Name: Optyczne wykrywanie bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj metodę optycznego wykrywania bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych z przeciwciałami monoklonalnymi. Technika umożliwia szybką detekcję bez konieczności uprzedniego przygotowania próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Izraelską Fundację Naukową (grant nr 1118/08 i grant nr 1146/12) oraz Minna Kroll Memorial Research Fund. E.S z wdzięcznością dziękuje za wsparcie finansowe Instytutu Nanotechnologii Russell Berrie.

1. Przygotowanie utlenionego porowatego SiO2
<ol>
	<li>Wafle Si (jednostronnie polerowane na powierzchni <100> i mocno domieszkowane, typu p, 0,0008 Ω cm) w roztworze wodnego HF i absolutnego etanolu o proporcjach 3:1 (v/v) przez 30 sEC przy stałej gęstości prądu 385 mA/cm2. Należy pamiętać, że HF jest cieczą silnie i należy obchodzić się z nią z najwyższą ostrożnością.</li>
	<li>Kilkakrotnie spłukać powierzchnię powstałej porowatej warstwy krzemu (PSi) absolutnym etanolem; wysuszyć folie pod suchym gazowym azotem.</li>
	<li>Świeżo wytrawione próbki PSi utleniać w piecu rurowym w temperaturze 800 °C przez 1 godzinę w otaczającym powietrzu (umieścić próbkę w piecu w temperaturze pokojowej, ogrzać piec do 800 °C, pozostawić w piecu na 1 godzinę, wyłączyć piec i wyjmować próbki z pieca tylko w temperaturze pokojowej).</li>
</ol>
2. Biofunkcjonalizacja rusztowań PSiO2
<ol>
	<li>Inkubować utlenioną próbkę PSi (PSiO2) przez 1 godzinę w 95% (MPTS) roztworze merkaptopropylu (trimetoksysilanu-3) (108 mM w toluenie).</li>
	<li>Przepłukać próbkę PSiO2 poddaną działaniu silanu toluenem, metanolem i acetonem; wysuszyć w suchym gazowym azocie.</li>
	<li>Próbkę PSiO2 modyfikowaną silanem inkubować przez 30 minut w 1 ml 100 mM roztworu biotyny PEO-jodoacetylowej.</li>
	<li>Próbkę PSiO2 nasączoną biotyną przepłukać kilkakrotnie 0,1 M roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).</li>
	<li>Próbkę PSiO2 modyfikowaną biotyną inkubować przez 30 minut w 1 ml roztworu streptawidyny (SA) o stężeniu 100 μg/ml.</li>
	<li>Kilkakrotnie przepłukać próbkę PSiO2 poddaną działaniu SA roztworem 0,1 M PBS.</li>
	<li>Otrzymaną próbkę PSiO2 modyfikowaną SA inkubować przez 30 minut w 1 ml roztworu 100 μg/ml biotynylowanego przeciwciała monoklonalnego E. coli (immunoglobulina G, IgG) lub w 100 μg/ml biotynylowanej króliczej IgG (jako model przeciwciała monoklonalnego).</li>
</ol>
3. Znakowanie fluorescencyjne i mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Inkubować powierzchnie zmodyfikowane IgG z 15 μg/ml fluoresceiny (FITC) znakowanej anty króliczą IgG przez 40 minut i z 15 μg/ml fluoresceiny (FITC) znakowanej anty mysią IgG jako kontrolą.</li>
	<li>Przepłukać zmodyfikowane próbki kilkakrotnie roztworem 0,1 M PBS.</li>
	<li>Zbadaj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
4. Kultura bakterii
<ol>
	<li>Hoduj bakterie E. coli K12 w probówce o pojemności 10 ml z 5 ml pożywki Luria Bertani (LB) (skład pożywki w 1 l wody dejonizowanej: 5 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g tryptonu). Inkubować bakterie przez noc, wstrząsając w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Monitoruj stężenie bakterii, odczytując gęstość optyczną (OD) przy długości fali 600 nm. Po całonocnym wzroście w pożywce LB odczytaj OD600 za pomocą spektrofotometru, aby określić stężenie bakterii. Liczba komórek jest wprost proporcjonalna do pomiarów OD600 (1 OD600 = 108 komórek/ml).</li>
</ol>
5. Wykrywanie bakterii
<ol>
	<li>Umieść zmodyfikowane IgG próbki PSiO2 i schludne PSiO2 (jako kontrolne) w specjalnie wykonanej komorze przepływowej z pleksiglasu. Zamocuj celę przepływową, aby upewnić się, że współczynnik odbicia próbki jest mierzony w tym samym miejscu podczas wszystkich pomiarów.</li>
	<li>Próbki inkubować z zawiesiną E. coli K12 (10-4 komórki/ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń zawiesinę bakterii, przepłukując komórkę 0,85% w/v roztworem soli fizjologicznej przez 30 minut.</li>
	<li>Monitoruj zmiany w danych dotyczących współczynnika odbicia przez cały czas trwania eksperymentu. Wszystkie pomiary optyczne należy przeprowadzać w otoczeniu wodnym. Widma należy zbierać za pomocą spektrometru CCD i analizować za pomocą szybkiej transformaty Fouriera (FFT), jak opisano wcześniej25,26 .</li>
	<li>Potwierdź obecność bakterii na powierzchni biosensora, obserwując próbki pod pionowym mikroskopem świetlnym natychmiast po eksperymencie z biodetekcją.</li>
</ol>

<ol><li>Velusamy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+foodborne+pathogen+detection%3A+In+the+perspective+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors.</a> Biotechnol. Adv. 28 (2), 232-23 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Food+Microbiol.%3A+Fundamentals+and+Front%22">Food Microbiol.: Fundamentals and Front</a>. Doyle, M. P., Beuchat, L. R., Montville, T. J. 2, ASM Press. Washington. (2001).</li>
<li>Radke, S. M., Alocilja, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+biosensor+for+detecting+foodborne+bioterrorism+agents%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Sens.+J%22%5BJournal%5D)">A microfabricated biosensor for detecting foodborne bioterrorism agents.</a> IEEE Sens. J. 5 (4), 744(2005).</li>
<li>Glynn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+emerging+molecular+diagnostic+technologies+applicable+to+bacterial+food+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+of+Dairy+Technol%22%5BJournal%5D)">Current and emerging molecular diagnostic technologies applicable to bacterial food safety.</a> Int. J. of Dairy Technol. 59 (2), 126(2006).</li>
<li>Leonard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+biosensors+for+detection+of+pathogens+in+food+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb.+Technol%22%5BJournal%5D)">Advances in biosensors for detection of pathogens in food and water.</a> Enzyme Microb. Technol. 32 (1), 3(2003).</li>
<li>Alvarez, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+porous+silicon+photonic+crystal+for+bacterial+cell-based+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+Status+Solidi+a-Applications+and+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Using a porous silicon photonic crystal for bacterial cell-based biosensing.</a> Physica Status Solidi a-Applications and Materials Science. 204 (5), 1439(2007).</li>
<li>Archer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+porous+silicon+microarray+for+DNA+hybridization+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Micro-+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Electrical porous silicon microarray for DNA hybridization detection.</a> Micro- and Nanosystems. 782, 385(2004).</li>
<li>Chan, S., Horner, S. R., Fauchet, P. M., Miller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Gram+Negative+Bacteria+Using+Nanoscale+Silicon+Microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Identification of Gram Negative Bacteria Using Nanoscale Silicon Microcavities.</a> J. Am. Chem. Soc. 123, 11797(2001).</li>
<li>Dancil, K. -P. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J. Development of a Porous Silicon Based Biosensor. Canham, L. T., Sailor, M. J., Tanaka, K., Tsai, C. C. Proceedings of the Mat. Res. Soc. Symp, Boston, MA, 536, 557-562 (1999).</li>
<li>D'Auria, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+silicon-based+biosensors+for+the+selective+identification+of+analytes+of+social+interest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+-+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">Nanostructured silicon-based biosensors for the selective identification of analytes of social interest.</a> J Phys - Condens Matter. 18 (33), S2019(2006).</li>
<li>de Leon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+culturing+and+biophotonic+sensing+using+porous+silicon%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Neurons culturing and biophotonic sensing using porous silicon.</a> Appl Phys Lett. 84 (22), 4361(2004).</li>
<li>Janshoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+p-type+silicon+Fabry-Perot+layers.+Fabrication%2C+characterization%2C+and+applications+in+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Macroporous p-type silicon Fabry-Perot layers. Fabrication, characterization, and applications in biosensing.</a> J. Am. Chem. Soc. 120 (46), 12108(1998).</li>
<li>Orosco, M. M., Pacholski, C., Miskelly, G. M., Sailor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-coated+porous+silicon+photonic+crystals+for+amplified+optical+detection+of+protease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Protein-coated porous silicon photonic crystals for amplified optical detection of protease activity.</a> Adv. Mater. 18, 1393(2006).</li>
<li>Pacholski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+using+porous+silicon+double-layer+interferometers%3A+reflective+interferometric+Fourier+transform+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biosensing using porous silicon double-layer interferometers: reflective interferometric Fourier transform spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (33), 11636(2005).</li>
<li>Pacholski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflective+Interferometric+Fourier+Transform+Spectroscopy%3A+A+Self-Compensating+Label-Free+Immunosensor+Using+Double-layers+of+Porous+SiO2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Reflective Interferometric Fourier Transform Spectroscopy: A Self-Compensating Label-Free Immunosensor Using Double-layers of Porous SiO2.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 4250(2006).</li>
<li>Sailor, M. J., Link, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+Dust%3A+nanostructured+devices+in+a+grain+of+sand%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Smart Dust: nanostructured devices in a grain of sand.</a> Chem. Comm. , 1375(2005).</li>
<li>Schwartz, M. P., Alvarez, S. D., Sailor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+SiO2+interferometric+biosensor+for+quantitative+determination+of+protein+interactions%3A+Binding+of+protein+a+to+immunoglobulins+derived+from+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Porous SiO2 interferometric biosensor for quantitative determination of protein interactions: Binding of protein a to immunoglobulins derived from different species.</a> Anal. Chem. 79 (1), 327(2007).</li>
<li>Schwartz, M. ichaelP., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smart+petri+dish%3A+A+nanostructured+photonic+crystal+for+real-time+monitoring+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">The smart petri dish: A nanostructured photonic crystal for real-time monitoring of living cells.</a> Langmuir. 22, 7084(2006).</li>
<li>Stewart, M. P., Buriak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+applications+of+porous+silicon+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological applications of porous silicon technology.</a> Adv. Mater. 12 (12), 859(2000).</li>
<li>Zhang, D., Alocilja, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+nanoporous+silicon-based+DNA+biosensor+for+the+detection+of+Salmonella+enteritidis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Sens+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of nanoporous silicon-based DNA biosensor for the detection of Salmonella enteritidis.</a> IEEE Sens J. 8 (5-6), 775(2008).</li>
<li>Bonanno, L. M., Segal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+porous+silicon-polymer-based+hybrids%3A+from+biosensing+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanostructured porous silicon-polymer-based hybrids: from biosensing to drug delivery.</a> Nanomedicine. 6 (10), 1755(2011).</li>
<li>Jane, A., Dronov, R., Hodges, A., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+silicon+biosensors+on+the+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Porous silicon biosensors on the advance.</a> Trends Biotechnol. 27 (4), 230(2009).</li>
<li>Li, S., Huang, J., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+silicon+optical+microcavity+for+sensitive+bacteria+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A porous silicon optical microcavity for sensitive bacteria detection.</a> Nanotechnology. 22 (42), 425502(2011).</li>
<li>Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Segal, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMassad-Ivanir%2C+N+%22Nano+Bio-Technology+for+Biomedical+and+Diagnostics+Research%22">Nano Bio-Technology for Biomedical and Diagnostics Research</a>. Zahavy, E., Ordentlich, A., Yitzhaki, S., Shafferman, A. 733, Springer. Netherlands. (2012).</li>
<li>Massad-Ivanir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Nanostructured+Porous+SiO2+Surfaces+for+Bacteria+Detection+via+%22Direct+Cell+Capture%22%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineering Nanostructured Porous SiO2 Surfaces for Bacteria Detection via "Direct Cell Capture".</a> Anal. Chem. 83 (9), 3282-32 (2011).</li>
<li>Massad-Ivanir, N., Shtenberg, G., Zeidman, T., Segal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+porous+SiO2%2Fhydrogel+hybrids+as+optical+biosensors+for+rapid+detection+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of porous SiO2/hydrogel hybrids as optical biosensors for rapid detection of bacteria.</a> Adv Funct Mater. 20 (14), 2269-22 (2010).</li>
<li>Mathew, F. P., Alocilja, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+silicon-based+biosensor+for+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Porous silicon-based biosensor for pathogen detection.</a> Biosens. Bioelectron. 20 (8), 1656(2005).</li>
<li>Ouyang, H., Archer, M., Fauchet, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOuyang%2C+H+%22Frontiers+in+Surface+Nanophotonics%22">Frontiers in Surface Nanophotonics</a>. 133, 49(2007).</li>
<li>Ouyang, H., DeLouise, L. A., Miller, B. L., Fauchet, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+detection+of+protein+using+macroporous+silicon+photonic+bandgap+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative detection of protein using macroporous silicon photonic bandgap biosensors.</a> Anal. Chem. 79 (4), 1502-15 (2007).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , 1st, Academic Press. (1996).</li>
<li>Piervincenzi, R. T., Reichert, W. M., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+a+single-chain+antibody+fragment+for+surface+immobilization+in+an+optical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor.</a> Biosensors and Bioelectronics. 13 (3-4), 305(1998).</li>
<li>Saerens, D., Huang, L., Bonroy, K., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Fragments+as+Probe+in+Biosensor+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Antibody Fragments as Probe in Biosensor Development.</a> Sensors. 8 (8), 4669(2008).</li>
<li>Shtenberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picking+up+the+Pieces%3A+A+Generic+Porous+Si+Biosensor+for+Probing+the+Proteolytic+Products+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes.</a> Anal. Chem. 85 (3), 1951(2013).</li>
<li>Bonanno, L. M., DeLouise, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steric+Crowding+Effects+on+Target+Detection+in+an+Affinity+Biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Steric Crowding Effects on Target Detection in an Affinity Biosensor.</a> Langmuir. 23 (10), 5817(2007).</li>
<li>Banada, P. P., Bhunia, A. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanada%2C+PP+%22Principles+of+Bacterial+Detection%3A+Biosensors%2C+Recognition+Receptors+and+Microsystems%22">Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems</a>. Mohammed, E., Zourob, S., Turner, A. P. F. , Springer. 567(2008).</li>
<li>Poma, A., Whitcombe, M., Piletsky, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoma%2C+A+%22Designing+receptores+for+the+next+generation+of+biosensors%22">Designing receptores for the next generation of biosensors</a>. Whitcombe, M. J., Piletsky, S. A. , Springer. 105(2013).</li>
<li>Dudak, F. C., Boyaci, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immunosensor+based+on+surface+plasmon+resonance+for+enumeration+of+Escherichia+coli+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Development of an immunosensor based on surface plasmon resonance for enumeration of Escherichia coli in water samples.</a> Food Res. Int. 40 (7), 803(2007).</li>
<li>Dudak, F. C., Boyaci, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+label-free+bacteria+detection+by+surface+plasmon+resonance+%28SPR%29+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechn+J%22%5BJournal%5D)">Rapid and label-free bacteria detection by surface plasmon resonance (SPR) biosensors.</a> Biotechn J. 4 (7), 1003(2009).</li>
<li>Skottrup, P. D., Nicolaisen, M., Justesen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+on-site+pathogen+detection+using+antibody-based+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Towards on-site pathogen detection using antibody-based sensors.</a> Biosens. Bioelectron. 24 (3), 339(2008).</li>
<li>Taylor, A. D., Ladd, J., Homola, J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+AD+%22Principles+of+Bacterial+Detection%3A+Biosensors%2C+Recognition+Receptors+and+Microsystems%22">Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems</a>. , Springer. 83(2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Wytwarzany jest bezznacznikowy optyczny czujnik immunologiczny, oparty na nanostrukturze PSiO2 (cienkiej warstwie Fabry'ego-Pérota), który potwierdza jego potencjalną przydatność jako bioczujnika do wykrywania bakterii.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Jednym z głównych problemów podczas projektowania immunosensora jest podatność przeciwciał na niepożądane zmiany konformacji podczas osadzania i modelowania na podłożu stałym, co może prowadzić do zmniejs...

Wczesna i dokładna identyfikacja bakterii chorobotwórczych jest niezwykle ważna dla bezpieczeństwa żywności i wody, monitorowania środowiska i diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem1. Ponieważ tradycyjne techniki mikrobiologiczne są czasochłonne, pracochłonne i nie mają możliwości wykrywania mikroorganizmów w "czasie rzeczywistym" lub poza środowiskiem laboratoryjnym, bioczujniki ewoluują, aby sprostać tym wyzwaniom2-5.
W ostatnich latach porowaty Si (PSi) okazał się obiecującą platformą do projektowania czujników i biosensorów6-20. W ciągu ostatniej dekady opublikowano liczne badania dotyczące czujników optycznych i biosensorów opartych na PSi21,22. Nanostrukturalna warstwa PSi jest zwykle wytwarzana przez elektrochemiczne trawienie anodowe z monokrystalicznej płytki krzemowej. Powstałe w ten sposób nanomateriały PSi wykazują wiele korzystnych cech, takich jak duża powierzchnia i swobodna objętość, kontrolowane rozmiary porów oraz regulowane właściwości optyczne10,16. Na właściwości optyczne warstwy PSi, takie jak fotoluminescencja8,11 i interferometria oparta na odbiciu światła białego7,19, duży wpływ mają warunki środowiskowe. Wychwycenie cząsteczek gościnnych/docelowych analitów w warstwie porowatej powoduje zmianę średniego współczynnika załamania światła folii, obserwowaną jako modulację w widmie fotoluminescencji lub jako przesunięcie długości fali w widmie odbicia10.
Chociaż jest to ogromna innowacja w technologii biosensorów optycznych PSi, istnieje tylko kilka doniesień na temat platform opartych na PSi do wykrywania bakterii6,8,20,23-29. Ponadto większość z tych badań potwierdzających słuszność koncepcji wykazała "pośrednie" wykrywanie bakterii. W związku z tym na ogół wymagana jest wcześniejsza liza komórek w celu ekstrakcji docelowych fragmentów białka/DNA, charakterystycznych dla badanych bakterii29. Nasze podejście polega na bezpośrednim wychwytywaniu docelowych komórek bakteryjnych do biosensora PSi. Dlatego przeciwciała monoklonalne, które są specyficzne dla bakterii docelowych, są unieruchamiane na porowatej powierzchni. Wiązanie komórek bakteryjnych, poprzez oddziaływania przeciwciało-antygen, z powierzchnią biosensora indukuje zmiany amplitudy (intensywności) widma odbicia24-26.
W tej pracy opisujemy budowę optycznego biosensora opartego na PSi i demonstrujemy jego zastosowanie jako bezetykietowej platformy biosensorycznej do wykrywania bakterii Escherichia coli (E. coli) K12 (używanej jako mikroorganizm modelowy). Monitorowany sygnał optyczny to światło odbite od nanostruktury PSi w wyniku interferencji cienkowarstwowej Fabry'ego-Pérota (ryc. 1A). Zmiany amplitudy/natężenia światła są skorelowane ze specyficznym unieruchomieniem docelowych komórek bakteryjnych na powierzchni biosensora, co pozwala na szybkie wykrycie i kwantyfikację bakterii.

<table><tbody><tr><td>Si wafel</td><td>Siltronix Corp.</td><td></td><td>Wysoce domieszkowany B, typ p, rezystywność 0,0008 &Omega;-cm, < 100> zorientowany</td></tr><tr><td>wodny HF (48%)</td><td>Merck</td><td>101513</td><td></td></tr><tr><td>absolutny roztwór buforowy</td><td>etanolu Merck</td><td>818760</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4)</td><td></td><td></td> <td>przygotowany przez rozpuszczenie 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4 i 68 mM NaCl w wodzie Milli-Q (18,2 M&Omega;)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna 0,85% w/v</td><td></td><td></td><td>przygotowana przez rozpuszczenie 0,85 g NaCl w 100 ml wody Milli-Q (18,2 M&Omega;)</td></tr><tr><td>95% (3-merkaptopropylo)trimetoksysilan (MPTS)</td><td>Sigma Aldrich Chemicals</td><td>175617</td><td></td></tr><tr><td>PEO-jodoacetylobiotyna</td><td>Sigma Aldrich Chemicals</td><td>B2059</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna (SA)</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>016-000-114</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina (DTAF)-streptawidyna</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>016-010-084</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany królik IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>011-060-003</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjnie oznakowany anty-króliczy IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>111-095-003</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjnie oznakowany anty-mysi IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>115-095-003</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało E. coli</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs Inc.</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (K-12)</td><td></td><td></td> <td>został hojnie dostarczony przez prof. Simę Yaron, Technion</td></tr></tbody></table>

optyczne wykrywanie bakterii e. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Bezznacznikowy biosensor optyczny oparty na nanostrukturalnym porowatym krzemie jest przeznaczony do szybkiego wychwytywania i wykrywania bakterii Escherichia coli K12, jako mikroorganizmu modelowego. Biosensor opiera się na bezpośrednim wiązaniu docelowych komórek bakteryjnych na swojej powierzchni, przy czym nie jest wymagana żadna obróbka wstępna (np. poprzez lizę komórek) badanej próbki. Mezoporowata cienka warstwa krzemu jest używana jako element przetwornika optycznego biosensora. W oświetleniu światłem białym warstwa porowata wykazuje dobrze rozdzielone wzory prążków Fabry'ego-Pérota w swoim spektrum odbicia. Zastosowanie szybkiej transformaty Fouriera (FFT) do danych dotyczących współczynnika odbicia powoduje powstanie pojedynczego piku. Zmiany intensywności piku FFT są monitorowane. W ten sposób wychwytywanie docelowych bakterii na powierzchni biosensora, poprzez interakcje przeciwciało-antygen, indukuje mierzalne zmiany w intensywności pików FFT, umożliwiając obserwację przyczepiania się bakterii w czasie rzeczywistym.
Mezoporowaty film Si, wytwarzany w procesie anodyzacji elektrochemicznej, jest sprzężony z przeciwciałami monoklonalnymi, specyficznymi dla docelowej bakterii. Unieruchomienie, immunoaktywność i swoistość przeciwciał są potwierdzone w eksperymentach znakowania fluorescencyjnego. Gdy bioczujnik zostanie wystawiony na działanie docelowych bakterii, komórki są bezpośrednio wychwytywane na zmodyfikowanej przeciwciałami porowatej powierzchni krzemu. Te specyficzne zdarzenia przechwytywania powodują zmiany intensywności w cienkowarstwowym widmie zakłóceń optycznych biosensora. Wykazaliśmy, że te bioczujniki mogą wykrywać stosunkowo niskie stężenia bakterii (granica wykrywalności10-4 komórek/ml) w czasie krótszym niż godzina.

Utlenione filmy PSi (PSiO2) są przygotowywane zgodnie z opisem w sekcji Tekst Protokołu. Rysunek 1B przedstawia wysokorozdzielczą mikrografię z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektronowego otrzymanego filmu PSi po utlenianiu termicznym. Warstwa PSiO2 charakteryzuje się wyraźnie zdefiniowanymi porami cylindrycznymi o średnicy w zakresie 30-80 nm.
Cząsteczki przeciwciał monoklonalnych (IgG) są szczepione na powierzchnie PSiO2 przy użyciu ...

Wprowadzono bezetykietowy optyczny biosensor do szybkiego wykrywania bakterii. Bioczujnik oparty jest na nanostrukturalnym porowatym krzemie, który został zaprojektowany tak, aby bezpośrednio wychwytywać docelowe komórki bakteryjne na swojej powierzchni. Używamy przeciwciał monoklonalnych, unieruchomionych na porowatym przetworniku, jako sond wychwytujących. Nasze badania pokazują możliwość zastosowania tych bioczujników do wykrywania niskich stężeń bakterii w ciągu kilku minut bez wcześniejszego przetwarzania próbki (takiej jak liza komórek).

Optyczne wykrywanie bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zaprojektowanie bezetykietowego biosensora optycznego do szybkiego wykrywania bakterii w oparciu o nanostrukturalny porowaty krzem. Osiąga się to poprzez skonstruowanie utlenionego porowatego krzemu, który ma być stosowany jako element przetwornika optycznego biosensora. W drugim etapie specyficzne sondy wychwytujące, takie jak przeciwciała, są unieruchamiane na porowatej powierzchni, aby zapewnić aktywny składnik bioczujnika.Następnie bioczujnik jest wystawiany na działanie bakterii docelowych w celu bezpośredniego wychwycenia komórek bakteryjnych na przeciwciało. Uzyskuje się zmodyfikowane wyniki utlenionej porowatej powierzchni krzemu, które pokazują zmiany intensywności w cienkowarstwowym widmie zakłóceń optycznych biosensora. Ze względu na wychwytywanie bakterii stosuje się mikroskopię świetlną w celu potwierdzenia obecności bakterii na powierzchni biosensora.Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalne hodowle i techniki, jest to, że nasza metoda wykrywa obecność bakterii w bardzo szybki sposób w czasie krótszym niż godzina. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów związanych z monitorowaniem środowiska określonych mikroorganizmów, a także w zapewnieniu bezpieczeństwa wody i żywności. Umożliwia również wykrywanie określonych gatunków bakterii w czasie rzeczywistym i w miejscu opieki nad pacjentem: Aby rozpocząć wytrawianie wafli krzemowych w roztworze wodnego fluorowodoru i etanolu trzy do jednego przez 30 sekund przy stałej gęstości prądu 385 miliamperów na centymetr kwadratowy.Należy pamiętać, że fluorowodór jest silnie cieczą i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością. Kilkakrotnie spłucz powierzchnię powstałej słabej warstwy silikonowej etanolem. Następnie wysuszyć folie pod suchym gazowym azotem, a następnie utlenić świeżo wytrawione porowate próbki krzemu w piecu rurowym w temperaturze 800 stopni Celsjusza przez godzinę w otaczającym powietrzu.Aby biofunkcjonalizować utlenioną porowatą próbkę krzemu, najpierw inkubuj folię przez godzinę i 95% roztwór MPTS. Po przepłukaniu toluenem, metanolem i acetonem wysuszyć utlenioną porowatą próbkę krzemu poddaną działaniu sinusoidy w suchym gazowym azocie. Następnie inkubuj próbkę zmodyfikowaną sinusoidą w jednym mililitrze 100-milimolowego roztworu PEOI oto acetylobiotyny przez 30 minut.Otrzymaną próbkę potraktowaną biotyną przepłukać kilkakrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym 0,1 molowym fosforanem lub roztworem PBS. Następnie inkubować próbkę przez 30 minut w jednym mililitrze 100 mikrogramów na mililitr roztworu dowodowego paciorkowca, a następnie kilkakrotnie spłukać ją roztworem PBS. Następnie inkubować zmodyfikowaną streptawidyną utlenioną porowatą próbkę krzemu przez 30 minut w jednym mililitrze 100 mikrogramów na mililitr, biotynylowanym E coli, monoklonalnym przeciwciałie IgG lub w 100 mikrogramach na mililitr.Biotynylowane królicze IgG do fluorescencyjnego znakowania rusztowania. Inkubować powierzchnie zmodyfikowane IgG z 15 mikrogramami na mililitr. Fluoresceina oznaczana anty króliczą IgG przez 40 minut.Inkubować z 15 mikrogramami na mililitr. Fluoresceina oznaczona anty-US IgG jako kontrola. Zbadać próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym po kilkukrotnym przepłukaniu zmodyfikowanych próbek roztworem PBS.Hoduj bakterie e coli K 12 w 10-mililitrowej probówce z pięcioma mililitrami pożywki luria britani lub LB. Inkubuj bakterie przez noc, wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza po całonocnym wzroście. W ośrodku LB odczytaj gęstość optyczną przy długości fali 600 nanometrów lub OD 600 za pomocą spektrofotometru w celu określenia stężenia bakterii.Liczba komórek jest wprost proporcjonalna do pomiaru OD 600. Miejsce. Zmodyfikowane IgG utlenione porowate rusztowania krzemowe i kontrola. Czyste, utlenione porowate próbki krzemu w specjalnie wykonanej kumorze przepływowej z pleksiglasu.Zamocuj celę przepływową, aby upewnić się, że współczynnik odbicia próbki jest mierzony w tym samym miejscu podczas wszystkich pomiarów. Inkubować próbki z zawiesiną Coli K 12 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń zawiesinę bakterii, przepłukując komórkę solą fizjologiczną o masie 0,85% na objętość przez 30 minut.Monitoruj zmiany w danych dotyczących współczynnika odbicia w trakcie eksperymentu na spektrometrze CCD. Wszystkie pomiary optyczne należy przeprowadzić w otoczeniu wodnym po zebraniu widm na spektrometrze CCD analizowanym przez zastosowanie szybkiej transformaty czterech uszu. Na koniec potwierdź obecność bakterii na powierzchni biosensora, obserwując próbki pod pionowym mikroskopem świetlnym bezpośrednio po eksperymencie z biodetekcją.Pokazano tutaj skaningowy mikroskop elektronowy o wysokiej rozdzielczości porowatych warstw krzemu po utlenianiu termicznym. Utleniona porowata warstwa krzemu charakteryzuje się dobrze zdefiniowanymi cylindrycznymi porami o średnicy w zakresie od 30 do 80 nanometrów. Przyłączenie przeciwciał do utlenionej porowatej powierzchni krzemu potwierdza się przez znakowanie fluorescencyjne, a następnie obserwację powierzchni pod mikroskopem fluorescencyjnym.Ponadto badania fluorescencyjne pozwalają na scharakteryzowanie aktywności i swoistości antygenowej przeciwciał unieruchomionych powierzchniowo poprzez wiązanie znakowanych fluorescencyjnie anty króliczych IgG i anty mysich IgG jako kontroli. Pokazano również eksperyment kontrolny bez IgG, aby zademonstrować bakterie biowykrywające zmiany amplitudy lub intensywności światła odbitego od utlenionej porowatej nanostruktury krzemowej są monitorowane szybko dla twojego widma transformacji biosensora przed i po wprowadzeniu bakterii E. coli: Po ekspozycji na bakterie E. coli. Odnotowuje się spadek intensywności o siedem plus minus 1%, podczas gdy nieznaczne zmiany obserwuje się dla niezmodyfikowanej utlenionej porowatej powierzchni krzemu.Ponadto, w celu potwierdzenia obecności wychwyconych komórek na utlenionej porowatej powierzchni krzemu, biosensory są obserwowane pod mikroskopem świetlnym natychmiast po zakończeniu wyświetlanego eksperymentu biodetekcyjnego. Oto unieruchomione komórki bakteryjne na powierzchni biosensora. Chociaż na niezmodyfikowanych powierzchniach kontrolnych nie obserwuje się żadnych komórek, po opanowaniu tej techniki można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaplanować konkretny optyczny czujnik biologiczny do monitorowania docelowego analitu.

optical-detection-of-e-coli-bacteria-by-mesoporous-silicon-biosensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Biosensory współpracują ze złożonymi środowiskami biologicznymi i przeprowadzają ukierunkowaną detekcję, łącząc wysokoczułe czujniki z wysoce specyficznymi sondami przytwierdzonymi do czujnika poprzez modyfikację powierzchni. W niniejszym materiale demonstrujemy funkcjonalizację powierzchni krzemionkowych czujników optycznych biotyną przy użyciu czynników sprzęgających na bazie silanów w celu stworzenia pomostu między czujnikiem a środowiskiem biologicznym.

Przyłączanie sond biologicznych do krzemionkowych biosensorów optycznych z użyciem silanowych środków sprzęgających

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Źródło: Barber, A. E., et al. Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje wykrywanie określonych analitów za pomocą biosensora bakteryjnego. Pobiera się kulturę bakteryjną zawierającą plazmid z genem białka czerwonej fluorescencji (RFP) pod promotorem wrażliwym na analit. Po dokładnym wytarciu powierzchni testowej niewielką część chusteczki zanurza się w kulturze i...

Wykrywanie docelowego analitu za pomocą biosensora bakteryjnego

Ten film demonstruje technikę wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych w próbkach żywności i wody za pomocą nanosensorów. Docelowe bakterie chorobotwórcze są wykrywane poprzez połączenie modalności relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Wykrywanie skażenia bakteryjnego za pomocą nanoczujników magnetofluorescencyjnych

Biosensory fagów litycznych i kulki przeciwciał są w stanie odróżnić oporne na metycylinę (MRSA) od wrażliwych bakterii gronkowca. Fagi unieruchomiono metodą Langmuira-Blodgetta na powierzchni czujnika mikrowagi kryształu kwarcu i działały jako sondy gronkowca o szerokim zakresie. Kulki przeciwciał rozpoznają MRSA.

Biosensor do wykrywania bakterii gronkowca opornego na antybiotyki

Ta praca opisuje metodę litografii nanoimprintingowej do wytwarzania wysokiej jakości matryc czujnikowych, które działają na zasadzie niezwykłej transmisji optycznej. Bioczujnik jest tani, solidny, łatwy w użyciu i może wykrywać troponinę sercową I w surowicy w klinicznie istotnych stężeniach (odcięcie 99. percentyla ∼10-400 pg/ml, w zależności od testu).

Wykorzystanie nadzwyczajnej transmisji optycznej do ilościowego oznaczania biomarkerów serca w ludzkiej surowicy

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i kwantyfikacji nisko obfitych cząsteczek w złożonych roztworach za pomocą imprintingu molekularnego w połączeniu z biosensorem pojemnościowym.

Ultraczułe wykrywanie biomarkerów za pomocą biosensora pojemnościowego opartego na imprintingu molekularnym

Ten protokół opisuje, jak zbudować system łańcucha polimerazy o ciągłym przepływie oparty na mikroprzepływowym chipie i jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawiono w nim prostą metodę analizy kwasów nukleinowych w laboratorium.

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Poznaj metodę optycznego wykrywania bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych z przeciwciałami monoklonalnymi. Technika umożliwia szybką detekcję bez konieczności uprzedniego przygotowania próbek.

Optyczne wykrywanie bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych

Przeglądaj więcej filmów