Wprowadzenie do Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae, znany również jako drożdże piekarskie, jest jednym z wielu organizmów modelowych badanych w laboratoriach na całym świecie. Dzięki zsekwencjonowaniu genomu, łatwości manipulacji genetycznych oraz prostocie hodowli laboratoryjnej, gatunek ten stał się nieocenionym zasobem w zrozumieniu podstawowych procesów komórkowych, takich jak podział i śmierć komórki. Niniejszy materiał wideo przedstawia charakterystykę tego organizmu modelowego oraz szeroki zakres jego zastosowań w badaniach biologicznych i biomedycznych.

Drożdże należą do domeny Eukaryota, która składa się z organizmów posiadających jądra otoczone błoną, nazywanych eukariotami. Wraz z grzybami jadalnymi i pleśniami, S. cerevisiae należy do królestwa Fungi ze względu na obecność ściany komórkowej zbudowanej z chityny – polimeru polisacharydowego, który występuje nie tylko u grzybów, ale również w egzoszkieletach owadów i skorupiaków.

Co ciekawe, wiele białek występujących u drożdży posiada sekwencje podobne do białek innych eukariotów. Białka te są często homologiczne, a ich podobne sekwencje wskazują na to, że organizmy te mają wspólnego przodka. Badając funkcję danego białka u drożdży, naukowcy zyskują wgląd w funkcję tego białka u wyższych eukariotów, takich jak ludzie.

W naturze S. cerevisiae występuje w ciepłych i wilgotnych środowiskach, w bliskości źródła cukru. Jednym z ich ulubionych miejsc bytowania są winnice, gdzie zasiedlają skórkę winogron.

S. cerevisiae ma kształt od okrągłego do elipsoidalnego i zazwyczaj osiąga średnicę 5-10 µm podczas obserwacji pod mikroskopem w polu jasnym.

Podczas gdy większość komórek eukariotycznych dzieli się poprzez mitozę i cytokinezę, co prowadzi do równej segregacji materiału genetycznego i cytoplazmy do komórek potomnych, S. cerevisiae przechodzi podział komórkowy w procesie zwanym pączkowaniem.

Ta forma rozmnażania bezpłciowego polega na formowaniu się nowo syntetyzowanego pączka z komórki macierzystej, który zwiększa swoje rozmiary w trakcie cyklu komórkowego aż do momentu cytokinezy. W przeciwieństwie do typowego podziału komórki eukariotycznej, dwie komórki po mitozie nie są równe pod względem wielkości.

Po wstępnym zapoznaniu się z S. cerevisiae jako organizmem, omówmy teraz, co sprawia, że jest on doskonałym systemem modelowym do badań.

Po pierwsze, komórki drożdży rosną szybko i dzielą się w przybliżeniu co 90 minut. Po drugie, są one łatwe w hodowli i wymagają jedynie prostych technik i instrumentacji do namnażania. Po trzecie, jako pierwszy organizm eukariotyczny, którego cały genom został zsekwencjonowany, S. cerevisiae posiada wszystkie sekwencje genów publicznie dostępnych w bazie danych genomu drożdży.

Manipulacje genetyczne u drożdży są również niezwykle praktyczne. Większość wektorów S. cerevisiae, które są nośnikami interesującej sekwencji DNA, to wektory wahadłowe. Wektory wahadłowe to zazwyczaj plazmidy, które mogą propagować w dwóch różnych gatunkach, na przykład zarówno w E. coli, jak i w S. cerevisiae. Pozwala to na przeprowadzenie klonowania molekularnego w E. coli, na przykład w celu wprowadzenia genu zielonego białka fluorescencyjnego z meduzy do wektora wahadłowego, który następnie może zostać wprowadzony do drożdży, aby nadać im fluorescencję.

Integrujący plazmid drożdżowy to rodzaj wektora wahadłowego, który umożliwia włączenie obcego DNA do genomu drożdży poprzez proces nazywany rekombinacją homologiczną. Rekombinacja homologiczna jest wymianą DNA między pasującymi lub podobnymi sekwencjami, co skutkuje crossing-overem genetycznym między wektorem a genomowym DNA gospodarza. Może to prowadzić do wyciszenia genu (knock-out) lub zastąpienia jednego genu innym. Ponadto, ponieważ rekombinacja homologiczna kończy się integracją z genomem gospodarza, zmiana genetyczna utrzymuje się po podziale komórki drożdży.

Skoro już wiemy, co sprawia, że drożdże są tak wygodne w badaniach, przyjrzyjmy się temu, dlaczego te małe organizmy były tak istotne pod względem naukowym. Bardzo dawno temu, na początku VI tysiąclecia p.n.e., drożdże uczestniczyły w fermentacji winogron w celu produkcji wina. Później drożdże odegrały rolę w wypieku chleba w starożytnym Egipcie.

Dopiero w 1856 roku Luis Pasteur zidentyfikował S. cerevisiae jako kluczowy mikroorganizm wykorzystywany w produkcji wina i wypieku chleba. Sklasyfikował on drożdże jako beztlenowce fakultatywne, które w przypadku braku tlenu przełączają się na fermentację — proces pozwalający drożdżom metabolizować cukry, w wyniku którego powstaje alkohol jako produkt uboczny. W procesie tym pirogronian, wytwarzany w glikolizie, jest redukowany do aldehydu octowego, który następnie, dzięki konwersji NADH do NAD+, zostaje zredukowany do etanolu, będącego kluczowym składnikiem wina.

Przenosząc się do XX wieku, Hartwell i Nurse odkryli w drożdżach białka regulujące cykl komórkowy.

Cykl komórkowy to seria zdarzeń komórkowych obejmująca prawidłową replikację i segregację jądrowego DNA przed podziałem komórki. Identyfikacja białka cyclin oraz kinazy zależnej od cyclin, wraz ze zmianą ich względnej liczności w trakcie interfazy i mitozy, sugerowała, że białka te są kluczowymi regulatorami podziału komórki. Wysoki stopień konserwacji tych białek sprawia, że ich badanie w drożdżach jest cenne dla zrozumienia roli kinaz zależnych od cyclin w organizmach wielokomórkowych, na przykład w kontekście dysregulacji cyklu komórkowego, która może prowadzić do niekontrolowanego podziału komórek, czyli nowotworów.

Piętnaście lat później Blackburn, Greider i Szostak przeprowadzili przełomowe badania nad zrozumieniem telomerów oraz odkryli telomerazy. Telomery to powtarzalne sekwencje DNA na końcach chromosomów, które zapobiegają degeneracji genomowego DNA. Dodawanie tych powtarzalnych sekwencji jest przeprowadzane przez telomerazy na końcu 3’ chromosomu, a następnie polimeraza DNA dopełnia nukleotydy w nici opóźnionej. Telomery mają znaczenie w procesach starzenia się, ponieważ te segmenty DNA ulegają skróceniu w ciągu całego życia organizmu.

Jeszcze niedawno, w 1992 roku, Ohsumi i jego współpracownicy odkryli geny regulujące autofagię, rodzaj recyklingu komórkowego. Podczas głodu nutrientowego zbędne organella są pochłaniane przez autofagosom. Autofagosom łączy się następnie z lizosomem, aby dalej rozkładać białka organellowe do aminokwasów niezbędnych do syntezy nowych białek. Autofagia uczestniczy w istotnych mechanizmach komórkowych, które chronią przed naciekającymi patogenami i wzrostem guzów.

Badania nad drożdżami znajdują szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach. Drożdże mogą być wykorzystane na przykład do badania mitofagii, czyli usuwania uszkodzonych mitochondriów przez autofagosomy. Proces ten ma znaczenie w przebiegu takich chorób jak choroba Alzheimera i Parkinsona. W niniejszym filmie autofagia jest indukowana w komórkach drożdży poprzez dodanie pożywki z ograniczeniem azotu. Następnie komórki są przygotowywane do mikroskopii fluorescencyjnej w celu obserwacji mitofagii w komórkach poddanych głodzeniu azotowemu.

S. cerevisiae są wykorzystywane do ekspresji i oczyszczania dużych ilości białek, na przykład białka regulatorowego przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR). W tym filmie komórki drożdży niosące plazmid CFTR są hodowane w dużych kulturach. Następnie przeprowadzana jest wirowka komórek w celu wydzielenia mikrosomów. Mikrosomy są sztucznymi pęcherzykami powstałymi z retikulum endoplazmatycznego podczas rozbijania komórek. Izolacja i oczyszczanie białka CFTR z mikrosomów pozwoli naukowcom na badanie struktury tego białka przy użyciu takich metod jak krystalografia rentgenowska.

Drożdże mogą służyć również jako system modelowy do badań genetycznych ludzkich białek naprawy DNA. Białka te wykrywają i naprawiają uszkodzone DNA, aby zapobiec proliferacji komórek z wadliwym genomem, takich jak komórki nowotworowe. Tutaj widać autorów wysiewających komórki drożdży z transformowanym białkiem naprawy DNA, WRN, na selektywne pożywki agarowe. Morfologię komórek mutantów WRN można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a detekcję tego białka w lizacie komórkowym przeprowadza się poprzez elektroforezę białek z późniejszą analizą Western Blot.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do S. cerevisiae. W tym filmie omówiliśmy: historię, biologię komórkową i molekularną oraz zastosowania biomedyczne S. cerevisiae. Mamy nadzieję, że materiał był pomocny, i zachęcamy do podzielenia się nim ze znajomymi.