Name: Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj metodę przygotowania szkiełek 3D zachowującą architekturę chromatyny w komórkach rozrodczych myszy. Technika umożliwia wykrywanie aktywnych regionów transkrypcyjnych w jądrze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję Jeannie T. Lee za nadzór nad tym projektem, kiedy byłem w laboratorium Lee i Tylerowi Broeringowi za redakcję rękopisu. Praca ta została wsparta przez Basil O'Connor Starter Scholar Award od March of Dimes Foundation oraz NIH Grant GM098605.

1. 3D Przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki:
	<ol>
		<li>Bufor CSK: 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 10 mM RURY, 3 mM MgCl2. Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 1 M NaOH. Przechowywać bufor CSK w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Bufor CSK z 0,5% Triton X-100: Dodać 200 μl Triton X-100 do 40 ml buforu CSK. Mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego aż do całkowitego rozpuszczenia Triton X-100. Przechowywać bufor CSK z 0,5% Triton X-100 w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>4% Paraformaldehyd (PFA)–PBS, pH 7,4: Rozpuść 4 g PFA w około 70-80 ml wody. W celu przyspieszenia procesu rozpuszczania dodać około 20 μl 4 N NaOH i utrzymywać roztwór w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C do momentu całkowitego rozpuszczenia PFA i uzyskania przezroczystości. Ten proces trwa około 1 godziny. Po całkowitym rozpuszczeniu PFA dodać 10 ml 10x PBS. Uzupełnić końcową objętość do 100 ml wodą i schłodzić roztwór do temperatury pokojowej (25 °C). Używaj świeżo przygotowanego roztworu do każdego nowego eksperymentu. 
		Uwaga: Uzyskaj pozwolenie instytucjonalne na wszystkie prace ze zwierzętami i przestrzegaj odpowiednich wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj eutanazji samce myszy. Za pomocą kleszczy i nożyczek wytnij jądro od myszy. Umieść jądro w PBS (lub RPMI 1640). Po usunięciu jądra szybko wykonaj następujące kroki 1.3-1.4, aby zapobiec degradacji RNA.</li>
	<li>Rozerwij jądro na małej szalce Petriego i usuń osłonkę białawą. Rozwikłać kanaliki nasienne w PBS na lodzie za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieść kilka kanalików (kilka kawałków kanalików o długości około 5-10 mm) do jednego dołka 4-dołkowego naczynia zawierającego 500 ml buforu CSK + 0,5% Triton X-100 na lodzie i inkubować przez 6 minut. Nadmierna ekspozycja na bufor CSK może spowodować rozerwanie komórek.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś wszystkie kanaliki do jednego dołka 4-dołkowego naczynia zawierającego 4% roztworu PFA-PBS. Ten etap można wykonać bez mikroskopu stereoskopowego, ale opcjonalnie można go użyć. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Jednocześnie należy rozpocząć przygotowanie 12 komór cytospinowych w okresach inkubacji.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś wszystkie kanaliki do jednego dołka 4-dołkowego naczynia zawierającego PBS. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Na odwrocie szkiełka przenieś wszystkie kanaliki do 30 μl PBS (należy unikać górnej części szkiełka ze względu na ładunek kationowy). Za pomocą końcówek dwóch kleszczy rozerwij kanaliki na kawałki. Posiekaj kanaliki w kierunku poziomym, wciskając kanaliki między końcówki dwóch kleszczy i ciągnąc kleszcze poziomo. Kontynuuj ten krok przez około 10-20 sekund.</li>
	<li>Wymieszać zawiesinę, pipetując za pomocą pipety P20.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki, rozcieńczyć PBS do około 1,3 ml. Nałożyć 100 μl zawiesiny na każdą z 12 komór cytospinowych (łącznie 1,2 ml). Na tym etapie nie trzeba określać stężenia komórek.</li>
	<li>Cytowirować próbki z prędkością 2 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po cytowirowaniu suszyć szkiełka na stole laboratoryjnym przez kilka minut w temperaturze pokojowej. Po pozostawieniu szkiełek do całkowitego wyschnięcia na kilka minut przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Używając słoika Coplin zawierającego PBS, myj szkiełka przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 70% etanolu i odczekaj co najmniej 2 minuty przed inicjacją RNA FISH. Szkiełka są stabilne przez kilka tygodni w 70% etanolu w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy odwodnić szkiełka za pomocą seryjnej obróbki 80% i 100% etanolem w słoikach Coplin przez 2 minuty każdy, a następnie całkowicie odwodnić szkiełka na powietrzu. Przechowywać w temperaturze -80 °C w pudełku na szkiełka.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sondy DNA Cot-1 przez losowe gruntowanie
<ol>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki:
	<ol>
		<li>Bufor do hybrydyzacji: Wymieszaj postępujące składniki, aby przygotować 900 ml zapasu buforowego do hybrydyzacji; roztwór ten zostanie użyty do przechowywania sond. Ten zapas buforowy do hybrydyzacji pozwala na dodanie 10% objętości roztworu inhibitora RNazy (kompleks rybonukleozydu wanadylu) przed hybrydyzacją.
		<table>
			<tbody>
				<tr>
					<td>składnik</td>
					<td>Ilość (μl)</td>
					<td>Końcowe stężenie</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Formamid</td>
					<td>500</td> szt.
					<td>50% (v/v)</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>50% dekstranu</td>
					<td>200</td> szt.
					<td>10% (w/v)</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20x SSC</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>2x</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1% powierzchni ciała</td>
					<td>100</td> szt.
					<td>0,1 %</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		Przed hybrydyzacją dodaj 1/10 obj. 200 mM kompleksu rybonukleozydu wanadylu lub wody do buforu hybrydyzacji, aby dopasować do końcowego stężenia. W temperaturze -20 °C mieszanina ta jest stabilna przez ponad rok.</li>
		<li>20x SSC: Rozpuścić 88,2 g cytrynianu sodu i 175,3 g NaCl w około 800 ml wody. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą kilku kropli 1 M HCl. Dodaj wodę, aby dostosować końcową objętość do 1 l. Sterylizuj w autoklawie. Po przygotowaniu 20x SSC można przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>50% (w/v) Dekstranu: Wymieszaj wodę i powoli dodaj 50 g siarczanu dekstranu. Mieszaj przez noc w temperaturze pokojowej. Dodaj wodę, aby dostosować końcową objętość do 100 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj następujące składniki wymienione poniżej do probówki PCR. Za pomocą maszyny do PCR wymieszać i inkubować roztwór przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
	<table>
		<tbody>
			<tr>
				<td>składnik</td>
				<td align="center">Ilość na reakcję (μl)</td>
				<td align="środek">Finał</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>DNA Cot-1: 1 mg/ml</td>
				<td align="środek">1</td>
				<td align="środek">1 μg</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Losowy podkład 9mer (z zestawu)</td>
				<td align="środek">10</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Woda</td>
				<td align="środek">27</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Krótko odwirować i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Dodaj następujące składniki. Mieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C za pomocą maszyny do PCR. (Szczegółowe informacje na temat używanego zestawu znajdują się w tabeli odczynników i wyposażenia).
	<table>
		<tbody>
			<tr>
				<td>składnik</td>
				<td align="center">Ilość na reakcję (μl)</td>
				<td align="center">Końcowe stężenie</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Mieszanina przygotowana z kroku 2.2</td>
				<td align="środek">38</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
			<tr>
				<td>5x bufor nukleotydowy (z zestawu)</td>
				<td align="środek">9.2</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Cy3-dUTP (1 mM)</td>
				<td align="środek">0.8</td>
				<td align="środek">16 μM</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Klenow (z zestawu)</td>
				<td align="środek">2</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Dodać 2 μl buforu zatrzymującego (z zestawu), aby przerwać reakcję.</li>
	<li>Oczyść zatrzymaną reakcję za pomocą kolumn mikrowirowych.</li>
	<li>Do oczyszczonej frakcji dodać 50 μg (5 μl) DNA plemnika śledzia (50-krotny nadmiar matrycowego DNA Cot-1).</li>
	<li>Zmierz całkowitą objętość za pomocą pipety. Dodać 0,7x objętość 100% etanolu i 0,1x objętość 3 M octanu sodu (pH 5,2), dobrze wymieszać i wirować przez 15 minut z maksymalną prędkością (17 000 x g) za pomocą mikrowirówki w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć płyn i dodać 200 μl 70% etanolu, dobrze wymieszać i odwirować przez 5 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu. Suszyć osad przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozpuścić osad w 20 μl buforu do hybrydyzacji. Ponieważ osad jest często trudny do rozpuszczenia, należy wielokrotnie pipetować. Alternatywną opcją może być również mieszalnik wirowy do wydajnego rozpuszczenia granulatu. Sondy można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Ryba RNA COT-1
<ol>
	<li>Dodaj wymienione poniżej składniki do probówki do PCR. Za pomocą maszyny do PCR inkubować przez 10 minut w temperaturze 80 °C, a następnie etap wstępnego wyżarzania trwający około 10-30 minut w temperaturze 42 °C. Utrzymywać w temperaturze 42 °C do momentu hybrydyzacji. Kompleks rybonukleozydu wanadylu jest opcjonalny; Można go zastąpić wodą.
	<table>
		<tbody>
			<tr>
				<td>składnik</td>
				<td align="center">Ilość na reakcję (μl)</td>
				<td align="środek">Finał</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Sonda DNA Cot-1 (50 ng/μl)</td>
				<td align="środek">2</td>
				<td align="środek">100 ng</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Kompleks rybonukleozydu wanadylu (200 mM)</td>
				<td align="środek">2</td>
				<td align="środek">20 mM</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Bufor hybrydyzacyjny</td>
				<td align="center">dodano do 20</td>
				<td align="środek"></td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
	<li>Odwodnić szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 80% etanolu przez 2 minuty, a następnie w słoiku Coplin zawierającym 100% etanolu przez 2 minuty. Całkowicie wysuszyć szkiełka na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wcześniej podgrzej komorę pojemnika na końcówki (wypełnioną 2-3 cm wody) w inkubatorze o temperaturze 42 °C. Umieść szkiełko w komorze pudełka na końcówki. Krótko odwirować wstępnie wyżarzone sondy i pipetować bezpośrednio na odwodnione szkiełka. Unikaj robienia bąbelków. Delikatnie przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Hybrydyzować przez 6 godzin do nocy (14-15 godzin) w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwory do mycia w słoikach Coplin (dwa słoiki z 2x SSC i 50% formamidu oraz dwa słoiki z 2x SSC). Rozgrzej w temperaturze 42 °C przez 30 minut w łaźni wodnej.</li>
	<li>Użyj żyletki, aby usunąć szkiełko nakrywkowe z krawędzi szkiełka. Unikaj zarysowania próbek. Myj szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 2x SSC i 50% formamidu przez 5 minut w temperaturze 45 °C. Powtórz ten krok raz.</li>
	<li>Myć szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 2x SSC przez 5 minut w temperaturze 45 °C. Powtórz ten krok raz.</li>
	<li>Dodaj 20 μl nośnika do montażu DAPI na szkiełkach i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie dociśnij szklaną pokrywę, aby usunąć dodatkowe nośniki montażowe. Wytrzyj dodatkowe media montażowe chusteczką czyszczącą. Preparaty są gotowe do oceny mikroskopowej.</li>
</ol>

<ol><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li>
<li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li>
<li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li>
<li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li>
<li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+imprinted+X+inactivation%3A+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li>
<li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li>
<li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W przygotowaniu slajdów 3D etap przepuszczalności poprzedza etap utrwalania. Etapy te są wykonywane bezpośrednio na kanalikach nasiennych, zachowując w ten sposób trójwymiarową strukturę chromatyny. Alternatywną opcją zachowania struktury chromatyny dla RNA / DNA RYB jest jednoczesne wykonanie etapu przepuszczalności i etapu utrwalania. Ta alternatywna technika została przeprowadzona na komórkach rozrodczych torbacza i na mysich zarodkach przedimplantacyjnych7,8. Jeśli jednak etap fiksacji poprzedza etap przep...

W jądrach komórki rozrodcze różnicują się od plemników diploidalnych poprzez mejozę do dojrzałych, haploidalnych plemników. Podczas tego procesu struktura chromatyny jądrowej komórek rozrodczych ulega ciągłej i dynamicznej przebudowie. Rozprzestrzenianie się powierzchniowe jest powszechnie stosowane do badania cytologicznego pojedynczych komórek plemnikotwórczych. Dominującą metodą rozprzestrzeniania się powierzchniowego jest leczenie hipotoniczne, w którym poszczególne komórki plemnikowe są rozprowadzane i spłaszczane1. Warunki te są optymalne do szczegółowej analizy chromosomów mejotycznych. Cechy chromosomalne, takie jak status synaptyczny i ogniska rekombinacji, można łatwo zaobserwować za pomocą tej metody. Jednak leczenie hipotoniczne zaburza subjądrową architekturę chromatyny, dlatego technika ta nie nadaje się do analizy strukturalnej jąder. W związku z tym opracowano ulepszoną metodę w celu zachowania trójwymiarowej struktury chromatyny komórek rozrodczych jąder. Metoda ta została określona jako metoda slajdów trójwymiarowych (3D) (rysunek 1). Metoda szkiełek 3D umożliwiła wykrycie powstającej lokalizacji RNA w jądrach, ponieważ początkowo została zoptymalizowana do badania ekspresji genów i stanów chromatyny podczas różnicowania komórek rozrodczych jąder za pomocą fluorescencji RNA hybrydyzacji in situ (FISH)2,3. Ta metoda 3D ma również zastosowanie do kombinacji immunofluorescencji, DNA i RNA FISH. Ponadto metoda ta pomogła w odkryciu postmejotycznej chromatyny płciowej (PMSC), cichego przedziału chromosomów płciowych znajdujących się w postmejotycznych spermatydach2.
Metoda slajdów 3D została pierwotnie zoptymalizowana poprzez połączenie dwóch podstawowych etapów przygotowania preparatów powszechnie stosowanych do barwienia jądrowego: etapu utrwalania przeznaczonego do utrwalania materiałów jądrowych oraz etapu przepuszczalności mającego na celu usunięcie materiałów cytoplazmatycznych w celu poprawy dostępności odczynników barwiących, takich jak przeciwciała i sondy FISH. Jak opisano wcześniej w innej publikacji3, ustalono, że etap permeabilizacji musi poprzedzać etap fiksacji, aby uzyskać optymalne wyniki przy niskim tle cytoplazmatycznym. W tej metodzie szkiełka 3D etap przepuszczalności i następujący po nim etap utrwalania są wykonywane bezpośrednio na kanalikach nasiennych, a następnie następuje mechaniczna dysocjacja komórek rozrodczych za pomocą kleszczy przed cytoprzędzeniem na szkiełkach. Alternatywna metoda oznaczania RNA FISH komórek plemnikotwórczych została opracowana w innym laboratorium4. W tej metodzie, zgodnej z metodą 3D, etap permeabilizacji musi poprzedzać etap utrwalania, aby uzyskać optymalne wyniki RNA FISH.
Poniższy protokół opisuje metodę slajdów 3D i podaje przykład możliwego zastosowania, Cot-1 RNA FISH do wykrywania powstających RNA. DNA Cot-1 składa się z powtarzających się elementów genomu. W tym przypadku sonda DNA Cot-1 jest hybrydyzowana z intronem i UTR powstających transkryptów, wykrywając w ten sposób aktywne transkrypcyjnie regiony w jądrze5,6. Preparaty 3D są wszechstronne i mogą być stosowane do kombinacji technik immunofluorescencji, DNA i RNA FISH w celu uzyskania szczegółowych badań relacji przestrzennych między architekturą chromatyny.

<table><tbody><tr><td>DNA łóżeczka COT-1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene Prime-It Fluor Zestaw do znakowania fluorescencyjnego</td><td>Agilent</td><td>300380</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DNA plemników śledzia</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Etanol. 200 dowód (absolutny)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Formamid dejonizowany</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Lifeblood Medical</td><td>77110-100</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa siarczanu dekstranu z Leuconostoc spp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>Kompleks rybonukleozydowo-wanadylowy</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 Kolumny</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost / Plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 4-dołkowe</td><td>Fisher</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe&nbsp;</td><td>Inkubator powietrza Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rewolucyjna nauka</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Podczas różnicowania komórek rozrodczych jąder, struktura chromatyny jądrowej zmienia się dynamicznie. Poniżej opisano metodę mającą na celu zachowanie trójwymiarowego układu chromatyny w komórkach rozrodczych jąder znajdujących się u myszy; metoda ta została określona jako metoda slajdów trójwymiarowych (3D). W tej metodzie kanaliki jądrowe są bezpośrednio traktowane etapem przepuszczalności, który usuwa materiał cytoplazmatyczny, a następnie etapem fiksacji, który utrwala materiały jądrowe. Kanaliki są następnie dysocjowane, zawiesina komórkowa jest cytospunowana, a komórki przylegają do szkiełek. Metoda ta poprawia czułość na wykrywanie struktur subjądrowych i ma zastosowanie do immunofluorescencji, fluorescencji DNA i RNA hybrydyzacji in situ (FISH) oraz kombinacji tych metod wykrywania. Jako przykład możliwego zastosowania metody slajdów 3D pokazano COT-1 RNA FISH do wykrywania powstających RNA. Metoda slajdów 3D ułatwi szczegółowe badanie relacji przestrzennych między strukturą chromatyny, DNA i RNA podczas różnicowania komórek rozrodczych jąder.

Reprezentatywny wynik preparatu 3D przedstawiono na Rysunku 2. W tym eksperymencie przeprowadzono metodę Cot-1 RNA FISH w celu wykrycia transkrypcji pierwotnej wraz z immunobarwieniem przy użyciu przeciwciał anty-CBX1 i γH2AX. Aby połączyć RNA FISH i immunobarwienie, najpierw wykonano immunobarwienie, a następnie RNA FISH, zgodnie z opisem w3. CBX1 jest białkiem heterochromatyny, które lokalizuje się w heterochromatynie pericentrycznej oraz w wyciszonych chromosomach płci podczas mejozy, tworz...

Materiał tutaj opisuje metodę opracowaną w celu zachowania trójwymiarowej struktury chromatyny komórek rozrodczych jąder. Zostało to nazwane metodą slajdów trójwymiarowych (3D). Metoda ta poprawia czułość wykrywania struktur subjądrowych i ma zastosowanie do immunofluorescencji, fluorescencji DNA i fluorescencji RNA hybrydyzacji in situ (FISH).

Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Ta trójwymiarowa metoda przygotowania szkiełek zachowuje układ chromatyny 3D komórek, jak wykazano w przypadku komórek rozrodczych jąder myszy. Najpierw należy przebić kanaliki żelazne, aby usunąć materiały cytoplazmatyczne i poprawić dostępność odczynników barwiących, takich jak przeciwciała i sondy rybne. Po utrwaleniu materiałów jądrowych mechanicznie zdysocjuj komórki rozrodcze za pomocą kleszczy i cytozyna próbki na szkiełkach.Następnie uzyskaj dane z wieloma sekcjami Z, aby pokryć jądro w 3D, gdy zostaną zastosowane strategicznie wyniki przygotowań szkiełek 3D. Korzystając z COT, jedna ryba RNA może pokazać powstające RNA jądrowe, aby wykryć aktywne transkrypcyjnie regiony w jądrze. Opracowałem tę metodę, kiedy pracowałem w laboratorium genetycznym w Massachusetts General Hospital.W tym czasie zoptymalizowałem metodę przygotowania szkiełek pod kątem fluorescencyjnego wglądu w bawełniane RNA do hybrydyzacji, zwanej również rybą do wykrywania nacenta. RNA. Sondy bawełniane mogą hybrydyzować powtarzające się sekwencje w intronach i tls oraz wizualizować miejsce aktywnej transkrypcji. Bawełniane ryby RA wymagają zachowania dystrybucji jądrowego RNA.Kluczowym punktem tej właściwej metody przygotowania jest to, że etapy izacji muszą przebiegać do etapu utrwalania. Aby usunąć tło plazmatyczne Cy, rozplątać kanaliki OUS z pękniętego jądra w PBS na lodzie, przenieść kilka kawałków kanalików o długości od pięciu do 10 milimetrów do 500 mikrolitrów buforu CSK z 0,5% trytonem X 100 i inkubować przez sześć minut na lodzie. Teraz przenieś wszystkie kanaliki do 4% roztworu P-F-A-P-B-S w jednym dołku czterodołkowego naczynia, inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie inkubuj wszystkie kanaliki w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ustaw komory cyto spin i cyto spin podczas okresów inkubacji na odwrocie szklanego szkiełka, przenieś wszystkie kanaliki do 30 mikrolitrów PBS. Następnie użyj końcówek dwóch kleszczy, aby rozerwać kanaliki na kawałki.Posiekaj kanaliki w kierunku poziomym, przycinając kanaliki między końcówkami dwóch kleszczy i ciągnąc kleszcze poziomo. Po dodaniu 30 mikrolitrów PBS wymieszać zawiesinę przez pipetowanie, a następnie przenieść ją do mikroprobówki wirówkowej i dodać PBS do całkowitej objętości 1,3 mililitra. Teraz nałóż 100 mikrolitrów zawiesiny na każdą z komór wirowania cyto. Cyto.Wirować próbki z prędkością 2000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Suszyć szkiełka na stole laboratoryjnym przez kilka minut w temperaturze pokojowej za pomocą słoika coplan zawierającego PBS. Myj szkiełka przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie przenieś szkiełka do 70% etanolu na co najmniej dwie minuty. W reakcji o objętości 20 mikrolitrów dodaj 100 złapanych nanogramów, sondę 1D NA, 20-milimolowy kompleks rybonukleotydowy wanadylu i bufor hybrydyzacyjny. Za pomocą maszyny do PCR inkubować przez 10 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza, a następnie prea.Klęcząc w temperaturze 42 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Teraz kolejno odwadniaj szkiełka w 80% etanolu przez dwie minuty, a następnie 100% etanolu przez dwie minuty. Całkowicie wysuszyć szkiełka na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej.Teraz umieść szkiełko w komorze pudełka na końcówki w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Następnie należy na krótko odwirować sondy wstępne i pipetować je bezpośrednio na odwodnione szkiełka. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku dla etapu hybrydyzacji trwającego co najmniej sześć godzin w temperaturze 42 stopni Celsjusza.Podgrzej roztwory myjące w słoikach coplan w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut w łaźni wodnej za pomocą żyletki, usuń szkiełko nakrywkowe z krawędzi szkiełka bez zarysowania próbek stopniowo zanurzaj szkiełka w roztworze do mycia na pięć minut każda. Zaczynając od pierwszego słoika coplan zawierającego dwa XSSC i 50% formy amid, a następnie drugiego słoika coplan zawierającego dwa XSSC i 50% formy amid. A potem dwa ostatnie słoiki zawierające dwa XSSC.Następnie dodaj 20 mikrolitrów nośnika montażowego DPI do próbek i umieść szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe i zetrzyj dodatkowe media montażowe chusteczką czyszczącą. W tym eksperymencie złowiono jedną rybę RNA, aby jednocześnie wykryć powstającą transkrypcję i barwienie immunologiczne białek, które lokalizują się w immunohistochemii ciała XY.Na tym PACU spermatocyt wykrył białko heterochromatyny CCB X jeden, a także ufosforylowaną formę wariantu histonu H dwa A X na ciele XY. Powstałe ryby złapały jeden sygnał zgromadzony na obszarach chromatycznych e w rozrzutach powierzchniowych potraktowanych roztworem hipotonicznym. Trójwymiarowa struktura chromatyny jest zaburzona, a wszystkie osie chromosomów miotycznych mogą być uchwycone w jednej płaszczyźnie Z.Przygotowanie preparatu 3D zachowuje jednak nienaruszoną strukturę chromatyny Po tej procedurze. Ta właściwa metoda przygotowania ma zastosowanie do immunofluorescencji DNA i RNA ryb oraz kombinacji tych metod wykrywania.

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Chromosomy mogą być izolowane z żywych komórek, takich jak limfocyty czy fibroblasty skóry, oraz z organizmów, w tym ludzi i myszy. Te preparaty chromosomowe mogą być dalej wykorzystywane do rutynowych prążków G i procedur cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY).

Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Mejoza to proces rozwojowy, w którym gamety są formowane przez pojedynczą rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. Mejozę ssaków można zbadać, wykorzystując technikę przygotowania mejotycznych rozsiewów chromosomów. W tym miejscu przedstawiono metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.

Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metodę przygotowania szkiełek 3D zachowującą architekturę chromatyny w komórkach rozrodczych myszy. Technika umożliwia wykrywanie aktywnych regionów transkrypcyjnych w jądrze.

Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

Przeglądaj więcej filmów