Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja in vivo oddziaływań białkowych, białkowych białek błonowych poprzez eksperyment interakcji z białkiem paciorkowca błonowego lub kręgosłupa błonowego. Osiąga się to poprzez sieciowanie in vivo przy użyciu odwracalnego środka sieciującego dla formaldehydu. Drugim krokiem jest oczyszczenie białka przynęty błonowej znakowanego streptem wraz z usieciowanymi białkami ofiar.

Następnie usieciowanie jest odwracane przez gotowanie. Ostatnim etapem jest oddzielenie białka przynęty błonowej i współoczyszczonych białek zdobyczy za pomocą siarczanu sodu do odpalania, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym lub strony SDS. Ostatecznie do identyfikacji białek ofiar wykorzystuje się analizę immunoblottingu i spektrometrii mas, co pozwala na analizę interakcji białek błonowych.

Nazywam się Sabina Hunka i dzisiaj pokażemy Wam technologię membrany kręgosłupa. Główną przewagą tej technologii nad istniejącymi metodami, takimi jak co IP, jest to, że pozwala ona nawet na wykrycie niskiego powinowactwa lub przejściowych interakcji białek. Kline Shaana zademonstruje Ci procedurę.

Jest jedną z moich doktorantek, która opracowała protokół rozpoczęcia tej procedury, hodowanie komórek bakteryjnych wyrażających białko przynęty błonowej z fuzją znacznika paciorkowca C końcowego indukuje ekspresję białek przynęty błonowej we wczesnej fazie logarytmicznej poprzez dodanie 0,5 milimolowego IPTG do 500 mililitrów pożywki, aby umożliwić wystarczającą ekspresję. Inkubuj bakterie do późnej fazy logarytmicznej. Przygotuj się do wykonania sieciowania formaldehydu pod okapem bezpieczeństwa ze względu na toksyczność formaldehydu.

Przenieść naczynie hodowlane pod okap zabezpieczający. Podziel każdą próbkę na dwie próbki, jedną z pominięciem sieciowania i drugą, w tym sieciowanie formaldehydu. Dodaj cztery mililitry 37% roztworu formaldehydu do 250 mililitrowej kultury, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,6%Przenieś naczynia hodowlane z powrotem i hoduj komórki jeszcze przez 20 minut, jak poprzednio.

Następnie napełnij kultury do probówek wirówkowych pod okapem bezpieczeństwa. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3000 razy G przez 30 minut. Usunąć supernatant przez dekantację, a następnie przez odsysanie.

Używając pipety pod dygestoriami bezpieczeństwa, wyrzuć supernatanty, usuwając odpowiednio toksyczny sklarowany sklarat zawierający formaldehyd. Aby osiągnąć optymalną wydajność podczas przygotowania białka błonowego, najpierw przygotuj płytki Sphero, aby rozpocząć delikatnie rozpuść dwa miligramy lizozymu w 0,1 molowym E-D-T-A-P-H osiem w 1,5 mililitrowej probówce. Do przygotowania buforu P dwa, który powinien być przygotowany na świeżo w dniu doświadczenia.

Resus zawiesić granulki komórek w 10 mililitrach świeżo przygotowanego buforu trisacharozy z inhibitorem proteazy i przenieść roztwór do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj jeden mililitr buforu P dwa i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Zebrać płytki Sphero przez odwirowanie w temperaturze 3000 razy G przez 30 minut i wyrzucić supernatant.

Ostrożnie inkubuj granulki Sphero plast przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, pracując na lodzie. Resus zawiesić podniebienie Sphero Plast w sześciu mililitrach świeżo przygotowanego buforu. P trzy.

Poddać próbkę działaniu sonikacji cztery razy przez jedną minutę w sposób ciągły na lodzie, z jednominutową przerwą między każdą serią. W celu przerwania Sphero plast należy odwirować próbkę pod ciśnieniem 10 000 razy G przez 10 minut, aby zebrać resztki komórek po odwirowaniu. Przenieść supernatant za pomocą pipety do probówki ultrawirówkowej.

Granulować frakcję membrany w ilości 100 000 razy G przez 30 minut. Ostrożnie umyć osad w 20 milimolowym buforze tris o pH osiem, nie rozpuszczając go. Następnie przekręć tubę papierową chusteczką, unikając w dowolnym momencie naruszenia granulki.

Aby ponownie zawiesić osad zawierający membrany, dodać jeden mililitr tris, zbuforować mikro pręt magnetyczny i ponownie zawiesić osad, częściowo za pomocą pipety, mieszać na lodzie przez godzinę, użyć podwielokrotności 20 mikrolitrów do określenia stężenia białka. Normalizować białko Stężenie frakcji błonowej do pięciu miligramów na mililitr za pomocą pipety buforowej tris 2,5 mililitra frakcji membranowej do probówki ultrawirówkowej i dodać 0,25 mililitra 20% Triton X 100, aby osiągnąć końcowe stężenie 2% w celu rozpuszczenia białek błonowych. Następnie dodaj mikro pręt magnetyczny i mieszaj na lodzie przez godzinę.

Zrównoważyć jednomililitrową kolumnę o super przepływie grawitacyjnym z ośmioma mililitrami buforu. Usuń pręt mikromagnetyczny z próbki solubilizacji i ultraodwiruj pod ciśnieniem 100 000 razy G przez 30 minut, aby po zakończeniu cyklu osadzać nierozpuszczalną frakcję membranową, usunąć sat za pomocą pipety. W celu dalszego oczyszczenia nanieść supernatant na kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego.

Przemyć kolumnę czterema mililitrami buforu W, powtarzając ten etap płukania pięć razy. Eluować białka przynęty błonowej za pomocą jednego mililitra buforu E. Powtórzyć tę elucję. Krok cztery razy, skoncentruj wspomniane frakcje.

Dwa, trzy i cztery do 300 mikrolitrów z filtrem odśrodkowym. Wymieszaj 200 mikrolitrów każdej próbki z 50 mikrolitrami po pięć x jako barwnik ładujący stronę DS. Podziel każdy preparat na 125 mikrolitrów porcji przed gotowaniem.

Jedna porcja każdego preparatu przez 20 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza w celu odwrócenia usieciowania formaldehydu. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez co najmniej 10 minut na stole. Załaduj od góry 30 mikrolitrów z każdej próbki do jednego pasa żelu poliakrylamidowego odpowiedniego do blottingu immunologicznego.

Użyj wstępnie wybarwionego markera masy cząsteczkowej Aby uzyskać najlepszą orientację i działać jako strona DS po przeniesieniu białek do membrany nitrocelulozowej. Zablokuj membranę, aby zapobiec niespecyficznemu etykietowaniu przez jedną godzinę. W temperaturze pokojowej rozcieńczyć i inkubować przeciwciało pierwszorzędowe specyficzne dla białka ofiary.

Użyj przeciwciała sprzężonego z HRP jako przeciwciała drugorzędowego i rozwiń immuno blot za pomocą zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnego o wysokiej czułości. Monitoruj sygnał za pomocą klasycznej procedury przetwarzania filmu lub cyfrowego sprzętu do obrazowania. Jeśli nie jest dostępne żadne specyficzne przeciwciało dla ofiary, białka lub nieznanej interakcji, należy zidentyfikować partnerów.

Do identyfikacji należy użyć spektrometrii mas lub MS. Srebrną plamę na stronie SDS za pomocą zestawu do barwienia kompatybilnego z MS. Zgodnie z protokołem producenta wszystkie etapy barwienia i mycia należy wykonywać w szklanych zbiornikach.

Wytnij odpowiednie pasma przed analizą ich za pomocą LCMS o wysokiej rozdzielczości jako białka przynęty. Zastosowano integralne białko błonowe CPXA VISIA coli. CPXA jest kinazą czujnikową i składa się z końcowej domeny czujnikowej N z dwiema domenami transbłonowymi integrującymi dużą dodatkową domenę czujnika cytoplazmatycznego i wysoce konserwatywną cytoplazmatyczną domenę katalityczną C-końcowym.

Po stymulacji CPXA aktywuje swój pokrewny regulator odpowiedzi, CPXR aktywowany CPXR dyfunduje, aby pośredniczyć w odpowiedzi dla kręgosłupa błonowego. Znacznik paciorkowca został połączony z końcem C CPX. Analiza kręgosłupa błonowego ujawnia, że paciorkowce CPXA są usieciowane z innymi białkami lub kompleksami białkowymi, na co wskazuje rozmaz w odsłoniętej próbce poddanej działaniu formaldehydu.

Bez leczenia formaldehydem ten rozmaz jest nieobecny. Co więcej, bezpośrednia interakcja białkowa paciorkowca CPXA z pokrewnym białkiem regulatora odpowiedzi CPXR jako białkiem ofiary jest wykrywalna tylko w obecności formaldehydu. Wspieranie specyfiki sieciowania formaldehydu z barwieniem srebrem.

Widoczna jest prążka, która jest specyficzna dla gotowanej próbki. Strzałka oznacza pasmo, które zostało przeanalizowane przez SM. Analiza, która potwierdziła, że CPXR jest partnerem interakcji CPXA. Po obejrzeniu tego filmu powinien dobrze zrozumieć, jak połączyć oczyszczanie powinowactwa pro i sieciowanie w spektrometrii mas w celu identyfikacji partnerów interakcji białek błonowych.