Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego in situ lub in vivo, aby uzyskać ocenę funkcji mitochondriów w czasie rzeczywistym w fizjologicznie istotnym kontekście. Osiąga się to poprzez najpierw odsłonięcie mięśnia szkieletowego w tylnej kończynie myszy. Kolejne poklatkowe obrazy konfokalne mięśni szkieletowych uzyskuje się in vivo.

Następnie serce myszy jest perfundowane i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Na koniec obrazy są przetwarzane, a dane analizowane. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują pojedyncze mitochondrialne błyski ponadtlenkowe i fluktuacje potencjału błonowego w mięśniach szkieletowych, in vivo lub w perfundowanym sercu za pomocą poklatkowych i dwuwymiarowych obrazów konfokalnych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi mięśniami, takimi jak ocena funkcji mitochondriów w izolowaniu mitochondriów, jest to, że technika ta umożliwia ocenę w czasie rzeczywistym funkcji pojedynczego mitochondriów w fizjologicznie istotnych warunkach. Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ obrazowanie konfokalne nożem, zwierzęciem lub tkanką noża jest trudne do nauczenia, ponieważ jest to bardziej stroma i skomplikowana procedura. Po przygotowaniu izotonicznego zrównoważonego roztworu soli lub IBSS, Krebs HENSEL Light Buffer lub KHB i narzędzi chirurgicznych zgodnie z protokołem tekstowym, znieczulij mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu i wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić, że zwierzę jest uspokojone.

Za pomocą brzytwy usuń włosy z jednej z tylnych kończyn przed zdezynfekowaniem miejsca 70% etanolem. Następnie wykonaj nacięcie na skórze wzdłuż zewnętrznej strony kończyny, aby odsłonić mięśnie niedokrwistości żołądkowej. Następnie za pomocą ostrych kleszczy delikatnie podnieś epimysium i nożyczkami wykonaj przez nie nacięcie.

Kontynuuj preparację, aby usunąć epimysium i odsłonić włókna mięśniowe pod nim. Dodaj 500 nanomolowych tetraetylu, pręcików estru metylowego dominu lub TMRM do IBSS i zanurz mięsień w roztworze na 30 minut. Po załadowaniu TMRM do mięśnia, umyj mięsień IBSS bez TMRM za pomocą obiektywu olejowego 40x.

Umieść mysz na boku na stoliku mikroskopu konfokalnego i utrzymaj tylną kończynę tak, aby odsłonięty mięsień szkieletowy znajdował się w specjalnie wykonanej komorze na szkiełku nakrywkowym. Następnie delikatnie dociśnij nogę, aby uzyskać ścisły kontakt między tkanką a szkiełkiem nakrywkowym i zanurz odsłonięte mięśnie w IBSS za pomocą ośmiobitowej głębi pikseli i częstotliwości próbkowania jednej sekundy na klatkę, zarejestruj dwuwymiarowy seryjny skan mięśnia. Zbieraj obrazy sekwencyjne, najpierw wzbudzając je na głębokości 405 nanometrów, a następnie zbierając je na głębokości większej niż 505 nanometrów.

Następnie ekscytuje się na 488 nanometrach, zbierając na ponad 505 nanometrach. Do wzbudzenia MT o podwójnej długości fali. CCP YFP, użyj sekwencyjnego wzbudzenia przy 405, 488 i 543 nanometrach i zbieraj emisję odpowiednio przy 505 do 5, 45,505 do 5 45 i większych niż 560 nanometrów. W przypadku obrazowania wzbudzenia potrójnej długości fali M-T-C-P-Y-F-P i TMRM w celu zobrazowania serca myszy, wstrzyknij zwierzęciu 200 jednostek heparyny.

Po odczekaniu 10 minut i eutanazji myszy za pomocą torakotomii szybko usuń serce i płuca oraz przyczepioną do niego grasicę. Szybko przenieś wszczepioną tkankę do lodowatego IBSS. Następnie zidentyfikuj płaty grasicy i delikatnie je oderwij.

Aby odsłonić aortę wstępującą, usuń płuco i grasicę, a następnie odizoluj aortę, ostrożnie usuwając otaczającą tkankę. Następnie wykonaj nacięcie na górnym końcu aorty wstępującej przed pierwszą gałęzią łuku aorty. Następnie za pomocą dwóch mikrokleszczyków do szycia delikatnie przytrzymaj ścianę aorty, aby odsłonić światło i ostrożnie umieść ją na kaniuli.

Użyj zacisku do mikronaczyń, aby utrzymać aortę na miejscu i szybko zawiąż wokół niej szwy. Zdejmij zacisk i użyj kleszczyków, aby dokładnie sprawdzić, czy końcówka kaniuli znajduje się powyżej korzenia aorty. W razie potrzeby zabezpiecz dodatkowe wiązania, aby utrzymać serce na miejscu.

Włącz pompę perystaltyczną i wykonaj perfuzję serca. Przy jednym mililitrze na minutę serce wznowi bicie po perfuzji. Po 10 minutach stabilizacji należy wykonać perfuzję serca za pomocą 10 mikromolowych BLE statyny i 100 do 500 nanomolowych TMRM.

Bicie serca zwolni po 10 minutach. Następnie należy wyregulować położenie układu perfuzyjnego i umieścić serce na stoliku mikroskopowym wyposażonym w adapter do podgrzania komory do 37 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr roztworu perfuzyjnego KHB do komory, aby częściowo zanurzyć serce.

Użyj pompy perystaltycznej, aby usunąć ścieki z komory. Stopniowo zwiększając prędkość pompy, aby zapewnić wystarczający przepływ do serca, aby zapewnić ścisły kontakt serca ze szkiełkiem nakrywkowym i jeszcze bardziej stłumić bicie serca, delikatnie uciskać serce. Zobrazuj narząd zgodnie z opisem dla mięśnia wcześniej w tym filmie, dostosowując płaszczyznę ogniskowej, aby uzyskać jak najwyraźniejszy obraz.

Korzystanie z modułu analizy fizjologicznej w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego. Zacznij od otwarcia automatycznie wygenerowanej bazy danych, a następnie pliku obrazu 2D, który ma zostać przeanalizowany. Kliknij obszar zainteresowania lub średni zwrot z inwestycji.

Aby przełączyć się na tryb średniej ROI. Wyłącz wyświetlanie kanałów z wyjątkiem CP YFP przy 488 nanometrach w celu wyboru lamp błyskowych. Powiększ obraz i ręcznie przesuń suwak, aby odtworzyć szeregowe obrazy 2D.

Następnie zidentyfikuj pojedyncze błyski ponadtlenkowe mitochondriów, lokalizując miejsce, w którym sygnał fluorescencyjny przejściowo wzrasta. Użyj odpowiedniego narzędzia ROI, aby zaznaczyć błyski, obok obrazu pojawi się ślad pokazujący zależną od czasu zmianę fluorescencji każdego ROI. Po wybraniu wszystkich lamp błyskowych włącz wyświetlanie innych kanałów.

Wybierz ROI na obrazie poza komórką do odejmowania sygnału tła. Następnie wyprowadź średnią fluorescencję każdego zwrotu z inwestycji wraz z etykietami czasu. Zapisz liczbę błysków w każdym z plików obrazu skanowania szeregowego wraz z czasem skanowania i obszarem komórki.

Użyj programu Excel, aby obliczyć częstotliwość błysków jako liczbę błysków na 100 sekund i na powierzchnię komórki o powierzchni 1000 mikronów kwadratowych. Obliczanie czasu amplitudy do osiągnięcia szczytu i czasu zaniku dla każdego błysku. Użyj niestandardowego programu do analizy parametrów flash, który jest częścią niestandardowego programu napisanego w interaktywnym języku danych.

Korzystając z tego protokołu, obrazowanie in vivo pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych można przeprowadzić w mięśniach szkieletowych znieczulonych myszy, a następnie obrazowanie insi w perfundowanym sercu. Jak pokazano tutaj. TMRM, który jest wskaźnikiem potencjału błony mitochondrialnej, jest często używany do weryfikacji lokalizacji M-T-C-P-Y-F-P i powinien wykazywać pełny wzór pokrywający się z sygnałem M-T-C-P-Y-F-P.

Jego widma można odróżnić od widma CP YFP, a dzięki zastosowaniu metody wzbudzenia sekwencyjnego sygnały emisyjne TMRM i M-T-C-P-Y-F-P nie będą ze sobą interferować. Obrazy te pokazują, że pojedynczy mitochondrialny błysk ponadtlenkowy, któremu towarzyszy depolaryzacja błony, można zidentyfikować na seryjnych obrazach skanowania 2D, które wykazały przejściowy wzrost fluorescencji w stosunku do sygnałów tła zarówno w tkankach mięśni szkieletowych, jak i mięśniu sercowym. Oprócz wysokiej rozdzielczości wymagana jest również odpowiednia intensywność fluorescencji.

Można to osiągnąć poprzez modulację intensywności lasera i wzmocnienia w kanałach zbierających. Ogólnie rzecz biorąc, podstawowy sygnał fluorescencji z komórki jest ustawiony na jedną trzecią do jednej czwartej maksymalnej intensywności kanału. Ponieważ poziom ekspresji M-T-C-P-Y-F-P i obciążenie TMRM mogą się różnić u poszczególnych zwierząt, dla każdego eksperymentu należy dokonać precyzyjnego dostrojenia warunków obrazowania, zarówno zaburzeń fizjologicznych, jak i patologicznych, takich jak substraty metaboliczne.

Stymulacja elektryczna, jak wskazano tutaj, i reperfuzja niedokrwienna zostały wykorzystane, aby wykazać, że aktywność błysku ponadtlenkowego reaguje na zmiany w statusie metabolicznym komórek. Przystępując do tego zabiegu należy pamiętać o zachowaniu odpowiedniego znieczulenia jamy ustnej oraz prawidłowego stanu perfuzji serca. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak niedokrwienie i fuzja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak dysfunkcja mitochondriów podczas białaczki mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego.