podczas próby (na ekranie powinno pojawić się sześć wykresów przedstawiających prędkość muchy w czasie).</li>
	<li>Kliknij "Układ", aby wyświetlić układ ze wszystkimi wykresami lokalizacji, odległości i prędkości, a także średnią prędkością (w ciągu pierwszych 50 sekund) i opóźnieniem w znalezieniu źródła zapachu dla każdej muchy (Rysunek 1). Aby poprawnie wyświetlić układ, może być konieczne dostosowanie marginesów. Aby to zrobić, najpierw kliknij okno układu. W zakładce "Plik" kliknij "Ustawienia strony dla układu". Zresetuj marginesy do 0,2 cala i kliknij "OK". Bezpośrednio po lewej stronie każdej wykresu lokalizacji znajduje się mała tabela z nagłówkami "Prędkość" i "Opóźnienie". Wartości wprowadzone pod każdym nagłówkiem wskazują średnią prędkość w mm/s i opóźnienie wyszukiwania żywności w sekundach. Puste wpisy w obszarze Opóźnienie wskazują, że mucha nie mogła zlokalizować źródła zapachu. Opóźnienie wyszukiwania żywności definiuje się jako punkt czasowy, w którym muchy spędziły co najmniej 5 sekund w promieniu 5 mm od środka komory.</li>
	<li>Aby wydrukować układ, kliknij obszar układu (aktualizuje układ do bieżącego pliku). Kliknij "Plik", a następnie kliknij "Drukuj układ".</li>
	<li>Aby wyświetlić następny plik, po prostu kliknij "Otwórz plik danych RAW dla układu". Kliknij następny plik danych raw, który chcesz wyświetlić, i kliknij "OK". Kliknij okno Układ, aby zaktualizować okno o nowy plik danych.</li>
	<li>Ustawienia mogą zostać zapisane w pliku eksperymentu do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
8. Eksport danych z oprogramowania do analizy danych do programu do arkuszy kalkulacyjnych
<ol>
	<li>Aby wyeksportować dane dotyczące prędkości i opóźnień dla każdego pliku, kliknij "Otwórz plik danych surowych dla pliku danych". Wybierz plik danych eksperymentalnych i kliknij "Otwórz". Pojawi się nowe okno przeglądarki.</li>
	<li>W nowym oknie przeglądarki kliknij prawym przyciskiem myszy "Nowy", a następnie kliknij "Dokument tekstowy". Nazwij nowy dokument tekstowy. Wybierz nowo nazwany plik tekstowy i kliknij "Otwórz". Spowoduje to zapisanie danych z pliku danych surowych w pliku tekstowym.</li>
	<li>Aby wyeksportować dane z innego pliku, kliknij "Otwórz plik danych surowych dla pliku danych". Kliknij inny plik i kliknij "Otwórz". Wybierz plik tekstowy z kroku 8.2). Kontynuuj ten proces dla pozostałych plików danych, które chcesz wyeksportować.</li>
	<li>Po dodaniu wszystkich żądanych plików danych do pliku tekstowego kliknij "Formatuj plik danych". Wybierz dokument tekstowy używany do przechowywania danych z poprzednich kroków i kliknij "Otwórz" (automatycznie otworzy się nowe okno).</li>
	<li>Utwórz nowy dokument tekstowy w oknie, przypisz plikowi nazwę i kliknij "Zapisz". Spowoduje to utworzenie pliku tekstowego, który zawiera nazwę pliku, średnią prędkość i opóźnienie dla każdego lotu i może być importowany do programu arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Wykresy skumulowane są konstruowane na podstawie danych dotyczących całkowitej liczby much, które osiągnęły docelowy zapach pokarmu w funkcji czasu (rysunek 3).</li>
	<li>Zestawy danych eksperymentalnych są analizowane pod kątem istotności statystycznej za pomocą testu z dla proporcji.</li>
</ol>

<ol><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDethier%2C+VG+%22The+hungry+fly+%3A+a+physiological+study+of+the+behavior+associated+with+feeding%22">The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding</a>. , Harvard University Press. (1976).</li>
<li>Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+facilitation+by+neuropeptide+signaling+mediates+odor-driven+food+search%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search.</a> Cell. 145, 133-144 (2011).</li>
<li>Root, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+gain+control+mechanism+fine-tunes+olfactory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior.</a> Neuron. 59, 311-321 (2008).</li>
<li>Semmelhack, J. L., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Select+Drosophila+glomeruli+mediate+innate+olfactory+attraction+and+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion.</a> Nature. 459, 218-223 (2009).</li>
<li>Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+responses+of+Drosophila+to+biogenic+levels+of+carbon+dioxide+depend+on+life-stage%2C+sex+and+olfactory+context%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context.</a> J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).</li>
<li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Conditioned behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 708-712 (1974).</li>
<li>Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+behavior+mediated+by+single+larval+olfactory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila.</a> Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li>
<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).</li>
<li>Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+expression+of+tetanus+toxin+light+chain+in+Drosophila+specifically+eliminates+synaptic+transmission+and+causes+behavioral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects.</a> Neuron. 14, 341-351 (1995).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym protokole opisujemy krok po kroku procedurę testu zachowań związanych z wyszukiwaniem żywności. Oprócz zapachów związanych z żywnością, może być również przystosowany do badania zdolności muchy do lokalizowania innych obiektów zapachowych. Na przykład można go zastosować do badania zachowań lokalizacyjnych partnera u samców much3 . Istnieje kilka dodatkowych kwestii związanych z tym protokołem, o których wspomnimy tutaj w odniesieniu do tej procedury:
Po pierwsze, temperatura...

Stany głodu sprzyjają dwóm typom zachowań pożądawczych: poszukiwaniu jedzenia i konsumpcji jedzenia1. Ten prosty test behawioralny jest przydatny do badania zachowań chemotaktycznych związanych z żerowaniem2,3. W szczególności śledzi pozycję lotu, prędkość chodzenia i opóźnienie, aby zlokalizować cel zapachu jedzenia. Opóźnienie w znajdowaniu pokarmu służy jako miara do pomiaru zmian czułości systemu wykrywania zapachów muchy po zmianach w jej wewnętrznym stanie pożądawczym. Ręczna wersja tego testu była wcześniej używana do wykazania, że sygnalizacja receptora GABA-B jest ważna dla zachowania lokalizacji zapachu u dorosłych much3. Obecna zautomatyzowana wersja testu odegrała zasadniczą rolę w badaniu, w jaki sposób krótka sygnalizacja neuropeptydu-F (sNPF) zmienia mapę węchową u Drosophila i wpływa na zachowania apetytywne2.
Testowanie odbywa się w ciemnym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności. Cyfrowe kamery wideo umieszczone nad przezroczystymi akrylowymi płytami testowymi śledzą muchy podświetlane oświetleniem LED o długości fali 660 nm. Informacje z kamery są przetwarzane w czasie rzeczywistym przez komputer umieszczony obok obszaru testowego. Używamy oprogramowania do akwizycji danych do rejestrowania i zapisywania współrzędnych pozycji lotów w okresie testowym.
W tym paradygmacie, obiekt jest wypuszczany na arenę, która zawiera zapach jedzenia w centrum; obiekt zapachu tworzy gradient zapachu jedzenia w arenie, który wywołuje zachowanie związane z poszukiwaniem jedzenia w locie. Podobny protokół poszukiwania zapachów został zastosowany do badania chemosensacji u pojedynczych larw Drosophila 7. Podczas gdy inne testy behawioralne, takie jak czteropolowy olfaktometr4,5 lub t-maze6, oceniają awersję do zapachów lub zachowania związane z przyciąganiem, ten paradygmat najlepiej nadaje się do oceny wrażliwości węchowej i zachowań chemotaksji.
Kilka kluczowych zalet towarzyszy temu testowi. Po pierwsze, pozwala na szybkie pozyskiwanie dużych zbiorów danych, ponieważ gromadzenie i analiza danych są w większości zautomatyzowane. Po drugie, test ten izoluje i mierzy zachowanie pojedynczych much, eliminując w ten sposób społeczne sygnały węchowe, które mogą wpływać na ich zachowanie. Po trzecie, prostota protokołu i prosty projekt eksperymentalny sprawiają, że test jest wydajny i łatwy do nauczenia innych.
Ponadto, ten test może być wykorzystany do dalszego badania obwodów neuronowych leżących u podstaw zachowań związanych z poszukiwaniem pożywienia, łącząc go z obszernym zestawem narzędzi genetycznych dostępnych dla Drosophila melanogaster8. Ukierunkowaną ekspresję transgenów, które wyciszają lub pobudzają neurony, można osiągnąć za pomocą narzędzi takich jak system GAL4-UAS, a także transgeny UAS-shibirets1, UAS-tetanus-toxin i UAS-TrpA1(B)9-12.

<table><tbody><tr><td>Ocet jabłkowy</td><td>Spectrum</td><td></td><td>dostępny na rynku</td></tr><tr><td>Agaroza, typ VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td> akrylowa płytka testowa <td>agarozy o niskiej temperaturze żelowania</td></tr><tr><td>niestandardowa</td><td>płytka</td><td></td><td>zawiera 6 aren. Każda arena ma średnicę 60 mm i 6 mm wysokości. Zobacz schematy płytek testowych, aby uzyskać szczegółowe pomiary.</td></tr><tr><td>Platforma LabVIEW V.8.5</td><td>National Instruments</td><td>776670-09</td><td>dla programów: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi UWAGA: "upłynęły time.vi", "czas do file.vi" i "dwa detect.vi obiektów" są dołączonymi podprogramami, które muszą być dostępne, aby główny program do akwizycji danych "FlyTracking--Six zones.vi" mógł działać.</td></tr><tr><td>LabVIEW Vision 8.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji LabVIEW Vision 8.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Vision Builder AI 3.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro V.6</td><td>Wavemetric, Inc.</td><td></td><td>platforma do makro: Analiza danych do śledzenia lotów - sześć stref</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy Basler scA1390-17fm</td><td>National Instruments</td><td>779980-01</td><td>UWAGA: sterownik do aparatu dostępny pod adresem Baslerweb.com</td></tr><tr><td>obiektyw 8 mm</td><td>National Instruments</td><td>780024-01</td><td>Obiektyw do aparatu cyfrowego Basler</td></tr><tr><td>Szlifowana szklana płyta dyfuzora</td><td>Edmund Optics</td><td>niestandardowy</td><td>Rozprasza światło, 25 cm x 30 cm</td></tr><tr><td>US Std. No. 100</td><td>Fischer Scientific</td><td>04-881X</td><td>Sito o nominalnym otwarciu 150 &mu; m</td></tr><tr><td colspan="4">Opcja oświetlenia 1</td></tr><tr><td>LED podświetlenie 660 nm (20 cm x 20 cm)</td><td>Spectra West</td><td>BL47192</td><td>prostsza, ale droższa opcja oświetlenia.</td></tr><tr><td>Zasilacz do podświetlenia LED</td><td>Spectra West</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Opcja oświetlenia 2</mocne></td></tr><tr><td>660 nm</td><td>Diody LED Superbrightleds</td><td>RL5R1330</td><td>Długość fali 660 nm (około 7 x 7 LED dla panelu 14,7 cala x 9,75 cala)</td></tr><tr><td>Liniowy zasilacz prądu stałego</td><td>GW Instek</td><td>GPS-1830D</td><td>Zasilacz do panelu LED</td></tr><tr><td>Bezlutownicza płytka stykowa</td><td>Digikey</td><td>922354-ND</td><td>Płytka stykowa do diod LED</td></tr></tbody></table>

test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

Dla wielu zwierząt, głód sprzyja zmianom w systemie węchowym w sposób, który ułatwia poszukiwanie odpowiednich źródeł pożywienia. W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pożywienia u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster. W szczelnym pudełku oświetlonym czerwonym światłem, które jest niewidoczne dla muszek owocowych, kamera połączona z niestandardowym oprogramowaniem do akwizycji danych monitoruje pozycję sześciu much jednocześnie. Każda mucha jest ograniczona do chodzenia po indywidualnych arenach, w których środku unosi się zapach jedzenia. Areny testowe spoczywają na porowatej podłodze, która zapobiega gromadzeniu się zapachów. Opóźnienie w zlokalizowaniu źródła zapachu, metryka, która odzwierciedla wrażliwość węchową w różnych stanach fizjologicznych, jest określana przez analizę oprogramowania. W tym miejscu omawiamy krytyczną mechanikę działania tego paradygmatu behawioralnego i omawiamy konkretne kwestie dotyczące obciążenia muchami, zanieczyszczenia zapachem, temperatury testu, jakości danych i analizy statystycznej.

Oprogramowanie do analizy danych i układ, którego przykład można zobaczyć na rysunku 1, są używane do oceny wydajności każdej muchy podczas jej 10-minutowej próby zgodnie z zestawem kryteriów analizy. Poniższe kryteria służą do określenia, czy dane z każdej muchy zostaną wykorzystane do analizy danych i mają na celu wyeliminowanie tych much, które nie są w stanie wykonać zadania wyszukiwania pożywienia z powodu urazu, choroby, stresu lub braku motywacji.
Muchy, które są nieakt...

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zmian behawioralnych wywołanych brakiem pożywienia u dorosłej muchy Salala Melanogaster. Osiąga się to poprzez pierwsze głodujące muchy przez 18 do 24 godzin. Drugim krokiem jest załadowanie pojedynczych much do komór behawioralnych, z których każda zawiera w swoim środku atrakcyjne źródło zapachu.Następnie system komputerowy z kamerą cyfrową śledzi pozycję każdej muchy w czasie i rejestruje. Jego współrzędne do późniejszej analizy danych. Ostatnim krokiem jest określenie opóźnienia każdej muchy, aby dotrzeć do źródła zapachu za pomocą niestandardowego oprogramowania.Ostatecznie ten wysokoprzepustowy test zachowań związanych z wyszukiwaniem żywności może być wykorzystany do badania związku między funkcją obwodów nerwowych a reakcjami behawioralnymi. Główną przewagą tego testu nad istniejącą metodą, podobnie jak w przypadku kolegów z zespołu, jest to, że określa ona ilościowo zachowanie chemotaktyczne u pojedynczych much. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania w neurobiologii, takie jak to, które obwody nerwowe są ważne dla zachowania chemotaktycznego i w jaki sposób te obwody nerwowe są moderowane przez wewnętrzny stan fizjologiczny zwierzęcia.Celem tej metody jest uzyskanie dużych zbiorów danych o zachowaniu w krótkim czasie. Chociaż ta metoda dała nam wgląd w zachowania związane z żerowaniem, może być również wykorzystana do badania innych zachowań, takich jak lokalizacja dokonywania. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.Właściwa obsługa muchy i uruchomienie oprogramowania komputerowego są niezbędne dla powodzenia tego eksperymentu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą na początku mieć trochę problemów, ponieważ potrzeba trochę czasu i cierpliwości, aby nauczyć się delikatnie obchodzić się z muchami, demonstrując, że procedura będzie przebiegać za pomocą igły. Skontaktuj się z technikiem w moim laboratorium przed pobraniem much.Hoduj eksperymentalne muchy w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności w 12-godzinnym cyklu jasnej ciemności. W dniu eksplozji EWG należy znieczulić muchy pod wpływem dwutlenku węgla, a następnie określić ich płeć pod mikroskopem. Aby rozróżnić mężczyzn i samice, można zastosować kilka podstawowych kryteriów.Samce mają plamę czarnego włosia na czterech nogach zwaną grzebieniami płciowymi, których samice nie mają. Ponadto czubek męskiego brzucha jest pokryty ciemnym naskórkiem i wyświetlanymi genitaliami niewidocznymi u samic, zbierz samice much i umieść je wraz z czterema do pięciu białookich samców w nowych pojemnikach pokarmowych z maksymalnie 30 muchami na wiek fiolki. Muchy przez dwa do pięciu dni przygotowują komory na głód much, najpierw wpychając pojedynczą tkankę na dno pustej plastikowej fiolki, a następnie całkowicie nasączając tkankę wodą destylowaną.Następnie za pomocą przedmiotu dociśnij tkankę i delikatnie wyciśnij nadmiar wody. Odwrócić fiolkę, aby usunąć nadmiar wody. Powinno być wystarczająco dużo wody, aby muchy były nawodnione, a komora głodowa wilgotna, ale nie wystarczająca, aby utopić muchy.Na około 18 do 24 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu przenieś muchy z fiolki z jedzeniem do komory głodowej i zatkaj fiolkę. Fiolki należy przechowywać przez noc w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności do czasu rozpoczęcia eksperymentu. Przygotuj 1% roztwór agro, dodając 100 miligramów aros o niskiej temperaturze topnienia do 10 mililitrów wody destylowanej.W szklanej kolbie. Podgrzej roztwór agro w kuchence mikrofalowej, aż zacznie wrzeć, ale zanim się wykipi, zatrzymaj kuchenkę mikrofalową i raz zakręć kolbą. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aż aros całkowicie się rozpuści.Utrzymywać roztwór Aros w stanie ciekłym, utrzymując kolbę w cieple na płycie grzejnej. Ustaw na 50 stopni Celsjusza, dodaj 990 mikrolitrów roztworu 1%aro i 10 mikrolitrów octu jabłkowego do 1,5 mililitrowej rurki DF. Aby przygotować 1% roztwór octu jabłkowego, należy mieszać roztwór do momentu wymieszania przed umieszczeniem w inkubatorze do suchej kąpieli ustawionym na 50 stopni Celsjusza, ustawić pomieszczenie testowe na żądane warunki, takie jak temperatura i wilgotność.Włącz panel LED o długości fali 660 nanometrów. Opłucz sita i płytki testowe gorącą wodą i podgrzej je w suszarce, aż cała wilgoć odparuje. Chłodny. Sita i płytki do temperatury w pomieszczeniu testowym.Przed rozpoczęciem eksperymentów umieść płytkie naczynie na płycie dyfuzora i napełnij je wodą, aby zwiększyć lokalną wilgotność i zamaskować wodę w kropli aros. Na koniec umieść sitka nad naczyniem na wodę. Płytka testowa wykonana jest z przezroczystego akrylu i składa się z sześciu aren testowych.Suwak zawiera komory przetrzymujące, które umożliwiają ładowanie w locie, tymczasowe zabezpieczenie i jednoczesne wypuszczenie sześciu much do odpowiednich komór. Na początku eksperymentu krzyżyk wytrawiony na środku każdej areny na płytce wskazuje, że należy pipetować substancje zapachowe. Włóż suwaki do akrylowej płytki testowej.Delikatnie wsuń aspirator do fiolki obok bawełnianej zatyczki i pozwól, aby około sześciu much weszło do aspiratora. Bardzo ważne jest, aby obchodzić się z nimi tak delikatnie, jak to tylko możliwe. Można skorzystać z taktyki fotograficznej, zachowania muchy, aby wywołać muchy, iść w kierunku aspiratora, kierując otwór fiolki w stronę słabego źródła światła.W razie potrzeby można zastosować delikatne ssanie, aby zassać około sześciu samic much. Unikaj wybierania białookich samców much. Włóż końcówkę aspiratora do pierwszego otworu płytki testowej.Pozwól, aby pojedyncza mucha przeszła do komórki trzymającej i delikatnie przesuń suwak do przodu, aby załadować kolejną muchę do następnego otworu. Kontynuuj, aż muchy. Zajmij wszystkie sześć komórek podtrzymujących płytkę.Następnie naniec pipetą pięć mikrolitrów 1% roztworu agarro octu jabłkowego bezpośrednio na środek krzyża nitkowego po wewnętrznej stronie płytki testowej. Aby wyśrodkować płytkę testową, otwórz plik o nazwie Narzędzie do pozycjonowania vi. Uruchom plik, klikając białą strzałkę w lewym górnym rogu ekranu.Umieść płytkę testową na górze sib tak, aby otwór areny był skierowany w stronę podłogi SIV, a cel zapachu znajdował się na suficie płyty. Po zakończeniu wyrównywania wyrównaj krzyż nitkowy płytki testowej z powietrzem poprzecznym na ekranie monitora. Przerwij wykonanie, klikając czerwoną kropkę znajdującą się w pobliżu lewego górnego rogu monitora, aby śledzić i rejestrować współrzędne lotu.Podczas każdej próby wyszukiwania żywności otwórz plik z oprogramowaniem do akwizycji. Śledzenie much sześć vi. Uruchom plik, klikając białą strzałkę w lewym górnym rogu monitora.Przypisz plikowi nazwę, a następnie kliknij przycisk OK. Przesuń suwaki w komorach testowych, aby wypuścić muchy na areny testowe. Uważaj, aby nie przesuwać komór testowych, ponieważ doprowadzi to do nieprawidłowego zapisu współrzędnych.Kliknij start i upewnij się, że jedynym źródłem światła w komorze testowej jest panel LED. Po zakończeniu próby wyjmij sito i komorę behawioralną. Zdejmij płytkę testową z sita i usuń muchy, zanurzając płytkę w lodzie.Delikatnie wyczyść talerz gorącą wodą i usuń wszelkie zanieczyszczenia agros. Umieść płytki testowe w suszarce w celu usunięcia wilgoci. Przewietrz obszar testowy, włączając mały wentylator na około dwie minuty.Wyłącz wentylator i załaduj następną grupę much na następną płytkę testową. Przejdź do analizy danych za pomocą niestandardowego oprogramowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Oprogramowanie do analizy danych i układ są wykorzystywane do oceny wydajności każdej muchy podczas jej 10-minutowej próby zgodnie z zestawem kryteriów analizy.Kryteria te służą do określenia, czy dane z każdej muchy zostaną wykorzystane do analizy danych i mają na celu wyeliminowanie tych much, które nie są w stanie wykonać zadania wyszukiwania pożywienia z powodu urazu, choroby, stresu lub braku motywacji, muchy, które są nieaktywne przez ponad 300 sekund, są uważane za nieaktywne i są odrzucane ze zbioru danych, chyba że udało im się już zlokalizować źródło pożywienia lub eksponat. Średnia prędkość większa niż 10 milimetrów na sekundę przez co najmniej 100 sekund po okresie nieaktywności, aby wybrać tylko te muchy, które wykazują zdrowe prędkości we wczesnych stadiach aktywnego zapachu. Muchy tylko do wyszukiwania, które poruszają się w określonym zakresie prędkości przez pierwsze 50 sekund próby, są akceptowane do analizy danych: muchy, które nie poruszają się przez wszystkie cztery ćwiartki na arenie i kierują się prosto do źródła pożywienia po rozpoczęciu próby, są odrzucane.Uważa się, że muchy, które lawirują w kierunku i od źródła pożywienia w promieniu 10 milimetrów przez co najmniej 50 sekund, pomyślnie znalazły źródło pożywienia. Wykres przedstawiający odległość muchy od źródła zapachu w czasie może być wykorzystany do oceny tego rzadkiego przypadku aren z widocznymi artefaktami w pozycji muchy. Ślady są również odrzucane.Artefakty mogą być tworzone przez dowolne zdarzenie, w którym oprogramowanie do akwizycji danych wykryje obiekt inny niż mucha. Często pojawiają się jako długie proste linie, które rozciągają się w poprzek areny lub rozchodzą się promieniście od jej środka. Dorosłe muchy głodzone od 18 do 24 godzin wykazują wyższą wrażliwość węchową na zapachy związane z żywnością niż ich karmione odpowiedniki.Wykres graficzny łącznego odsetka much, którym udało się zlokalizować źródło zapachu pokarmu, pokazuje, że 30% wszystkich wygłodzonych much udaje się w ciągu 10 minut. Natomiast tylko 7% wszystkich karmionych much tak robi. Wygłodzone muchy powinny wykazywać znacznie większą atrakcyjność dla octu niż dla samego pojazdu agros, a ta obserwacja może być wykorzystana do rozwiązywania problemów z warunkami testowymi.Na przykład, kiedy ten eksperyment z poszukiwaniem żywności, który został przeprowadzony w temperaturze 32 stopni Celsjusza przy wilgotności otoczenia 35% przy użyciu much dzikich typów, nie wykryto znaczącej różnicy między przyciąganiem much do octu a kontrolą aros, jest to prawdopodobnie spowodowane rosnącym przyciąganiem do wody znajdującej się w kropli agros w cieplejszych temperaturach testowych. Zwiększając wilgotność testową do poziomu od 50 do 60%, ta zmiana zachowania została skorygowana i przywrócono znaczącą różnicę między przyciąganiem do octu a pojazdem agros. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu 12 minut, w tym 10-minutowej próby eksperymentalnej, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby obchodzić się z muchami bardzo delikatnie, aby uniknąć ich zranienia lub niepokojenia. Należy pamiętać, że płytki testowe i sita mogą być bardzo gorące w suszarce, dlatego należy je usunąć podczas noszenia rękawic kuchennych po jego wywołaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania zachowań chemotaktycznych.Technikę tę można również zaadaptować do badania zdolności muchy do lokalizowania innych obiektów zapachowych. Na przykład, może być stosowany do badania zachowań lokalizacyjnych partnera u samców much. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować się do eksperymentu, dostosować warunki eksperymentu, przeprowadzić eksperyment i przeanalizować wydajność każdej muchy, co ostatecznie zapewni ci skumulowany wykres pokazujący odsetek much, którym udało się zlokalizować źródło zapachu.

a-single-fly-assay-for-foraging-behavior-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Samice Drosophila wybierają między substratami i wybierają miejsca, które są atrakcyjne do składania jaj. Ten film opisuje test behawioralny, który testuje ich podejmowanie decyzji, zwany testem preferencji składania jaj. Prezentowany klip demonstruje procedurę z niestandardową konfiguracją, która umożliwia naukowcom nie tylko testowanie zachowania wielu samic w tym samym czasie, ale jest również kompatybilna z nagrywaniem wideo i konfiguracjami optogenetycznymi.

Drosophila Test preferencji składania jaj: metoda testowania podejmowania decyzji u much

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia unikania osób zestresowanych. Ten paradygmat jest potężny, ale przyjazny dla użytkownika i może być wykorzystany do oceny wpływu genów i środowiska na jeden rodzaj interakcji społecznych u Drosophila melanogaster.

Prosty test do ilościowego oznaczania unikania społecznego u Drosophila melanogaster

Automatyczny system śledzenia Flywalk jest używany do wysokorozdzielczego oznaczania ilościowego zachowania kierowanego zapachem u Drosophila melanogaster.

Kwantyfikacja zachowania kierowanego zapachem w wysokiej rozdzielczości u Drosophila melanogaster przy użyciu paradygmatu Flywalk

Dostarczamy szczegółowy protokół do badania długości ścieżki żerowania Drosophila melanogaster. Omawiamy przygotowanie i postępowanie ze zwierzętami doświadczalnymi, sposób wykonywania testu i analizy danych.

Protokół długości ścieżki żerowania dla larw Drosophila melanogaster

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

Przedstawiamy protokół dla testu żywieniowego dla much z dwoma opcjami. Ten test żywieniowy jest szybki i łatwy do przeprowadzenia i nadaje się nie tylko do badań laboratoryjnych na małą skalę, ale także do wysokowydajnych badań behawioralnych u much.

Szybki test preferencji żywieniowych u Drosophila

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Ten protokół opisuje test behawioralny do rejestrowania zachowań związanych z wyszukiwaniem wywołanym cukrem za pomocą Drosophila melanogaster. Test może być wykorzystany do badania zachowań związanych z karmieniem i żerowaniem, a także leżących u ich podstaw mechanizmów neuronalnych.

Śledzenie lokalnych zachowań związanych z poszukiwaniami wywołanymi cukrem u Drosophila

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wiąże się z zaburzeniami zachowań społecznych i komunikacyjnych oraz pojawieniem się powtarzających się zachowań. W celu zbadania wzajemnych relacji między genami ASD a deficytami behawioralnymi w modelu Drosophila, w tym artykule opisano pięć paradygmatów behawioralnych do oceny odstępów społecznych, agresji, zalotów, pielęgnacji i zachowań habituacyjnych.

Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

Poznaj automatyczny test zachowań żerowych u Drosophila melanogaster w neurobiologii. Ta metoda pozwala mierzyć zmiany behawioralne wywołane głodem i badanie obwodów nerwowych.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów