Name: Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę Membrane-SPINE do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo. Technika łączy retuszowanie krzyżowe, oczyszczanie afinitacyjne i spektrometrię masową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 i SFB940 dla S.H.

Uwaga: Szczegółowe informacje dotyczące wskazanych w protokole są dostępne w Tabeli 1.
1. Utrwalanie oddziaływań białko-białko przez sieciowanie formaldehydu w żywych komórkach
<ol>
	<li>Na początek należy przygotować pożywkę wzrostową, roztwory podstawowe i bufor P1
	<ol>
		<li>Przygotuj 500 ml pożywki: Pożywka powinna zapewniać warunki sprzyjające interakcji między białkiem przynęty błonowej a białkami ofiary. Ponadto należy przeprowadzić jedno doświadczenie w warunkach, w których nie przewiduje się interakcji (np. bez sieciowania). 
		Uwaga: Porównujemy interakcje białko-białko u bakterii zestresowanych i niestresowanych. Dlatego w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera przygotowujemy 500 ml pożywki Luria Bertani (LB) (tabela 1), którą uzupełniamy środkiem wywołującym stres (np. 0,5 M NaCl). Do kontroli używamy normalnej pożywki LB o stężeniu 0,17 M NaCl (pH 7,0).</li>
		<li>Przygotować bufor Tris (20 mM Tris-HCl; pH 8,0) i 0,1 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), roztwór podstawowy o pH 8,0 (Tabela 1).</li>
		<li>Przygotować bufor P1. Rozpuścić sacharozę do końcowego stężenia 0,5 M w buforze Tris. Wysterylizować bufor P1 przez filtrację i przechowywać go w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj komórki wyrażające białko przynęty błonowej z fuzją C-końcowego znacznika Strep-Tag z wektora. Indukuj ekspresję białek przynęty błonowej przez wystarczająco długi czas. 
	Uwaga: Indukujemy ekspresję białek przynęty błony bakteryjnej we wczesnej fazie logarytmicznej (A600 = 0,3) przez dodanie 250 μl 1 M izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do 500 ml pożywki (stężenie końcowe: 0,5 mM). Aby umożliwić wystarczającą ekspresję, inkubujemy bakterie aż do późnej fazy logarytmicznej (A600 = 1,2).</li>
	<li>Przygotować dla każdej kultury dwie zlewki wirówkowe o minimalnej objętości 300 ml każda i umieścić je na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj sieciowanie formaldehydu. 
	UWAGA: Formaldehyd jest wysoce toksyczny. Zalecamy pracę pod dygestoriami.
	<ol>
		<li>Przenieść naczynie hodowlane pod okap zabezpieczający. Podziel każdą próbkę na dwie próbki, jedną z pominięciem sieciowania (- X), a drugą z uwzględnieniem sieciowania formaldehydu (+ X). Dodać 4 ml 37% roztworu formaldehydu do 250 ml kultury, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,6%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś naczynia hodowlane z powrotem i hoduj komórki przez kolejne 20 minut, tak jak poprzednio.</li>
	<li>Napełnij swoje kultury bakteriami do probówek wirówkowych pod okapem ochronnym. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 30 minut.</li>
	<li>Zutylizować supernatant poprzez ostrożne pipetowanie go pod wyciągiem ochronnym. Zebrać toksyczny supernatant zawierający formaldehyd i odpowiednio go zutylizować.</li>
	<li>Aby osiągnąć optymalną wydajność podczas przygotowania białka błonowego, należy najpierw przygotować sferoplasty. Tutaj przedstawiamy protokół tworzenia sferoplastów bakterii Gram-ujemnych:
	<ol>
		<li>Przygotować bufor P2 (Tabela 1) z liofilizowanego proszku. Delikatnie rozpuścić 2 mg lizozymu w 0,1 M EDTA, pH 8, w probówce o pojemności 1,5 ml. Bufor P2 należy zawsze przygotowywać na świeżo na dzień eksperymentu.</li>
		<li>Przygotować tris-buffer z inhibitorem proteazy (bufor P3). Do 10 ml buforu Tris dodać 0,1 ml 1 M fenylometylosulfonylofluorku (PMSF) (Tabela 1) do końcowego stężenia 10 mM. Bufor należy zużyć natychmiast, aby zapewnić prawidłowe działanie PMSF jako inhibitora proteazy.</li>
		<li>Zawiesić osady komórkowe w 10 ml tris-buffera z inhibitorem proteazy i przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu P2 i inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Zebrać sferoplasty przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 30 minut i ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Granulki sferoplastu inkubować przez noc w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie białka błonowego Strep-tag (przynęta)
<ol>
	<li>Umieść granulki sferoplastu na lodzie.</li>
	<li>W czasie, gdy granulki sferoplastu rozmrażają się na lodzie, należy przygotować 10 ml buforu P3 dla każdego preparatu sferoplastowego. Delikatnie rozpuścić 1 mg DNaseI w 10 ml buforu Tris. Dodać 0,1 ml 1 M PMSF tuż przed użyciem.</li>
	<li>Zawiesić osad w 6 ml świeżo przygotowanego P3. Sonikować próbkę cztery razy przez 1 minutę w sposób ciągły na lodzie z 1-minutową przerwą między każdą serią, w celu rozerwania sferoplastów.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 10 minut w celu zebrania resztek komórkowych. Przenieść supernatant za pomocą pipety do probówki ultrawirówkowej.</li>
	<li>Frakcję membranową osadzać w ilości 100 000 x g przez 30 min. Ostrożnie umyć osad w buforze Tris, nie rozpuszczając go. Osusz probówkę chusteczką papierową (np. Kleenex). Unikaj naruszania pelletu w dowolnym momencie.</li>
	<li>Zawiesić ostrożnie osad (= membrany) w 1 ml buforu Tris. Użyć podwielokrotności 20 μl, aby oznaczyć stężenie białka, np. za pomocą testu BCA. Na tym etapie membrany można zamrozić szokowo w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie białka przynęty błonowej Strep-tag i SDS-PAGE
<ol>
	<li>Znormalizować stężenie białka we frakcji błonowej do 5 mg/ml za pomocą Tris-buffer. Pobrać 2,5 ml frakcji błonowej (5 mg/ml) do probówki ultrawirówkowej i dodać 0,25 ml 20% Triton X-100, aby osiągnąć końcowe stężenie 2%, w celu rozpuszczenia białek błonowych. Dodaj pręt mikromagnetyczny i mieszaj na lodzie przez 1 godz. 
	Uwaga: Chociaż ogólnie rzecz biorąc, osiągamy dobre wyniki przy użyciu Triton X-100 jako detergentu, przydatna może być zmiana detergentu w celu optymalizacji. Pod tym względem najlepsze wyniki osiągamy z detergentami stosowanymi do funkcjonalnego oczyszczania danego białka przynęty membranowej.</li>
	<li>Wykonując krok 3.1, przygotować 50 ml buforu W i 5 ml buforu E z (Tabela 1). Napełnić 10 ml koncentratu 5x bufor W do 50 ml i dodać 150 μl 20% Triton X-100.
	<ol>
		<li>Napełnić 1 ml 5x koncentratu buforu E do 10 ml i dodać 30 μl 20% Triton X-100. Zrównoważyć 1 ml kolumny przepływowej Strep-Tactin z 8 ml buforem W. 
		Uwaga: Niezbędne jest dodanie detergentu używanego do solubilizacji w stężeniu 10-krotnie wyższym od krytycznego stężenia miceli (cmc) w dowolnym buforze podczas procedury oczyszczania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć pręt mikromagnetyczny z próbki solubilizacyjnej i ultrawirować przy 100 000 x g przez 30 minut, aby osadzać nierozpuszczalną frakcję membranową. Usunąć supernatant za pomocą pipety w celu dalszego oczyszczania.</li>
	<li>Załaduj supernatant do kolumny. Uruchom kolumnę tylko z przepływem grawitacyjnym. Przemyć kolumnę 5 ml buforu W. Powtórzyć ten etap płukania 5 razy.</li>
	<li>Eluować błonowe białka przynęty za pomocą 1 ml buforu E. Powtórz ten etap elucji 4 razy.</li>
	<li>Zagęścić frakcje elucyjne 2, 3 i 4 do 300 μl za pomocą filtra odśrodkowego.</li>
	<li>Zmieszaj 200 μl każdej próbki z 50 μl 5x barwnika ładującego SDS-PAGE. Podzielić każdy preparat na 125 μl porcji. Gotować jedną porcję każdego preparatu przez 20 minut w temperaturze 95 °C, aby odwrócić wiązania krzyżowe formaldehydu. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury suchej temperatury przez co najmniej 10 minut na stole laboratoryjnym.</li>
	<li>Załadować 30 μl z każdej próbki do pojedynczego pasa żelu poliakrylamidowego odpowiedniego do immunoblottingu. Użyj wstępnie wybarwionego markera masy cząsteczkowej, aby uzyskać najlepszą orientację i uruchom SDS-PAGE10.</li>
</ol>
4. Analiza immunoblot w celu potwierdzenia partnerów interakcji
<ol>
	<li>Po zakończeniu kroku 3.8 przenieś białka do membrany nitrocelulozowej, np. półsucho.</li>
	<li>Zablokuj membranę, aby zapobiec niespecyficznemu etykietowaniu. Przygotować bufor blokujący, ważąc albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w celu uzyskania 3% wagowych na objętość w soli fizjologicznej buforowanej tris, uzupełnionej końcowym stężeniem 0,05% Tween-20 (TBS-T). Użyj wystarczającej objętości bufora blokującego, aby przykryć membranę. Zablokuj membranę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć i inkubować pierwsze przeciwciało specyficzne dla białka ofiary, jak zwykle. Użyj przeciwciała sprzężonego z HRP jako drugiego przeciwciała.</li>
	<li>Opracuj immunoblot za pomocą zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnego o wysokiej czułości. Monitoruj sygnał za pomocą klasycznej procedury przetwarzania filmu lub cyfrowego sprzętu do obrazowania.</li>
</ol>
5. Eksperymenty NanoLC-ESI-MS/MS w wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji partnerów interakcji
<ol>
	<li>W przypadku, gdy nie jest dostępne żadne specyficzne przeciwciało dla białka ofiary lub należy zidentyfikować nieznanych partnerów interakcji, do identyfikacji należy użyć spektrometrii mas (MS). Aby zapobiec zanieczyszczeniu keratyną, należy używać prefabrykowanych żeli do separacji białek.</li>
	<li>Srebrną bejcę SDS-PAGE za pomocą zestawu do barwienia kompatybilnego z MS zgodnie z protokołem producenta. Wykonaj wszystkie etapy barwienia i mycia w szklanych zbiornikach.</li>
	<li>Wyciąć odpowiednie pasma i przeanalizować je za pomocą LC/MS9 o wysokiej rozdzielczości.</li>
</ol>

<ol><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).</li>
<li>Bakheet, T. M., Doig, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+identification+of+human+protein+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Properties and identification of human protein drug targets.</a> Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).</li>
<li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat. Biotechnol. 25, (2007).</li>
<li>Daley, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly+of+membrane+proteins+into+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly of membrane proteins into complexes.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).</li>
<li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).</li>
<li>Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-SPINE%3A+An+improved+method+to+identify+protein-protein+interaction+partners+of+membrane+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo.</a> Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).</li>
<li>Herzberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE%3A+A+method+for+the+rapid+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).</li>
<li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).</li>
<li>Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protein+identification+by+tandem+mass+spectrometry%3A+Issues+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+the+Cpx-envelope+stress+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Signal integration by the Cpx-envelope stress system.</a> FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).</li>
<li>Weber, R. F., Silverman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cpx+proteins+of+Escherichia+coli+K12+%3A+Structure+of+the+CpxA+polypeptide+as+an+inner+membrane+component%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component.</a> J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Analiza błony SPINE jest podejściem biochemicznym, które umożliwia potwierdzenie i zidentyfikowanie do tej pory nieznanych partnerów interakcji białek błonowych. Membrana SPINE łączy sieciowanie in vivo za pomocą formaldehydu z oczyszczaniem białka przynęty błonowej znakowanego Strep-em. Połączenie z immunoblottingiem ułatwia potwierdzenie przewidywanych partnerów interakcji (ryc. 2). Dodatkowo, połączenie z analizą MS pozwala na identyfikację nieznanych partnerów interakcji (ryc. 3</str...

Aby zrozumieć funkcję białka, niezbędne jest poznanie jego partnerów do interakcji. Dostępnych jest kilka klasycznych technik identyfikacji partnerów interakcji rozpuszczalnych białek. Jednak techniki te nie są łatwe do przeniesienia na białka błonowe ze względu na ich hydrofobowy charakter4. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy eksperyment interakcji paciorkowc-białko błonowe (Membrane-SPINE)6. Opiera się na metodzie SPINE, która była odpowiednia tylko dla białek rozpuszczalnych7.
Membrana-SPINE korzysta z dwóch zalet czynnika sieciującego formaldehydu: po pierwsze, formaldehyd może łatwo przenikać przez błony i dzięki temu generuje precyzyjny obraz interaktomii żywej komórki8. Po drugie, wiązania krzyżowe formaldehydu można odwrócić przez gotowanie9. W tym przypadku te dwie zalety są wykorzystywane do identyfikacji nie tylko stałych, ale także przejściowych IPP białek błonowych6.
W skrócie, znacznik Strep-tag jest połączony z C-końcem integralnego białka przynęty błonowej. Komórki wyrażające białko przynęty błonowej są inkubowane z formaldehydem, który sieciuje białka żerewne z białkiem przynęty błonowej (ryc. 1). Modyfikacje białek ofiar nie są potrzebne. Następnie przygotowuje się frakcję membranową. Dlatego białka błonowe są rozpuszczane przez detergenty, a białka przynęty są oczyszczane z białkami ofiary za pomocą oczyszczania powinowactwa. Następnie usieciowanie jest odwracane przez gotowanie, a przynęta i jej spruuowane białka ofiary są rozdzielane przez SDS-PAGE. Wreszcie, białka ofiar można zidentyfikować za pomocą analizy immunoplam lub spektrometrii mas.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>Nie powinien być starszy niż jeden rok</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pręt mikromagnetyczny</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 mm długości, 2 mm średnicy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>standardowy detergent do solubilizacji</td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta;-maltozyd</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>najlepszy detergent do rozpuszczania CpxA</td></tr><tr><td>1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania białek Strep-tag</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>Zawiera bufor W i bufor E</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Zestaw do barwienia srebra</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireSilver Zestaw do barwienia</td><td>Proteome Factory</td><td>P-S-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membrane-spine: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Białka błonowe są niezbędne dla żywotności komórek i dlatego są ważnymi celami terapeutycznymi1-3. Ponieważ funkcjonują one w kompleksach4, konieczne są metody identyfikacji i charakterystyki ich interakcji5. W tym celu opracowaliśmy eksperyment interakcji paciorkowc-białko błonowy o nazwie Membrane-SPINE6. Technika ta łączy sieciowanie in vivo przy użyciu odwracalnego formaldehydu sieciującego z oczyszczaniem powinowactwa białka przynęty błonowej znakowanego Strep-ami. Podczas zabiegu usieciowane białka ofiar są jednocześnie oczyszczane z białkiem przynęty błonowej, a następnie oddzielane przez gotowanie. W związku z tym podczas analizy interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych za pomocą Membrane-SPINE można wykonać dwa główne zadania: po pierwsze, potwierdzenie proponowanego partnera interakcji za pomocą immunoblottingu, a po drugie, identyfikacja nowych partnerów interakcji za pomocą analizy spektrometrii mas. Co więcej, nawet o niskim powinowactwie, przejściowe IPP są wykrywalne za pomocą tej techniki. Wreszcie, Membrane-SPINE można dostosować do prawie każdego typu komórek, dzięki czemu można go zastosować jako potężne narzędzie przesiewowe do identyfikacji IPP białek błonowych.

Analiza błonowa SPINE umożliwia współoczyszczanie białek błonowych i przejściowo oddziałujących z nimi partnerów białkowych. Współoczyszczanie jest realizowane przy użyciu formaldehydu jako czynnika sieciującego. Kluczowe dla zapobiegania niespecyficznemu sieciowaniu są dwa parametry: stężenie formaldehydu oraz czas sieciowania. Odpowiednie, ale nie nadmierne zastosowanie formaldehydu można łatwo kontrolować za pomocą immunoblotingu. Kompleksy białkowe sieciowane formaldehydem można rozdzielić poprzez gotowanie, ale nie ...

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja in vivo oddziaływań białkowych, białkowych białek błonowych poprzez eksperyment interakcji z białkiem paciorkowca błonowego lub kręgosłupa błonowego. Osiąga się to poprzez sieciowanie in vivo przy użyciu odwracalnego środka sieciującego dla formaldehydu. Drugim krokiem jest oczyszczenie białka przynęty błonowej znakowanego streptem wraz z usieciowanymi białkami ofiar.Następnie usieciowanie jest odwracane przez gotowanie. Ostatnim etapem jest oddzielenie białka przynęty błonowej i współoczyszczonych białek zdobyczy za pomocą siarczanu sodu do odpalania, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym lub strony SDS. Ostatecznie do identyfikacji białek ofiar wykorzystuje się analizę immunoblottingu i spektrometrii mas, co pozwala na analizę interakcji białek błonowych.Nazywam się Sabina Hunka i dzisiaj pokażemy Wam technologię membrany kręgosłupa. Główną przewagą tej technologii nad istniejącymi metodami, takimi jak co IP, jest to, że pozwala ona nawet na wykrycie niskiego powinowactwa lub przejściowych interakcji białek. Kline Shaana zademonstruje Ci procedurę.Jest jedną z moich doktorantek, która opracowała protokół rozpoczęcia tej procedury, hodowanie komórek bakteryjnych wyrażających białko przynęty błonowej z fuzją znacznika paciorkowca C końcowego indukuje ekspresję białek przynęty błonowej we wczesnej fazie logarytmicznej poprzez dodanie 0,5 milimolowego IPTG do 500 mililitrów pożywki, aby umożliwić wystarczającą ekspresję. Inkubuj bakterie do późnej fazy logarytmicznej. Przygotuj się do wykonania sieciowania formaldehydu pod okapem bezpieczeństwa ze względu na toksyczność formaldehydu.Przenieść naczynie hodowlane pod okap zabezpieczający. Podziel każdą próbkę na dwie próbki, jedną z pominięciem sieciowania i drugą, w tym sieciowanie formaldehydu. Dodaj cztery mililitry 37% roztworu formaldehydu do 250 mililitrowej kultury, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,6%Przenieś naczynia hodowlane z powrotem i hoduj komórki jeszcze przez 20 minut, jak poprzednio.Następnie napełnij kultury do probówek wirówkowych pod okapem bezpieczeństwa. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3000 razy G przez 30 minut. Usunąć supernatant przez dekantację, a następnie przez odsysanie.Używając pipety pod dygestoriami bezpieczeństwa, wyrzuć supernatanty, usuwając odpowiednio toksyczny sklarowany sklarat zawierający formaldehyd. Aby osiągnąć optymalną wydajność podczas przygotowania białka błonowego, najpierw przygotuj płytki Sphero, aby rozpocząć delikatnie rozpuść dwa miligramy lizozymu w 0,1 molowym E-D-T-A-P-H osiem w 1,5 mililitrowej probówce. Do przygotowania buforu P dwa, który powinien być przygotowany na świeżo w dniu doświadczenia.Resus zawiesić granulki komórek w 10 mililitrach świeżo przygotowanego buforu trisacharozy z inhibitorem proteazy i przenieść roztwór do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj jeden mililitr buforu P dwa i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Zebrać płytki Sphero przez odwirowanie w temperaturze 3000 razy G przez 30 minut i wyrzucić supernatant.Ostrożnie inkubuj granulki Sphero plast przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, pracując na lodzie. Resus zawiesić podniebienie Sphero Plast w sześciu mililitrach świeżo przygotowanego buforu. P trzy.Poddać próbkę działaniu sonikacji cztery razy przez jedną minutę w sposób ciągły na lodzie, z jednominutową przerwą między każdą serią. W celu przerwania Sphero plast należy odwirować próbkę pod ciśnieniem 10 000 razy G przez 10 minut, aby zebrać resztki komórek po odwirowaniu. Przenieść supernatant za pomocą pipety do probówki ultrawirówkowej.Granulować frakcję membrany w ilości 100 000 razy G przez 30 minut. Ostrożnie umyć osad w 20 milimolowym buforze tris o pH osiem, nie rozpuszczając go. Następnie przekręć tubę papierową chusteczką, unikając w dowolnym momencie naruszenia granulki.Aby ponownie zawiesić osad zawierający membrany, dodać jeden mililitr tris, zbuforować mikro pręt magnetyczny i ponownie zawiesić osad, częściowo za pomocą pipety, mieszać na lodzie przez godzinę, użyć podwielokrotności 20 mikrolitrów do określenia stężenia białka. Normalizować białko Stężenie frakcji błonowej do pięciu miligramów na mililitr za pomocą pipety buforowej tris 2,5 mililitra frakcji membranowej do probówki ultrawirówkowej i dodać 0,25 mililitra 20% Triton X 100, aby osiągnąć końcowe stężenie 2% w celu rozpuszczenia białek błonowych. Następnie dodaj mikro pręt magnetyczny i mieszaj na lodzie przez godzinę.Zrównoważyć jednomililitrową kolumnę o super przepływie grawitacyjnym z ośmioma mililitrami buforu. Usuń pręt mikromagnetyczny z próbki solubilizacji i ultraodwiruj pod ciśnieniem 100 000 razy G przez 30 minut, aby po zakończeniu cyklu osadzać nierozpuszczalną frakcję membranową, usunąć sat za pomocą pipety. W celu dalszego oczyszczenia nanieść supernatant na kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego.Przemyć kolumnę czterema mililitrami buforu W, powtarzając ten etap płukania pięć razy. Eluować białka przynęty błonowej za pomocą jednego mililitra buforu E. Powtórzyć tę elucję. Krok cztery razy, skoncentruj wspomniane frakcje.Dwa, trzy i cztery do 300 mikrolitrów z filtrem odśrodkowym. Wymieszaj 200 mikrolitrów każdej próbki z 50 mikrolitrami po pięć x jako barwnik ładujący stronę DS. Podziel każdy preparat na 125 mikrolitrów porcji przed gotowaniem.Jedna porcja każdego preparatu przez 20 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza w celu odwrócenia usieciowania formaldehydu. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez co najmniej 10 minut na stole. Załaduj od góry 30 mikrolitrów z każdej próbki do jednego pasa żelu poliakrylamidowego odpowiedniego do blottingu immunologicznego.Użyj wstępnie wybarwionego markera masy cząsteczkowej Aby uzyskać najlepszą orientację i działać jako strona DS po przeniesieniu białek do membrany nitrocelulozowej. Zablokuj membranę, aby zapobiec niespecyficznemu etykietowaniu przez jedną godzinę. W temperaturze pokojowej rozcieńczyć i inkubować przeciwciało pierwszorzędowe specyficzne dla białka ofiary.Użyj przeciwciała sprzężonego z HRP jako przeciwciała drugorzędowego i rozwiń immuno blot za pomocą zestawu do wykrywania chemiluminescencyjnego o wysokiej czułości. Monitoruj sygnał za pomocą klasycznej procedury przetwarzania filmu lub cyfrowego sprzętu do obrazowania. Jeśli nie jest dostępne żadne specyficzne przeciwciało dla ofiary, białka lub nieznanej interakcji, należy zidentyfikować partnerów.Do identyfikacji należy użyć spektrometrii mas lub MS. Srebrną plamę na stronie SDS za pomocą zestawu do barwienia kompatybilnego z MS. Zgodnie z protokołem producenta wszystkie etapy barwienia i mycia należy wykonywać w szklanych zbiornikach.Wytnij odpowiednie pasma przed analizą ich za pomocą LCMS o wysokiej rozdzielczości jako białka przynęty. Zastosowano integralne białko błonowe CPXA VISIA coli. CPXA jest kinazą czujnikową i składa się z końcowej domeny czujnikowej N z dwiema domenami transbłonowymi integrującymi dużą dodatkową domenę czujnika cytoplazmatycznego i wysoce konserwatywną cytoplazmatyczną domenę katalityczną C-końcowym.Po stymulacji CPXA aktywuje swój pokrewny regulator odpowiedzi, CPXR aktywowany CPXR dyfunduje, aby pośredniczyć w odpowiedzi dla kręgosłupa błonowego. Znacznik paciorkowca został połączony z końcem C CPX. Analiza kręgosłupa błonowego ujawnia, że paciorkowce CPXA są usieciowane z innymi białkami lub kompleksami białkowymi, na co wskazuje rozmaz w odsłoniętej próbce poddanej działaniu formaldehydu.Bez leczenia formaldehydem ten rozmaz jest nieobecny. Co więcej, bezpośrednia interakcja białkowa paciorkowca CPXA z pokrewnym białkiem regulatora odpowiedzi CPXR jako białkiem ofiary jest wykrywalna tylko w obecności formaldehydu. Wspieranie specyfiki sieciowania formaldehydu z barwieniem srebrem.Widoczna jest prążka, która jest specyficzna dla gotowanej próbki. Strzałka oznacza pasmo, które zostało przeanalizowane przez SM. Analiza, która potwierdziła, że CPXR jest partnerem interakcji CPXA. Po obejrzeniu tego filmu powinien dobrze zrozumieć, jak połączyć oczyszczanie powinowactwa pro i sieciowanie w spektrometrii mas w celu identyfikacji partnerów interakcji białek błonowych.

membrane-spine-biochemical-tool-to-identify-protein-protein

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Niniejsze badanie opisuje procedurę rekonstrukcji błonowego białka TWIK, kanału K+ wrażliwego na kwasy 2 (Zadanie 2) w nanodyski. Pomyślny montaż potwierdzono za pomocą mikroskopii krio-elektronowej z pojedynczą cząstką, która dała dobrze określone dwuwymiarowe średnie klasowe.

Technika stabilizacji białek błonowych w nanodyskach

Poznaj metodę Membrane-SPINE do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo. Technika łączy retuszowanie krzyżowe, oczyszczanie afinitacyjne i spektrometrię masową.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Przeglądaj więcej filmów