Name: Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę obrazowania konfokalnego pojedynczych błysków ponadtlenkowych w mitochondriach serca i mięśni szkieletowych myszy in vivo. Technika umożliwia ocenę funkcji mitochondrialnej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Heping Cheng, Huiliang Zhang i Stephenowi Kolwiczowi za ich pomocne komentarze i wsparcie techniczne w rozwijaniu tej metody. Badanie to było wspierane przez granty NIH i Scientist Development Grant od American Heart Association do WW.

1. Przygotowanie do eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotować izotoniczny zrównoważony roztwór soli (50 ml) zawierający: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 i 10 mM HEPES (pH 7,2) do obrazowania in vivo mięśni szkieletowych.</li>
	<li>Przygotować 1 l buforu Krebs-Henseleit (KHB) zawierającego: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mMMgSO4, 0,5 mM EDTA i 25 mMNaHCO3.</li>
	<li>Pęcherzyk KHB gazem zawierającym 95% O2/5% CO2 przez 10-15 minut przed dodaniem 2 mM CaCl2. Dodaj substraty metaboliczne (np. 10 mM glukozy i 0,5 mM pirogronianu).</li>
	<li>Przygotuj narzędzia chirurgiczne, sterylizując zacisk, nożyczki i kleszcze w 70% etanolu, a następnie spłukując w wysterylizowanym ddH2O.</li>
	<li>Włącz system perfuzji serca, wyreguluj temperaturę na łaźni wodnej i cyrkulatorze, ustaw prędkość pompy perystaltycznej na 6 ml/min.</li>
	<li>Pęcherzyk KHB 95% gazem O2/5% CO2 i monitorować natężenie przepływu i temperaturę (37 °C, za pomocą światłowodowej sondy temperatury) ścieków. System potrzebuje około 20 minut na zrównoważenie gazu i temperatury.</li>
</ol>
2. Konfokalne obrazowanie mięśni szkieletowych in vivo
<ol>
	<li>Znieczulić mysz pentobarbitalem (80 mg/kg, i.p.). Zwierzę osiągnie znieczulenie chirurgiczne (brak reakcji na uszczypnięcie palca) w ciągu 10-15 minut i pozostanie w tym stanie przez 1-1,5 godziny, co jest wystarczające do obrazowania in vivo mięśni szkieletowych.</li>
	<li>Usuń włosy z jednej z tylnych kończyn i wysterylizuj skórę 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie na skórze wzdłuż zewnętrznej strony kończyny, aby odsłonić mięśnie brzuchatego łydki.</li>
	<li>Delikatnie podnieś epimysium ostrymi kleszczami i wykonaj nacięcie nożyczkami. Kontynuuj preparację, aby usunąć epimysium i odsłonić włókna mięśniowe pod nim.</li>
	<li>W celu naładowania in vivo TMRM do mięśni szkieletowych, należy umieścić TMRM (500 nM) w izotonicznym zrównoważonym roztworze soli, aby zanurzyć mięśnie na 30 minut, a następnie wypłukać roztworem bez wskaźników.</li>
	<li>Połóż mysz na boku na stoliku mikroskopu konfokalnego (Zeiss LSM 510) i utrzymaj tylną kończynę w pozycji, w której odsłonięty mięsień szkieletowy jest skierowany w stronę szkiełka nakrywkowego, które tworzy dno komory. Szkiełko nakrywkowe znajduje się pomiędzy tkanką mięśniową a odwróconym obiektywem (olej 40X).</li>
	<li>Delikatnie dociśnij nogę w dół, aby uzyskać ścisły kontakt między tkanką a szkiełkiem nakrywkowym. Zanurz odsłonięte mięśnie w izotonicznym zrównoważonym roztworze soli.</li>
	<li>Rejestruj dwuwymiarowe (2D, xy) obrazy konfokalne z częstotliwością próbkowania wynoszącą jedną sekundę na klatkę. Intensywność każdego piksela jest digitalizowana z 8-bitową głębią. Zazwyczaj skanowanie seryjne zawiera 100 klatek.</li>
	<li>Zbieraj obrazy sekwencyjne, najpierw wzbudzając przy 405 nm i zbierając przy >505 nm, a następnie przy 488 nm, zbierając przy >505 nm w celu obrazowania mt-cpYFP z podwójnym wzbudzeniem długości fali. Użyj sekwencyjnego wzbudzenia przy 405, 488 i 543 nm i zbierz emisję odpowiednio przy 505-545, 505-545 i >560 nm do obrazowania potrójnego wzbudzenia długości fali mt-cpYFP i TMRM.</li>
</ol>
3. Obrazowanie konfokalne perfundowanego serca myszy
<ol>
	<li>Natychmiast po obrazowaniu in vivo mięśni szkieletowych wstrzyknij myszu 200 jednostek heparyny (i.p.). Dziesięć minut później poddaj mysz eutanazji za pomocą torakotomii i szybko usuń serce z przyczepionymi do niego płucami i grasicą.</li>
	<li>Szybko usuń płuco w lodowatym buforze. Zidentyfikuj płaty grasicy i delikatnie oderwij, aby odsłonić wstępującą aortę.</li>
	<li>Usuń grasicę i odizoluj aortę, ostrożnie usuwając otaczającą tkankę.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie na górnym końcu aorty wstępującej przed pierwszą gałęzią łuku aorty.</li>
	<li>Delikatnie przytrzymaj ścianę aorty za pomocą dwóch mikrokleszczyków do szycia, aby odsłonić światło i ostrożnie umieść aortę na kaniuli (rurka PE50). Aorta jest utrzymywana na miejscu za pomocą zacisku mikronaczyniowego, podczas gdy szwy są szybko wiązane wokół aorty.</li>
	<li>Zdejmij zacisk, ostrożnie sprawdź kaniulę kleszczami, aby upewnić się, że końcówka kaniuli znajduje się powyżej korzenia aorty. W razie potrzeby dodawane są dodatkowe wiązania, aby utrzymać serce na miejscu.</li>
	<li>Włączyć pompę perystaltyczną i wykonać perfuzję serca z prędkością 1 ml/min. Serce wznowi bicie po perfuzji.</li>
	<li>Dostosuj położenie systemu perfuzyjnego i umieść serce na stoliku mikroskopu. Stolik posiada adapter, który umożliwia podgrzanie komory, w której znajduje się serce.</li>
	<li>Dodaj 1 ml roztworu perfuzyjnego KHB do komory, aby częściowo zanurzyć serce. Monitorować temperaturę komory na poziomie 37 °C. Usunąć ścieki z komory za pomocą pompy perystaltycznej.</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj prędkość pompy perystaltycznej, aby zapewnić wystarczający przepływ (około 2 ml/min) do serca.</li>
	<li>Po 10 minutach stabilizacji należy wykonać perfuzję serca za pomocą 10 μM blibistatyny i 100-500 nM TMRM. Bicie serca zwolni po 10 minutach.</li>
	<li>Delikatnie uciskaj serce, aby zapewnić ścisły kontakt serca ze szkiełkiem nakrywkowym na dnie komory i jeszcze bardziej stłumić bicie serca.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z tą samą procedurą obrazowania konfokalnego nienaruszonego mięśnia sercowego, jak opisano w kroku 2.8 powyżej. Ostrożnie dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby uzyskać jak najwyraźniejszy obraz.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazów i analiza danych
<ol>
	<li>Skorzystaj z narzędzi dostarczonych przez moduł "Analiza fizjologiczna" oprogramowania konfokalnego do analizy pojedynczych błysków mitochondrialnych i zmian potencjału błonowego. Moduł ten jest często dołączany do oprogramowania do akwizycji obrazu systemu konfokalnego i umożliwia określenie określonych obszarów obrazu, a także wyprowadzanie intensywności fluorescencji z etykietami czasowymi.</li>
	<li>Otwórz bazę danych, a następnie szeregowy plik obrazu 2D, który ma zostać przeanalizowany.</li>
	<li>Kliknij "Średnia obszaru zainteresowania (ROI)", aby przełączyć się na tryb "średnia ROI". Kliknij "Średnia obszaru zainteresowania (ROI)", aby przełączyć się na tryb "średnia ROI".</li>
	<li>Wyłącz wyświetlanie innych kanałów z wyjątkiem kanału cpYFP 488 nm w celu wyboru lamp błyskowych.</li>
	<li>Powiększ obraz i ręcznie przesuń suwak, aby odtworzyć szeregowe obrazy 2D.</li>
	<li>Zidentyfikuj pojedyncze mitochondrialne błyski ponadtlenkowe, lokalizując miejsce, w którym sygnał fluorescencyjny wzrasta przejściowo. Użyj odpowiedniego narzędzia ROI, aby oznaczyć błyski. Ślad pokazujący zależną od czasu zmianę fluorescencji każdego ROI pojawi się obok obrazu.</li>
	<li>Po wybraniu wszystkich lamp błyskowych włącz wyświetlanie innych kanałów. Wybierz ROI na obrazie poza komórką do odejmowania sygnału tła. Wydrukuj średnią fluorescencję każdego zwrotu z inwestycji wraz z etykietami czasu.</li>
	<li>Zapisz liczbę błysków w każdym pliku obrazu skanowania szeregowego wraz z czasem skanowania i obszarem komórki. Użyj programu Excel, aby obliczyć częstotliwość błysków jako liczbę błysków na 100 sekund/1,000 μm2 obszar komórki.</li>
	<li>Użyj specjalnie opracowanego programu napisanego w Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems), aby obliczyć parametry każdego błysku (amplituda, czas do szczytu i czas zaniku). Oprogramowanie IDL jest dostępne na rynku, a specjalnie opracowany program do analizy parametrów flash można uzyskać od autora na żądanie.</li>
</ol>

<ol><li>Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+ATP%2C+and+ROS%3A+a+mitochondrial+love-hate+triangle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).</li>
<li>Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).</li>
<li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).</li>
<li>Griffiths, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and heart disease.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li>
<li>Pieczenik, S. R., Neustadt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+molecular+pathways+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease.</a> Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).</li>
<li>Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+utilization+for+calcium+uptake+and+force+production+in+different+types+of+human+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 531, 393-403 (2001).</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioenerg.+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+III.+The+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state.</a> J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).</li>
<li>Lambert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+production+by+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species production by mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+fluorescent+imaging+of+superoxide+in+vivo+using+ethidium-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).</li>
<li>Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-targeted+fluorescent+probes+for+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).</li>
<li>Belousov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+Flashes+in+Single+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide Flashes in Single Mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li>
<li>Wei-Lapierre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respective+Contribution+of+Mitochondrial+Superoxide+and+pH+to+Mitochondria-targeted+Circularly+Permuted+Yellow+Fluorescent+Protein+%28mt-cpYFP%29+Flash+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity.</a> J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+superoxide+flash+and+metabolism-coupled+mitochondrial+permeability+transition+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals.</a> Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+superoxide+flashes%3A+metabolic+biomarkers+of+skeletal+muscle+activity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease.</a> FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).</li>
<li>Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes%3A+illuminating+new+insights+into+cardiac+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).</li>
<li>Wei, L., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on%3A+SGP+symposium+on+mitochondrial+physiology+and+medicine%3A+mitochondrial+superoxide+flashes%3A+from+discovery+to+new+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies.</a> J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).</li>
<li>Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%2C+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes%3A+elemental+events+of+mitochondrial+ROS+signaling+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+reveal+novel+properties+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+excitability+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes.</a> Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li>
<li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion%3A+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li>
<li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).</li>
<li>Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium+waves+and+redox+changes+precede+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+in+the+intact+heart+during+hypoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation.</a> Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obrazowanie pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w żywych narządach zwierzęcych lub perfundowanych ma znaczącą przewagę nad tradycyjnymi metodami oceny funkcji mitochondriów17,19,21,22,24,25. Opisana tutaj technika może osiągnąć określenie funkcji mitochondriów in situ w czasie rzeczywistym w rzeczywistych warunkach fizjologicznych w rozdzielczości subkomórkowej. Jest to szczególnie przydatne, w połączeniu z innymi pomiarami, do systematycznego badania roli mitochondriów w prawidłowym funkcjonowaniu...

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w bioenergetyce komórek, sygnalizacji wolnych rodników, homeostazie redoks, regulacji jonów i determinacji losu komórki1,2. Dysfunkcja mitochondriów często towarzyszy i leży u podstaw patogenezy chorób3-6. Szczególnie w układach mięśniowych, takich jak serce i mięśnie szkieletowe, oddychanie mitochondrialne dostarcza większość ATP, aby wspierać terminową regulację wewnątrzkomórkowego wapnia i solidny rozwój siły7,8. Mięśnie te posiadają dużą liczbę mitochondriów, które często zajmują do 20-40% całkowitej objętości komórki i są "umocowane" pomiędzy miofilamentami2.
Pomimo licznych badań, nasze zrozumienie regulacji funkcji mitochondriów, szczególnie in vivo i w fizjologicznie istotnych warunkach, jest ograniczone. Jednym z powodów jest to, że większość metod opracowanych do oceny funkcji mitochondriów opiera się na podejściach in vitro lub ex vivo, takich jak monitorowanie zużycia tlenu w izolowanych mitochondriach uzupełnionych sztucznymi substratami oraz pośrednie określanie funkcji mitochondriów poprzez morfologię (np. mikroskopia elektronowa), aktywność enzymów (np. aktywność tojadazy) lub wewnątrzkomórkowe poziomy ATP9-11.
Ostatnio, zastosowano małe cząsteczkowe wskaźniki fluorescencyjne o względnym wzbogaceniu mitochondriów, aby zapewnić wgląd w sygnały mitochondrialne, w tym potencjał błonowy, wapń i reaktywne formy tlenu (ROS), w nienaruszonych komórkach11-13. Ponadto opracowano kilka wskaźników redoks i ROS opartych na białku zielonej fluorescencji (GFP), aby uzyskać bardziej szczegółową ocenę podzielonych na przedziały wewnątrzkomórkowych sygnałów redoks lub ROS14-16. W ramach tego opracowaliśmy genetycznie kodowany wskaźnik ponadtlenkowy, koliste permutowane żółte białko fluorescencyjne, i skierowaliśmy je do mitochondriów (mt-cpYFP)17. mt-cpYFP może być wzbudzony przy 405 lub 488 nm z obydwoma szczytami emisji przy 515 nm. Emisja przy wzbudzeniu 488 nm jest specyficznie wrażliwa na ponadtlenek, jak wykazano w poprzednich kalibracjach in vitro i in vivo 17,18. Emisja przy wzbudzeniu 405 nm jest wykorzystywana jako kontrola wewnętrzna (szczegółowe informacje na temat widm emisji i wzbudzenia mt-cpYFP w różnych warunkach można znaleźć na rysunku 1 w odnośniku 17). Dzięki poklatkowemu obrazowaniu konfokalnemu wskaźnik ten wykrywa zdarzenia związane z produkcją ponadtlenków, zwane błyskami ponadtlenkami, w pojedynczych mitochondriach nienaruszonych komórek. Błysk ponadtlenkowy służy jako złożona funkcja oddychania mitochondrialnego, towarzysząc przejściowej depolaryzacji błony mitochondrialnej i produkcji ROS17-20. Niedawno wygenerowaliśmy transgeniczne myszy mt-cpYFP w obrębie tkanek przy użyciu wektora pUC-CAGGS-mt-cpYFP17,19 na tle C57 / BL6 i zweryfikowaliśmy silną ekspresję tego wskaźnika w sercu, mięśniach szkieletowych i innych tkankach (ryc. 2). Transgeniczne myszy będą dostępne dla zainteresowanych badaczy akademickich na żądanie i za zgodą MTA przez Uniwersytet Waszyngtoński.
W tym badaniu opisujemy obrazowanie in situ błysków ponadtlenkowych w perfundowanym sercu Langendorffa, jak również obrazowanie in vivo zdarzeń błyskowych w mięśniach szkieletowych znieczulonych myszy transgenicznych mt-cpYFP17,19. Technologia ta umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zdarzeń produkcji mitochondrialnych ROS w fizjologicznie istotnych warunkach lub in vivo 21,22. Możliwe jest również wykorzystanie systemu do monitorowania innych pojedynczych parametrów mitochondrialnych, takich jak potencjał błonowy i wapń, za pomocą odpowiednich wskaźników fluorescencyjnych. Ponadto można uzyskać jednoczesną lub równoległą ocenę funkcji mitochondriów ze zdarzeniami wewnątrzkomórkowymi (np. stany przejściowe wapnia) lub czynnością serca (np. frakcja wyrzutowa). Patologiczne zaburzenia, takie jak niedokrwienie i reperfuzja, można zastosować do perfundowanego serca w celu oceny wpływu stresu na funkcję pojedynczego mitochondria w nienaruszonym mięśniu sercowym.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B592500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Acros Organics</td><td>AC34961-5000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-1</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T-668</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskop skaningowy z linią konfokalną (LSM 510 Meta, Zeiss), wersja oprogramowania 4.2 SP1 wraz z modułem "Analiza fizjologiczna".</td></tr></tbody></table>

obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrium jest krytycznym organellą wewnątrzkomórkową odpowiedzialną za produkcję energii i sygnalizację wewnątrzkomórkową w systemach eukariotycznych. Dysfunkcja mitochondriów często towarzyszy chorobom u ludzi i przyczynia się do ich powstawania. Większość podejść, które zostały opracowane do oceny funkcji i dysfunkcji mitochondriów, opiera się na pomiarach in vitro lub ex vivo. Wyniki tych eksperymentów mają ograniczoną zdolność do określania funkcji mitochondriów in vivo. W tym miejscu opisujemy nowatorskie podejście, które wykorzystuje konfokalną mikroskopię skaningową do obrazowania nienaruszonych tkanek w żywych aminach, co umożliwia ocenę funkcji pojedynczego mitochondriów w czasie rzeczywistym in vivo. Po pierwsze, generujemy transgeniczne myszy z ekspresją mitochondrialnego wskaźnika ponadtlenkowego, cyrkularnie permutowanego żółtego białka fluorescencyjnego (mt-cpYFP). Znieczulona mysz mt-cpYFP jest mocowana na specjalnie wykonanym adapterze scenicznym, a zdjęcia poklatkowe są wykonywane z odsłoniętych mięśni szkieletowych kończyny tylnej. Mysz jest następnie składana w ofierze, a serce jest ustawiane do perfuzji Langendorffa z roztworami fizjologicznymi w temperaturze 37 °C. Perfundowane serce umieszcza się w specjalnej komorze na stoliku mikroskopu konfokalnego i wywiera się delikatny nacisk w celu unieruchomienia serca i stłumienia artefaktu ruchu wywołanego biciem serca. Błyski ponadtlenkowe są wykrywane przez konfokalne obrazowanie 2D w czasie rzeczywistym z częstotliwością jednej klatki na sekundę. Roztwór perfuzyjny można zmodyfikować tak, aby zawierał różne substraty oddechowe lub inne wskaźniki fluorescencyjne. Perfuzję można również dostosować w celu uzyskania modeli chorób, takich jak niedokrwienie i reperfuzja. Technika ta jest unikalnym podejściem do określania funkcji pojedynczych mitochondrium w nienaruszonych tkankach i in vivo.

Zgodnie z tym protokołem, obrazowanie in vivo pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych może być przeprowadzane w mięśniach szkieletowych znieczulonych myszy, a następnie poprzez obrazowanie in situ w perfundowanym sercu (Rysunek 1). Optymalne ustawienie warunków obrazowania zapewni wyraźne obrazy nienaruszonych tkanek mięśniowych z rozdzielczością pojedynczej mitochondrii (Rysunek 2). TMRM jest często stosowany do weryfikacji lokalizacji mt-cpYFP i powinien wykazywać pełn...

Konfokalna mikroskopia skaningowa jest stosowana do obrazowania pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w perfundowanych mięśniach serca lub szkieletowych u żywych zwierząt. Monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych procesów mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego, umożliwia ocenę funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnym kontekście i podczas patologicznych perturbacji.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego in situ lub in vivo, aby uzyskać ocenę funkcji mitochondriów w czasie rzeczywistym w fizjologicznie istotnym kontekście. Osiąga się to poprzez najpierw odsłonięcie mięśnia szkieletowego w tylnej kończynie myszy. Kolejne poklatkowe obrazy konfokalne mięśni szkieletowych uzyskuje się in vivo.Następnie serce myszy jest perfundowane i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Na koniec obrazy są przetwarzane, a dane analizowane. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują pojedyncze mitochondrialne błyski ponadtlenkowe i fluktuacje potencjału błonowego w mięśniach szkieletowych, in vivo lub w perfundowanym sercu za pomocą poklatkowych i dwuwymiarowych obrazów konfokalnych.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi mięśniami, takimi jak ocena funkcji mitochondriów w izolowaniu mitochondriów, jest to, że technika ta umożliwia ocenę w czasie rzeczywistym funkcji pojedynczego mitochondriów w fizjologicznie istotnych warunkach. Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ obrazowanie konfokalne nożem, zwierzęciem lub tka

confocal-imaging-single-mitochondrial-superoxide-flashes-intact-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano wydajną metodę pozwalającą na wizualizację indukcji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez pochodne parakrynne ROS. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2+ wyzwalanej przez pochodne parakrynne ROS w komórkach śródbłonka naczyniowego w modelu kokultury.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca2+ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Celem jest monitorowanie stanu redoks mitochondriów w izolowanych sercach w kontekście fizjologicznych ciśnień obciążenia wstępnego i następczego. Przedstawiono biventrykularny model pracującego serca królika. Do monitorowania stanu redoks mitochondriów w tkance epikardialnej wykorzystano obrazowanie fluorescencyjne NADH o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

Źródło: Kennedy, L. H., et. al. Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy...

Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

Nadtlenek wodoru (H2O2) jest zarówno źródłem uszkodzeń oksydacyjnych, jak i cząsteczką sygnałową. Protokół ten opisuje, jak mierzyć mitochondrialneH2O2za pomocą ukierunkowanego na mitochondria HyPer7 (mtHyPer7), genetycznie kodowanego biosensora ratiometrycznego, u żywych drożdży. Szczegółowo opisuje, jak zoptymalizować warunki obrazowania i przeprowadzić ilościową analizę komórkową i subkomórkową przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania.

Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Artykuł ten opisuje wykorzystanie mikroskopii konfokalnej oraz ImageJ do oceny dynamiki rozszczepienia i fuzji mitochondriów za pomocą fluorescencji przełączającej się foto Dendra2.

Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

Poznaj metodę obrazowania konfokalnego pojedynczych błysków ponadtlenkowych w mitochondriach serca i mięśni szkieletowych myszy in vivo. Technika umożliwia ocenę funkcji mitochondrialnej w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Przeglądaj więcej filmów