Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zmian behawioralnych wywołanych brakiem pożywienia u dorosłej muchy Salala Melanogaster. Osiąga się to poprzez pierwsze głodujące muchy przez 18 do 24 godzin. Drugim krokiem jest załadowanie pojedynczych much do komór behawioralnych, z których każda zawiera w swoim środku atrakcyjne źródło zapachu.

Następnie system komputerowy z kamerą cyfrową śledzi pozycję każdej muchy w czasie i rejestruje. Jego współrzędne do późniejszej analizy danych. Ostatnim krokiem jest określenie opóźnienia każdej muchy, aby dotrzeć do źródła zapachu za pomocą niestandardowego oprogramowania.

Ostatecznie ten wysokoprzepustowy test zachowań związanych z wyszukiwaniem żywności może być wykorzystany do badania związku między funkcją obwodów nerwowych a reakcjami behawioralnymi. Główną przewagą tego testu nad istniejącą metodą, podobnie jak w przypadku kolegów z zespołu, jest to, że określa ona ilościowo zachowanie chemotaktyczne u pojedynczych much. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania w neurobiologii, takie jak to, które obwody nerwowe są ważne dla zachowania chemotaktycznego i w jaki sposób te obwody nerwowe są moderowane przez wewnętrzny stan fizjologiczny zwierzęcia.

Celem tej metody jest uzyskanie dużych zbiorów danych o zachowaniu w krótkim czasie. Chociaż ta metoda dała nam wgląd w zachowania związane z żerowaniem, może być również wykorzystana do badania innych zachowań, takich jak lokalizacja dokonywania. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.

Właściwa obsługa muchy i uruchomienie oprogramowania komputerowego są niezbędne dla powodzenia tego eksperymentu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą na początku mieć trochę problemów, ponieważ potrzeba trochę czasu i cierpliwości, aby nauczyć się delikatnie obchodzić się z muchami, demonstrując, że procedura będzie przebiegać za pomocą igły. Skontaktuj się z technikiem w moim laboratorium przed pobraniem much.

Hoduj eksperymentalne muchy w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności w 12-godzinnym cyklu jasnej ciemności. W dniu eksplozji EWG należy znieczulić muchy pod wpływem dwutlenku węgla, a następnie określić ich płeć pod mikroskopem. Aby rozróżnić mężczyzn i samice, można zastosować kilka podstawowych kryteriów.

Samce mają plamę czarnego włosia na czterech nogach zwaną grzebieniami płciowymi, których samice nie mają. Ponadto czubek męskiego brzucha jest pokryty ciemnym naskórkiem i wyświetlanymi genitaliami niewidocznymi u samic, zbierz samice much i umieść je wraz z czterema do pięciu białookich samców w nowych pojemnikach pokarmowych z maksymalnie 30 muchami na wiek fiolki. Muchy przez dwa do pięciu dni przygotowują komory na głód much, najpierw wpychając pojedynczą tkankę na dno pustej plastikowej fiolki, a następnie całkowicie nasączając tkankę wodą destylowaną.

Następnie za pomocą przedmiotu dociśnij tkankę i delikatnie wyciśnij nadmiar wody. Odwrócić fiolkę, aby usunąć nadmiar wody. Powinno być wystarczająco dużo wody, aby muchy były nawodnione, a komora głodowa wilgotna, ale nie wystarczająca, aby utopić muchy.

Na około 18 do 24 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu przenieś muchy z fiolki z jedzeniem do komory głodowej i zatkaj fiolkę. Fiolki należy przechowywać przez noc w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności do czasu rozpoczęcia eksperymentu. Przygotuj 1% roztwór agro, dodając 100 miligramów aros o niskiej temperaturze topnienia do 10 mililitrów wody destylowanej.

W szklanej kolbie. Podgrzej roztwór agro w kuchence mikrofalowej, aż zacznie wrzeć, ale zanim się wykipi, zatrzymaj kuchenkę mikrofalową i raz zakręć kolbą. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aż aros całkowicie się rozpuści.

Utrzymywać roztwór Aros w stanie ciekłym, utrzymując kolbę w cieple na płycie grzejnej. Ustaw na 50 stopni Celsjusza, dodaj 990 mikrolitrów roztworu 1%aro i 10 mikrolitrów octu jabłkowego do 1,5 mililitrowej rurki DF. Aby przygotować 1% roztwór octu jabłkowego, należy mieszać roztwór do momentu wymieszania przed umieszczeniem w inkubatorze do suchej kąpieli ustawionym na 50 stopni Celsjusza, ustawić pomieszczenie testowe na żądane warunki, takie jak temperatura i wilgotność.

Włącz panel LED o długości fali 660 nanometrów. Opłucz sita i płytki testowe gorącą wodą i podgrzej je w suszarce, aż cała wilgoć odparuje. Chłodny. Sita i płytki do temperatury w pomieszczeniu testowym.

Przed rozpoczęciem eksperymentów umieść płytkie naczynie na płycie dyfuzora i napełnij je wodą, aby zwiększyć lokalną wilgotność i zamaskować wodę w kropli aros. Na koniec umieść sitka nad naczyniem na wodę. Płytka testowa wykonana jest z przezroczystego akrylu i składa się z sześciu aren testowych.

Suwak zawiera komory przetrzymujące, które umożliwiają ładowanie w locie, tymczasowe zabezpieczenie i jednoczesne wypuszczenie sześciu much do odpowiednich komór. Na początku eksperymentu krzyżyk wytrawiony na środku każdej areny na płytce wskazuje, że należy pipetować substancje zapachowe. Włóż suwaki do akrylowej płytki testowej.

Delikatnie wsuń aspirator do fiolki obok bawełnianej zatyczki i pozwól, aby około sześciu much weszło do aspiratora. Bardzo ważne jest, aby obchodzić się z nimi tak delikatnie, jak to tylko możliwe. Można skorzystać z taktyki fotograficznej, zachowania muchy, aby wywołać muchy, iść w kierunku aspiratora, kierując otwór fiolki w stronę słabego źródła światła.

W razie potrzeby można zastosować delikatne ssanie, aby zassać około sześciu samic much. Unikaj wybierania białookich samców much. Włóż końcówkę aspiratora do pierwszego otworu płytki testowej.

Pozwól, aby pojedyncza mucha przeszła do komórki trzymającej i delikatnie przesuń suwak do przodu, aby załadować kolejną muchę do następnego otworu. Kontynuuj, aż muchy. Zajmij wszystkie sześć komórek podtrzymujących płytkę.

Następnie naniec pipetą pięć mikrolitrów 1% roztworu agarro octu jabłkowego bezpośrednio na środek krzyża nitkowego po wewnętrznej stronie płytki testowej. Aby wyśrodkować płytkę testową, otwórz plik o nazwie Narzędzie do pozycjonowania vi. Uruchom plik, klikając białą strzałkę w lewym górnym rogu ekranu.

Umieść płytkę testową na górze sib tak, aby otwór areny był skierowany w stronę podłogi SIV, a cel zapachu znajdował się na suficie płyty. Po zakończeniu wyrównywania wyrównaj krzyż nitkowy płytki testowej z powietrzem poprzecznym na ekranie monitora. Przerwij wykonanie, klikając czerwoną kropkę znajdującą się w pobliżu lewego górnego rogu monitora, aby śledzić i rejestrować współrzędne lotu.

Podczas każdej próby wyszukiwania żywności otwórz plik z oprogramowaniem do akwizycji. Śledzenie much sześć vi. Uruchom plik, klikając białą strzałkę w lewym górnym rogu monitora.

Przypisz plikowi nazwę, a następnie kliknij przycisk OK. Przesuń suwaki w komorach testowych, aby wypuścić muchy na areny testowe. Uważaj, aby nie przesuwać komór testowych, ponieważ doprowadzi to do nieprawidłowego zapisu współrzędnych.

Kliknij start i upewnij się, że jedynym źródłem światła w komorze testowej jest panel LED. Po zakończeniu próby wyjmij sito i komorę behawioralną. Zdejmij płytkę testową z sita i usuń muchy, zanurzając płytkę w lodzie.

Delikatnie wyczyść talerz gorącą wodą i usuń wszelkie zanieczyszczenia agros. Umieść płytki testowe w suszarce w celu usunięcia wilgoci. Przewietrz obszar testowy, włączając mały wentylator na około dwie minuty.

Wyłącz wentylator i załaduj następną grupę much na następną płytkę testową. Przejdź do analizy danych za pomocą niestandardowego oprogramowania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Oprogramowanie do analizy danych i układ są wykorzystywane do oceny wydajności każdej muchy podczas jej 10-minutowej próby zgodnie z zestawem kryteriów analizy.

Kryteria te służą do określenia, czy dane z każdej muchy zostaną wykorzystane do analizy danych i mają na celu wyeliminowanie tych much, które nie są w stanie wykonać zadania wyszukiwania pożywienia z powodu urazu, choroby, stresu lub braku motywacji, muchy, które są nieaktywne przez ponad 300 sekund, są uważane za nieaktywne i są odrzucane ze zbioru danych, chyba że udało im się już zlokalizować źródło pożywienia lub eksponat. Średnia prędkość większa niż 10 milimetrów na sekundę przez co najmniej 100 sekund po okresie nieaktywności, aby wybrać tylko te muchy, które wykazują zdrowe prędkości we wczesnych stadiach aktywnego zapachu. Muchy tylko do wyszukiwania, które poruszają się w określonym zakresie prędkości przez pierwsze 50 sekund próby, są akceptowane do analizy danych: muchy, które nie poruszają się przez wszystkie cztery ćwiartki na arenie i kierują się prosto do źródła pożywienia po rozpoczęciu próby, są odrzucane.

Uważa się, że muchy, które lawirują w kierunku i od źródła pożywienia w promieniu 10 milimetrów przez co najmniej 50 sekund, pomyślnie znalazły źródło pożywienia. Wykres przedstawiający odległość muchy od źródła zapachu w czasie może być wykorzystany do oceny tego rzadkiego przypadku aren z widocznymi artefaktami w pozycji muchy. Ślady są również odrzucane.

Artefakty mogą być tworzone przez dowolne zdarzenie, w którym oprogramowanie do akwizycji danych wykryje obiekt inny niż mucha. Często pojawiają się jako długie proste linie, które rozciągają się w poprzek areny lub rozchodzą się promieniście od jej środka. Dorosłe muchy głodzone od 18 do 24 godzin wykazują wyższą wrażliwość węchową na zapachy związane z żywnością niż ich karmione odpowiedniki.

Wykres graficzny łącznego odsetka much, którym udało się zlokalizować źródło zapachu pokarmu, pokazuje, że 30% wszystkich wygłodzonych much udaje się w ciągu 10 minut. Natomiast tylko 7% wszystkich karmionych much tak robi. Wygłodzone muchy powinny wykazywać znacznie większą atrakcyjność dla octu niż dla samego pojazdu agros, a ta obserwacja może być wykorzystana do rozwiązywania problemów z warunkami testowymi.

Na przykład, kiedy ten eksperyment z poszukiwaniem żywności, który został przeprowadzony w temperaturze 32 stopni Celsjusza przy wilgotności otoczenia 35% przy użyciu much dzikich typów, nie wykryto znaczącej różnicy między przyciąganiem much do octu a kontrolą aros, jest to prawdopodobnie spowodowane rosnącym przyciąganiem do wody znajdującej się w kropli agros w cieplejszych temperaturach testowych. Zwiększając wilgotność testową do poziomu od 50 do 60%, ta zmiana zachowania została skorygowana i przywrócono znaczącą różnicę między przyciąganiem do octu a pojazdem agros. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu 12 minut, w tym 10-minutowej próby eksperymentalnej, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby obchodzić się z muchami bardzo delikatnie, aby uniknąć ich zranienia lub niepokojenia. Należy pamiętać, że płytki testowe i sita mogą być bardzo gorące w suszarce, dlatego należy je usunąć podczas noszenia rękawic kuchennych po jego wywołaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania zachowań chemotaktycznych.

Technikę tę można również zaadaptować do badania zdolności muchy do lokalizowania innych obiektów zapachowych. Na przykład, może być stosowany do badania zachowań lokalizacyjnych partnera u samców much. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować się do eksperymentu, dostosować warunki eksperymentu, przeprowadzić eksperyment i przeanalizować wydajność każdej muchy, co ostatecznie zapewni ci skumulowany wykres pokazujący odsetek much, którym udało się zlokalizować źródło zapachu.