Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

Ta trójwymiarowa metoda przygotowania szkiełek zachowuje układ chromatyny 3D komórek, jak wykazano w przypadku komórek rozrodczych jąder myszy. Najpierw należy przebić kanaliki żelazne, aby usunąć materiały cytoplazmatyczne i poprawić dostępność odczynników barwiących, takich jak przeciwciała i sondy rybne. Po utrwaleniu materiałów jądrowych mechanicznie zdysocjuj komórki rozrodcze za pomocą kleszczy i cytozyna próbki na szkiełkach.

Następnie uzyskaj dane z wieloma sekcjami Z, aby pokryć jądro w 3D, gdy zostaną zastosowane strategicznie wyniki przygotowań szkiełek 3D. Korzystając z COT, jedna ryba RNA może pokazać powstające RNA jądrowe, aby wykryć aktywne transkrypcyjnie regiony w jądrze. Opracowałem tę metodę, kiedy pracowałem w laboratorium genetycznym w Massachusetts General Hospital.

W tym czasie zoptymalizowałem metodę przygotowania szkiełek pod kątem fluorescencyjnego wglądu w bawełniane RNA do hybrydyzacji, zwanej również rybą do wykrywania nacenta. RNA. Sondy bawełniane mogą hybrydyzować powtarzające się sekwencje w intronach i tls oraz wizualizować miejsce aktywnej transkrypcji. Bawełniane ryby RA wymagają zachowania dystrybucji jądrowego RNA.

Kluczowym punktem tej właściwej metody przygotowania jest to, że etapy izacji muszą przebiegać do etapu utrwalania. Aby usunąć tło plazmatyczne Cy, rozplątać kanaliki OUS z pękniętego jądra w PBS na lodzie, przenieść kilka kawałków kanalików o długości od pięciu do 10 milimetrów do 500 mikrolitrów buforu CSK z 0,5% trytonem X 100 i inkubować przez sześć minut na lodzie. Teraz przenieś wszystkie kanaliki do 4% roztworu P-F-A-P-B-S w jednym dołku czterodołkowego naczynia, inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubuj wszystkie kanaliki w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ustaw komory cyto spin i cyto spin podczas okresów inkubacji na odwrocie szklanego szkiełka, przenieś wszystkie kanaliki do 30 mikrolitrów PBS. Następnie użyj końcówek dwóch kleszczy, aby rozerwać kanaliki na kawałki.

Posiekaj kanaliki w kierunku poziomym, przycinając kanaliki między końcówkami dwóch kleszczy i ciągnąc kleszcze poziomo. Po dodaniu 30 mikrolitrów PBS wymieszać zawiesinę przez pipetowanie, a następnie przenieść ją do mikroprobówki wirówkowej i dodać PBS do całkowitej objętości 1,3 mililitra. Teraz nałóż 100 mikrolitrów zawiesiny na każdą z komór wirowania cyto. Cyto.

Wirować próbki z prędkością 2000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Suszyć szkiełka na stole laboratoryjnym przez kilka minut w temperaturze pokojowej za pomocą słoika coplan zawierającego PBS. Myj szkiełka przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś szkiełka do 70% etanolu na co najmniej dwie minuty. W reakcji o objętości 20 mikrolitrów dodaj 100 złapanych nanogramów, sondę 1D NA, 20-milimolowy kompleks rybonukleotydowy wanadylu i bufor hybrydyzacyjny. Za pomocą maszyny do PCR inkubować przez 10 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza, a następnie prea.

Klęcząc w temperaturze 42 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Teraz kolejno odwadniaj szkiełka w 80% etanolu przez dwie minuty, a następnie 100% etanolu przez dwie minuty. Całkowicie wysuszyć szkiełka na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej.

Teraz umieść szkiełko w komorze pudełka na końcówki w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Następnie należy na krótko odwirować sondy wstępne i pipetować je bezpośrednio na odwodnione szkiełka. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku dla etapu hybrydyzacji trwającego co najmniej sześć godzin w temperaturze 42 stopni Celsjusza.

Podgrzej roztwory myjące w słoikach coplan w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut w łaźni wodnej za pomocą żyletki, usuń szkiełko nakrywkowe z krawędzi szkiełka bez zarysowania próbek stopniowo zanurzaj szkiełka w roztworze do mycia na pięć minut każda. Zaczynając od pierwszego słoika coplan zawierającego dwa XSSC i 50% formy amid, a następnie drugiego słoika coplan zawierającego dwa XSSC i 50% formy amid. A potem dwa ostatnie słoiki zawierające dwa XSSC.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów nośnika montażowego DPI do próbek i umieść szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe i zetrzyj dodatkowe media montażowe chusteczką czyszczącą. W tym eksperymencie złowiono jedną rybę RNA, aby jednocześnie wykryć powstającą transkrypcję i barwienie immunologiczne białek, które lokalizują się w immunohistochemii ciała XY.

Na tym PACU spermatocyt wykrył białko heterochromatyny CCB X jeden, a także ufosforylowaną formę wariantu histonu H dwa A X na ciele XY. Powstałe ryby złapały jeden sygnał zgromadzony na obszarach chromatycznych e w rozrzutach powierzchniowych potraktowanych roztworem hipotonicznym. Trójwymiarowa struktura chromatyny jest zaburzona, a wszystkie osie chromosomów miotycznych mogą być uchwycone w jednej płaszczyźnie Z.

Przygotowanie preparatu 3D zachowuje jednak nienaruszoną strukturę chromatyny Po tej procedurze. Ta właściwa metoda przygotowania ma zastosowanie do immunofluorescencji DNA i RNA ryb oraz kombinacji tych metod wykrywania.