Name: Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj metodę przygotowania szkiełek 3D zachowującą architekturę chromatyny w komórkach rozrodczych myszy. Technika umożliwia wykrywanie aktywnych regionów transkrypcyjnych w jądrze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękuję Jeannie T. Lee za nadzór nad tym projektem, kiedy byłem w laboratorium Lee i Tylerowi Broeringowi za redakcję rękopisu. Praca ta została wsparta przez Basil O'Connor Starter Scholar Award od March of Dimes Foundation oraz NIH Grant GM098605.

1. 3D Przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki:
	<ol>
		<li>Bufor CSK: 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 10 mM RURY, 3 mM MgCl2. Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 1 M NaOH. Przechowywać bufor CSK w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Bufor CSK z 0,5% Triton X-100: Dodać 200 μl Triton X-100 do 40 ml buforu CSK. Mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego aż do całkowitego rozpuszczenia Triton X-100. Przechowywać bufor CSK z 0,5% Triton X-100 w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>4% Paraformaldehyd (PFA)–PBS, pH 7,4: Rozpuść 4 g PFA w około 70-80 ml wody. W celu przyspieszenia procesu rozpuszczania dodać około 20 μl 4 N NaOH i utrzymywać roztwór w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C do momentu całkowitego rozpuszczenia PFA i uzyskania przezroczystości. Ten proces trwa około 1 godziny. Po całkowitym rozpuszczeniu PFA dodać 10 ml 10x PBS. Uzupełnić końcową objętość do 100 ml wodą i schłodzić roztwór do temperatury pokojowej (25 °C). Używaj świeżo przygotowanego roztworu do każdego nowego eksperymentu. 
		Uwaga: Uzyskaj pozwolenie instytucjonalne na wszystkie prace ze zwierzętami i przestrzegaj odpowiednich wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj eutanazji samce myszy. Za pomocą kleszczy i nożyczek wytnij jądro od myszy. Umieść jądro w PBS (lub RPMI 1640). Po usunięciu jądra szybko wykonaj następujące kroki 1.3-1.4, aby zapobiec degradacji RNA.</li>
	<li>Rozerwij jądro na małej szalce Petriego i usuń osłonkę białawą. Rozwikłać kanaliki nasienne w PBS na lodzie za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieść kilka kanalików (kilka kawałków kanalików o długości około 5-10 mm) do jednego dołka 4-dołkowego naczynia zawierającego 500 ml buforu CSK + 0,5% Triton X-100 na lodzie i inkubować przez 6 minut. Nadmierna ekspozycja na bufor CSK może spowodować rozerwanie komórek.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś wszystkie kanaliki do jednego dołka 4-dołkowego naczynia zawierającego 4% roztworu PFA-PBS. Ten etap można wykonać bez mikroskopu stereoskopowego, ale opcjonalnie można go użyć. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Jednocześnie należy rozpocząć przygotowanie 12 komór cytospinowych w okresach inkubacji.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś wszystkie kanaliki do jednego dołka 4-dołkowego naczynia zawierającego PBS. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Na odwrocie szkiełka przenieś wszystkie kanaliki do 30 μl PBS (należy unikać górnej części szkiełka ze względu na ładunek kationowy). Za pomocą końcówek dwóch kleszczy rozerwij kanaliki na kawałki. Posiekaj kanaliki w kierunku poziomym, wciskając kanaliki między końcówki dwóch kleszczy i ciągnąc kleszcze poziomo. Kontynuuj ten krok przez około 10-20 sekund.</li>
	<li>Wymieszać zawiesinę, pipetując za pomocą pipety P20.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki, rozcieńczyć PBS do około 1,3 ml. Nałożyć 100 μl zawiesiny na każdą z 12 komór cytospinowych (łącznie 1,2 ml). Na tym etapie nie trzeba określać stężenia komórek.</li>
	<li>Cytowirować próbki z prędkością 2 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po cytowirowaniu suszyć szkiełka na stole laboratoryjnym przez kilka minut w temperaturze pokojowej. Po pozostawieniu szkiełek do całkowitego wyschnięcia na kilka minut przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Używając słoika Coplin zawierającego PBS, myj szkiełka przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 70% etanolu i odczekaj co najmniej 2 minuty przed inicjacją RNA FISH. Szkiełka są stabilne przez kilka tygodni w 70% etanolu w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy odwodnić szkiełka za pomocą seryjnej obróbki 80% i 100% etanolem w słoikach Coplin przez 2 minuty każdy, a następnie całkowicie odwodnić szkiełka na powietrzu. Przechowywać w temperaturze -80 °C w pudełku na szkiełka.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sondy DNA Cot-1 przez losowe gruntowanie
<ol>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki:
	<ol>
		<li>Bufor do hybrydyzacji: Wymieszaj postępujące składniki, aby przygotować 900 ml zapasu buforowego do hybrydyzacji; roztwór ten zostanie użyty do przechowywania sond. Ten zapas buforowy do hybrydyzacji pozwala na dodanie 10% objętości roztworu inhibitora RNazy (kompleks rybonukleozydu wanadylu) przed hybrydyzacją.
		<table>
			<tbody>
				<tr>
					<td>składnik</td>
					<td>Ilość (μl)</td>
					<td>Końcowe stężenie</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Formamid</td>
					<td>500</td> szt.
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>50% dekstranu</td>
					<td>200</td> szt.
					<td>10% (w/v)</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20x SSC</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>2x</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1% powierzchni ciała</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>0,1 %</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		Przed hybrydyzacją dodaj 1/10 obj. 200 mM kompleksu rybonukleozydu wanadylu lub wody do buforu hybrydyzacji, aby dopasować do końcowego stężenia. W temperaturze -20 °C mieszanina ta jest stabilna przez ponad rok.</li>
		<li>20x SSC: Rozpuścić 88,2 g cytrynianu sodu i 175,3 g NaCl w około 800 ml wody. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą kilku kropli 1 M HCl. Dodaj wodę, aby dostosować końcową objętość do 1 l. Sterylizuj w autoklawie. Po przygotowaniu 20x SSC można przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>50% (w/v) Dekstranu: Wymieszaj wodę i powoli dodaj 50 g siarczanu dekstranu. Mieszaj przez noc w temperaturze pokojowej. Dodaj wodę, aby dostosować końcową objętość do 100 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj następujące składniki wymienione poniżej do probówki PCR. Za pomocą maszyny do PCR wymieszać i inkubować roztwór przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
	<table>
		<tbody>
			<tr>
				<td>składnik</td>
				<td align="center">Ilość na reakcję (μl)</td>
				<td align="środek">Finał</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>DNA Cot-1: 1 mg/ml</td>
				<td align="środek">1</td>
				<td align="środek">1 μg</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Losowy podkład 9mer (z zestawu)</td>
				<td align="środek">10</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Woda</td>
				<td align="środek">27</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Krótko odwirować i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Dodaj następujące składniki. Mieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C za pomocą maszyny do PCR. (Szczegółowe informacje na temat używanego zestawu znajdują się w tabeli odczynników i wyposażenia).
	<table>
		<tbody>
			<tr>
				<td>składnik</td>
				<td align="center">Ilość na reakcję (μl)</td>
				<td align="center">Końcowe stężenie</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Mieszanina przygotowana z kroku 2.2</td>
				<td align="środek">38</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
			<tr>
				<td>5x bufor nukleotydowy (z zestawu)</td>
				<td align="środek">9.2</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Cy3-dUTP (1 mM)</td>
				<td align="środek">0.8</td>
				<td align="środek">16 μM</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Klenow (z zestawu)</td>
				<td align="środek">2</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Dodać 2 μl buforu zatrzymującego (z zestawu), aby przerwać reakcję.</li>
	<li>Oczyść zatrzymaną reakcję za pomocą kolumn mikrowirowych.</li>
	<li>Do oczyszczonej frakcji dodać 50 μg (5 μl) DNA plemnika śledzia (50-krotny nadmiar matrycowego DNA Cot-1).</li>
	<li>Zmierz całkowitą objętość za pomocą pipety. Dodać 0,7x objętość 100% etanolu i 0,1x objętość 3 M octanu sodu (pH 5,2), dobrze wymieszać i wirować przez 15 minut z maksymalną prędkością (17 000 x g) za pomocą mikrowirówki w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć płyn i dodać 200 μl 70% etanolu, dobrze wymieszać i odwirować przez 5 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu. Suszyć osad przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozpuścić osad w 20 μl buforu do hybrydyzacji. Ponieważ osad jest często trudny do rozpuszczenia, należy wielokrotnie pipetować. Alternatywną opcją może być również mieszalnik wirowy do wydajnego rozpuszczenia granulatu. Sondy można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Ryba RNA COT-1
<ol>
	<li>Dodaj wymienione poniżej składniki do probówki do PCR. Za pomocą maszyny do PCR inkubować przez 10 minut w temperaturze 80 °C, a następnie etap wstępnego wyżarzania trwający około 10-30 minut w temperaturze 42 °C. Utrzymywać w temperaturze 42 °C do momentu hybrydyzacji. Kompleks rybonukleozydu wanadylu jest opcjonalny; Można go zastąpić wodą.
	<table>
		<tbody>
			<tr>
				<td>składnik</td>
				<td align="center">Ilość na reakcję (μl)</td>
				<td align="środek">Finał</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Sonda DNA Cot-1 (50 ng/μl)</td>
				<td align="środek">2</td>
				<td align="środek">100 ng</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Kompleks rybonukleozydu wanadylu (200 mM)</td>
				<td align="środek">2</td>
				<td align="środek">20 mM</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Bufor hybrydyzacyjny</td>
				<td align="center">dodano do 20</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Odwodnić szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 80% etanolu przez 2 minuty, a następnie w słoiku Coplin zawierającym 100% etanolu przez 2 minuty. Całkowicie wysuszyć szkiełka na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wcześniej podgrzej komorę pojemnika na końcówki (wypełnioną 2-3 cm wody) w inkubatorze o temperaturze 42 °C. Umieść szkiełko w komorze pudełka na końcówki. Krótko odwirować wstępnie wyżarzone sondy i pipetować bezpośrednio na odwodnione szkiełka. Unikaj robienia bąbelków. Delikatnie przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Hybrydyzować przez 6 godzin do nocy (14-15 godzin) w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwory do mycia w słoikach Coplin (dwa słoiki z 2x SSC i 50% formamidu oraz dwa słoiki z 2x SSC). Rozgrzej w temperaturze 42 °C przez 30 minut w łaźni wodnej.</li>
	<li>Użyj żyletki, aby usunąć szkiełko nakrywkowe z krawędzi szkiełka. Unikaj zarysowania próbek. Myj szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 2x SSC i 50% formamidu przez 5 minut w temperaturze 45 °C. Powtórz ten krok raz.</li>
	<li>Myć szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 2x SSC przez 5 minut w temperaturze 45 °C. Powtórz ten krok raz.</li>
	<li>Dodaj 20 μl nośnika do montażu DAPI na szkiełkach i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie dociśnij szklaną pokrywę, aby usunąć dodatkowe nośniki montażowe. Wytrzyj dodatkowe media montażowe chusteczką czyszczącą. Preparaty są gotowe do oceny mikroskopowej.</li>
</ol>

<ol><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li>
<li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li>
<li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li>
<li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li>
<li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+imprinted+X+inactivation%3A+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li>
<li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li>
<li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W przygotowaniu slajdów 3D etap przepuszczalności poprzedza etap utrwalania. Etapy te są wykonywane bezpośrednio na kanalikach nasiennych, zachowując w ten sposób trójwymiarową strukturę chromatyny. Alternatywną opcją zachowania struktury chromatyny dla RNA / DNA RYB jest jednoczesne wykonanie etapu przepuszczalności i etapu utrwalania. Ta alternatywna technika została przeprowadzona na komórkach rozrodczych torbacza i na mysich zarodkach przedimplantacyjnych7,8. Jeśli jednak etap fiksacji poprzedza etap przep...

W jądrach komórki rozrodcze różnicują się od plemników diploidalnych poprzez mejozę do dojrzałych, haploidalnych plemników. Podczas tego procesu struktura chromatyny jądrowej komórek rozrodczych ulega ciągłej i dynamicznej przebudowie. Rozprzestrzenianie się powierzchniowe jest powszechnie stosowane do badania cytologicznego pojedynczych komórek plemnikotwórczych. Dominującą metodą rozprzestrzeniania się powierzchniowego jest leczenie hipotoniczne, w którym poszczególne komórki plemnikowe są rozprowadzane i spłaszczane1. Warunki te są optymalne do szczegółowej analizy chromosomów mejotycznych. Cechy chromosomalne, takie jak status synaptyczny i ogniska rekombinacji, można łatwo zaobserwować za pomocą tej metody. Jednak leczenie hipotoniczne zaburza subjądrową architekturę chromatyny, dlatego technika ta nie nadaje się do analizy strukturalnej jąder. W związku z tym opracowano ulepszoną metodę w celu zachowania trójwymiarowej struktury chromatyny komórek rozrodczych jąder. Metoda ta została określona jako metoda slajdów trójwymiarowych (3D) (rysunek 1). Metoda szkiełek 3D umożliwiła wykrycie powstającej lokalizacji RNA w jądrach, ponieważ początkowo została zoptymalizowana do badania ekspresji genów i stanów chromatyny podczas różnicowania komórek rozrodczych jąder za pomocą fluorescencji RNA hybrydyzacji in situ (FISH)2,3. Ta metoda 3D ma również zastosowanie do kombinacji immunofluorescencji, DNA i RNA FISH. Ponadto metoda ta pomogła w odkryciu postmejotycznej chromatyny płciowej (PMSC), cichego przedziału chromosomów płciowych znajdujących się w postmejotycznych spermatydach2.
Metoda slajdów 3D została pierwotnie zoptymalizowana poprzez połączenie dwóch podstawowych etapów przygotowania preparatów powszechnie stosowanych do barwienia jądrowego: etapu utrwalania przeznaczonego do utrwalania materiałów jądrowych oraz etapu przepuszczalności mającego na celu usunięcie materiałów cytoplazmatycznych w celu poprawy dostępności odczynników barwiących, takich jak przeciwciała i sondy FISH. Jak opisano wcześniej w innej publikacji3, ustalono, że etap permeabilizacji musi poprzedzać etap fiksacji, aby uzyskać optymalne wyniki przy niskim tle cytoplazmatycznym. W tej metodzie szkiełka 3D etap przepuszczalności i następujący po nim etap utrwalania są wykonywane bezpośrednio na kanalikach nasiennych, a następnie następuje mechaniczna dysocjacja komórek rozrodczych za pomocą kleszczy przed cytoprzędzeniem na szkiełkach. Alternatywna metoda oznaczania RNA FISH komórek plemnikotwórczych została opracowana w innym laboratorium4. W tej metodzie, zgodnej z metodą 3D, etap permeabilizacji musi poprzedzać etap utrwalania, aby uzyskać optymalne wyniki RNA FISH.
Poniższy protokół opisuje metodę slajdów 3D i podaje przykład możliwego zastosowania, Cot-1 RNA FISH do wykrywania powstających RNA. DNA Cot-1 składa się z powtarzających się elementów genomu. W tym przypadku sonda DNA Cot-1 jest hybrydyzowana z intronem i UTR powstających transkryptów, wykrywając w ten sposób aktywne transkrypcyjnie regiony w jądrze5,6. Preparaty 3D są wszechstronne i mogą być stosowane do kombinacji technik immunofluorescencji, DNA i RNA FISH w celu uzyskania szczegółowych badań relacji przestrzennych między architekturą chromatyny.

<table><tbody><tr><td>DNA łóżeczka COT-1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene Prime-It Fluor Zestaw do znakowania fluorescencyjnego</td><td>Agilent</td><td>300380</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DNA plemników śledzia</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Etanol. 200 dowód (absolutny)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Formamid dejonizowany</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Lifeblood Medical</td><td>77110-100</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa siarczanu dekstranu z Leuconostoc spp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>Kompleks rybonukleozydowo-wanadylowy</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 Kolumny</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost / Plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 4-dołkowe</td><td>Fisher</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe&nbsp;</td><td>Inkubator powietrza Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rewolucyjna nauka</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Podczas różnicowania komórek rozrodczych jąder, struktura chromatyny jądrowej zmienia się dynamicznie. Poniżej opisano metodę mającą na celu zachowanie trójwymiarowego układu chromatyny w komórkach rozrodczych jąder znajdujących się u myszy; metoda ta została określona jako metoda slajdów trójwymiarowych (3D). W tej metodzie kanaliki jądrowe są bezpośrednio traktowane etapem przepuszczalności, który usuwa materiał cytoplazmatyczny, a następnie etapem fiksacji, który utrwala materiały jądrowe. Kanaliki są następnie dysocjowane, zawiesina komórkowa jest cytospunowana, a komórki przylegają do szkiełek. Metoda ta poprawia czułość na wykrywanie struktur subjądrowych i ma zastosowanie do immunofluorescencji, fluorescencji DNA i RNA hybrydyzacji in situ (FISH) oraz kombinacji tych metod wykrywania. Jako przykład możliwego zastosowania metody slajdów 3D pokazano COT-1 RNA FISH do wykrywania powstających RNA. Metoda slajdów 3D ułatwi szczegółowe badanie relacji przestrzennych między strukturą chromatyny, DNA i RNA podczas różnicowania komórek rozrodczych jąder.

Reprezentatywny wynik preparatu 3D przedstawiono na Rysunku 2. W tym eksperymencie przeprowadzono metodę Cot-1 RNA FISH w celu wykrycia transkrypcji pierwotnej wraz z immunobarwieniem przy użyciu przeciwciał anty-CBX1 i γH2AX. Aby połączyć RNA FISH i immunobarwienie, najpierw wykonano immunobarwienie, a następnie RNA FISH, zgodnie z opisem w3. CBX1 jest białkiem heterochromatyny, które lokalizuje się w heterochromatynie pericentrycznej oraz w wyciszonych chromosomach płci podczas mejozy, tworz...

Materiał tutaj opisuje metodę opracowaną w celu zachowania trójwymiarowej struktury chromatyny komórek rozrodczych jąder. Zostało to nazwane metodą slajdów trójwymiarowych (3D). Metoda ta poprawia czułość wykrywania struktur subjądrowych i ma zastosowanie do immunofluorescencji, fluorescencji DNA i fluorescencji RNA hybrydyzacji in situ (FISH).

Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Ta trójwymiarowa metoda przygotowania szkiełek zachowuje układ chromatyny 3D komórek, jak wykazano w przypadku komórek rozrodczych jąder myszy. Najpierw należy przebić kanaliki żelazne, aby usunąć materiały cytoplazmatyczne i poprawić dostępność odczynników barwiących, takich jak przeciwciała i sondy rybne. Po utrwaleniu materiałów jądrowych mechanicznie zdysocjuj komórki rozrodcze za pomocą kleszczy i cytozyna próbki na szkiełkach.Następnie uzyskaj dane z wieloma sekcjami Z, aby pokryć jądro w 3D, gdy zostaną zastosowane strategicznie wyniki przygotowań szkiełek 3D. Korzystając z COT, jedna ryba RNA może pokazać powstające RNA jądrowe, aby wykryć aktywne transkrypcyjnie regiony w jądrze. Opracowałem tę metodę, kiedy pracowałem w laboratorium genetycznym w Massachusetts General Hospital.W tym czasie zoptymalizowałem metodę przygotowania szkiełek pod kątem fluorescencyjnego wglądu w bawełniane RNA do hybrydyzacji, zwanej również rybą do wykrywania nacenta. RNA. Sondy bawełniane mogą hybrydyzować powtarzające się sekwencje w intronach i tls oraz wizualizować miejsce aktywnej transkrypcji. Bawełniane ryby RA wymagają zachowania dystrybucji jądrowego RNA.Kluczowym punktem tej właściwej

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół wideo przedstawia technikę zgniatania stosowaną w laboratorium Johansena w celu przygotowania politenicznych chromosomów Drosophila do znakowania przeciwciałami.

Przygotowanie preparatów zgniatanych wieloniciowych chromosomów Drosophila do znakowania przeciwciałami

Chromosomy mogą być izolowane z żywych komórek, takich jak limfocyty czy fibroblasty skóry, oraz z organizmów, w tym ludzi i myszy. Te preparaty chromosomowe mogą być dalej wykorzystywane do rutynowych prążków G i procedur cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY).

Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Mejoza to proces rozwojowy, w którym gamety są formowane przez pojedynczą rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. Mejozę ssaków można zbadać, wykorzystując technikę przygotowania mejotycznych rozsiewów chromosomów. W tym miejscu przedstawiono metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.

Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metodę przygotowania szkiełek 3D zachowującą architekturę chromatyny w komórkach rozrodczych myszy. Technika umożliwia wykrywanie aktywnych regionów transkrypcyjnych w jądrze.

Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

Przeglądaj więcej filmów