Name: Metoda hodowli Slice do śledzenia rozwoju zarodków zębów w hodowli eksplantatów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę hodowli plastrów szczęki myszy do obserwacji rozwoju zawiązków zębowych w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia śledzenie ruchów komórkowych i dynamiki tkanek dentystycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sarah A. Alfaqeeh jest finansowana przez Kind Saud University College of Dentistry, Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego, Królestwo Arabii Saudyjskiej.

1. Konfiguracja
<ol>
	<li>Naostrzyć narzędzia preparacyjne (za pomocą kamienia do ostrzenia nasmarowanego olejem mineralnym) i wysterylizować przed użyciem do hodowli narządów, używając 70% etanolu w sprayu i sterylizacji na sucho. Naostrzyć igły do rozwarstwiania za pomocą elektrolizy w 2 M wodorotlenku sodu przy użyciu zasilania 12 V.</li>
	<li>Przygotować pożywkę stosowaną do sekcji i hodowli narządów zarodkowych, składającą się z Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM F12) uzupełnionego 1% GlutaMAX i 1% penicyliny-streptomycyny.</li>
</ol>
2. Sekcja zarodków
<ol>
	<li>Ubój ciężarnej samicy krytej w określonym czasie przy użyciu metody harmonogramu pierwszego, zatwierdzonej przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych lub inny organ zarządzający. Odetnij skórę wokół dolnej części brzucha i rozetnij brzuch nożyczkami. Zlokalizuj dwa rogi macicy, które łączą się ze sobą w dolnej linii środkowej.</li>
	<li>Wyciąć macicę i umieścić w probówce wypełnionej podłożem na lodzie. Na lodzie tkankę można pozostawić na kilka godzin.</li>
	<li>Usunąć macicę i umieścić na szalce Petriego w pożywce pod mikroskopem. Tam, gdzie to możliwe, sekcje zarodków powinny być przeprowadzane w kapturze z przepływem laminarnym, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
	<li>Wypreparuj zarodki z macicy i uwolnij je od tkanek pozazarodkowych.</li>
	<li>Odciąć głowy zarodkom za pomocą wolframowej igły i przenieść głowy do świeżego naczynia z podłożem.</li>
	<li>Odizoluj żuchwy od głów, umieszczając igłę w jamie ustnej i przecinając ją w kierunku tyłu głowy (ryc. 1A i 1B). Izolowane żuchwy mogą być tymczasowo przechowywane w podłożu na lodzie w oczekiwaniu na siekanie.</li>
	<li>W przypadku całych plastrów żuchwy etapy E11.5-E15.5 są idealne do hodowli zarodków zębów. Po E15,5 rozwijająca się kość w żuchwie jest zbyt twarda do siekania. Nadal można wytwarzać plastry zębów, ale kość (kość zębowa i tworząca się wyrostek zębodołowy) musi najpierw zostać usunięta przez preparację przed siekaniem9. Ostrożnie usuń kość za pomocą igieł wolframowych i kleszczy.</li>
</ol>
3. Krojenie zarodków
<ol>
	<li>Przygotuj plastry tkanki żuchwy za pomocą standardowego rozdrabniacza do tkanek stołowych (ryc. 1C). Użyj nowego ostrza po około 200 żuchwach i upewnij się, że leży równo z tarczą montażową, gdy upadnie.</li>
	<li>Przed użyciem wyczyść tarczę montażową i ostrze 70% etanolem. Należy zachować ostrożność podczas korzystania z maszyny, ponieważ ostrze jest bardzo ostre.</li>
	<li>Ustaw rozdrabniacz na odległość cięcia od 200 do 400 μm w zależności od wieku próbki i w zależności od tego, czy wymagany jest cały zarodek zęba. Ustaw siłę ostrza na maksimum.</li>
	<li>Przenieś żuchwę na plastikową tarczę montażową za pomocą pipety lub kleszczy. Ułóż żuchwę na dysku, upewniając się, że orientacja jest nadal jasna. Rozwijający się język może być używany jako przydatny punkt orientacyjny do określania orientacji. W przypadku zębów trzonowych należy zastosować orientację czołową/poprzeczną (patrz płaszczyzna siekania na rysunku 1B), natomiast w przypadku siekaczy należy użyć strzałkowego przekroju przez żuchwę, aby odzwierciedlić różną orientację tych zębów w miarę ich wzrostu (patrz płaszczyzna siekania na rysunku 2A).</li>
	<li>Usuń nadmiar pożywki z okolic tkanki za pomocą bibuły filtracyjnej, aby lekko wysuszyć żuchwę na tarczy montażowej.</li>
	<li>Natychmiast po wysuszeniu umieść tarczę na okrągłym stole ze stali nierdzewnej rozdrabniacza. Włącz maszynę i naciśnij start. Stół przesuwa się automatycznie od lewej do prawej, podczas gdy w tym samym czasie ramię tnące przenoszące ostrze jest podnoszone i opuszczane z prędkością do 200 uderzeń/min.</li>
	<li>Wyłącz maszynę, gdy chusteczka zostanie całkowicie pokrojona. Upewnij się, że ramię ostrza jest w pozycji podniesionej i wyjmij tarczę. Nie wkładaj palców pod ramię ostrza ani nie pozostawiaj maszyny bez nadzoru podczas siekania.</li>
	<li>Weź krążek montażowy i natychmiast dodaj podłoże do plastrów na krążku, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu. Ostrożnie usunąć pokrojoną tkankę z dna dysku za pomocą wolframowej igły, a następnie pipetować do małej szalki Petriego z podłożem (Rysunek 2A).</li>
	<li>Oddziel plastry za pomocą igły, a następnie wybierz wycinki tkanki zawierające tkankę będącą przedmiotem zainteresowania pod mikroskopem stereoskopowym (ryc. 1D, 1E i 2B). Umieść wybrane plastry w świeżych naczyniach z kulturami z podłożem.</li>
</ol>
4. Kultura Slice
<ol>
	<li>Przygotować naczynia do hodowli narządów w studzience centralnej, gotowe do hodowli, dodając około 2 ml autoklawowanej wody do zewnętrznej studzienki, aby zapobiec odwodnieniu, oraz umieszczając metalową siatkę w poprzek środka naczynia (ryc. 3A i 3B).</li>
	<li>Przygotuj metalowe siatki, wycinając paski o wymiarach około 4 cm x 1,5 cm z arkuszy siatki ze stali nierdzewnej. Użyj dziurkacza, aby zrobić otwór w środku i zegnij boki, aby utworzyć naprzemienny koniec. Siatka powinna pasować płasko w poprzek środkowej studzienki, leżąc równolegle do dna naczynia (rysunki 3A i 3B). Autoklaw siatek w celu sterylizacji przed użyciem.</li>
	<li>Wytnij kawałek przezroczystej membrany z politereftalanu etylenu (PET) (wielkość porów 0,4 μm) wystarczająco duży, aby zakryć otwór w siatce. Umieść pociętą membranę w naczyniu z wybranym plasterkiem.</li>
	<li>Umieść plasterek na wierzchu membrany, a następnie ostrożnie wyjmij membranę z podłoża, tak aby plasterek był spłaszczony w środku.</li>
	<li>Umieść filtr na siatce nad okrągłym otworem pośrodku i dodaj około 1 ml pożywki hodowlanej do studzienki, aż do poziomu membrany.</li>
	<li>W celu manipulacji dodaj białka lub inhibitory małych cząsteczek do pożywki (na przykład8).</li>
	<li>Sfotografuj wycinek, aby uzyskać zapis morfologii w dniu 0 hodowli.</li>
	<li>Umieścić naczynia w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Fotografuj kultury w regularnych odstępach czasu przez średnio 7 dni. Zmieniaj pożywkę co 48-72 godziny. W przypadku fotografii obejrzyj plasterki ze źródłem światła od spodu (rysunki 2C-E).</li>
</ol>
5. Śledzenie pochodzenia
Jeśli wymagane jest śledzenie linii, barwniki lipofilowe, takie jak DiI lub DiO, mogą być wstrzyknięte do zarodka zęba przed krokiem 4, czyli pokrój hodowlę.
<ol>
	<li>Wyciągnij szklane igły kapilarne za pomocą ściągacza do igieł.</li>
	<li>Złamij końcówkę igły za pomocą kleszczy i umieść końcówkę w roztworze barwnika. Pozostaw na kilka minut, aż barwnik wypełni końcówkę metodą kapilarną.</li>
	<li>Umieść napełnioną igłę w uchwycie i przymocuj za pomocą rurki do wstrzykiwacza lub aspiratora doustnego.</li>
	<li>Umieścić końcówkę igły w pożywce hodowlanej dotykając obszaru plasterka, który ma być oznaczony. Zastosuj ciśnienie powietrza, aby wyprzeć niewielką ilość barwnika z igły na tkankę.</li>
	<li>Wyjąć igłę i sprawdzić, czy jest oznaczona pod wpływem fluorescencji.</li>
	<li>Pomyślnie oznakowane wycinki można przenieść do filtrów i hodować zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
</ol>

<ol><li>Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+dental+mesenchyme%3A+dynamic+development+of+the+dental+papilla+and+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle.</a> Developmental biology. 366, 244-254 (2012).</li>
<li>Ferguson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+is+an+essential+early+mesenchymal+signal+in+tooth+development+that+is+required+for+patterning+of+the+murine+dentition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition.</a> Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).</li>
<li>Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+of+primary+and+secondary+enamel+knots%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cell lineage of primary and secondary enamel knots.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+relationship+between+Tbx1+and+FGF+signaling+during+tooth+morphogenesis+and+ameloblast+lineage+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination.</a> Developmental biology. 320, 39-48 (2008).</li>
<li>Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+tooth+bud+mesenchyme+to+alveolar+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+zoology.+Part+B%2C+Molecular%22%5BJournal%5D)">Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone.</a> Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).</li>
<li>Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mesoderm+to+the+developing+dental+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Contribution of mesoderm to the developing dental papilla.</a> The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).</li>
<li>Buchtova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+patterning+of+the+snake+dentition+are+dependent+on+Sonic+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling.</a> Developmental biology. 319, 132-145 (2008).</li>
<li>Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+regression+of+the+dental+lamina+underlies+the+development+of+diphyodont+dentitions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions.</a> Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+enamel+knot+determines+the+position+of+the+first+buccal+cusp+in+developing+mice+molars%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars.</a> Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).</li>
<li>Sakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+dynamics+in+cervical+loop+epithelium+during+transition+from+crown+to+root%3A+implications+for+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+periodontal+research%22%5BJournal%5D)">Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation.</a> Journal of periodontal research. , (2012).</li>
<li>Fisher, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+development+in+vitro+of+the+whole+and+halved+lower+molar+tooth+germ+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse.</a> Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).</li>
<li>Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars%3A+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells%2C+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units%2C+the+cusps%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li>
<li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li>
<li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme%3A+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ta metoda hodowli zębów ma tę zaletę, że dostęp do zarodka zęba jest doskonały, co pozwala na dokładne śledzenie linii i umieszczanie koralików w nabłonku lub mezenchymie. Dzięki temu można precyzyjnie ukierunkować określone obszary rozwijającego się zarodka zęba. Podczas hodowli można śledzić zmieniającą się morfologię zarodka zęba i szybko ocenić efekt manipulacji.
Metoda ta jest jednak odpowiednia tylko w przypadku młodych zarodków zębów przed znacznym utworzeniem się tkanek twardych, takic...

Dla wielu eksperymentów ważne jest, aby móc hodować tkanki ex vivo, aby śledzić rozwój. Hodowla rozwijającej się tkanki zapewnia dostęp w określonych okresach rozwoju i umożliwia manipulowanie genami poprzez dodawanie czynników do pożywki hodowlanej lub na załadowanych kulkach oraz poprzez zastosowanie transfekcji i elektroporacji1. W przypadku wielu eksperymentów ważne jest, aby móc wizualizować tkankę w miarę jej wzrostu, na przykład, aby śledzić los komórek znakowanych rodowo, gdy tkanka przechodzi morfogenezę. Może to być szczególnie problematyczne w przypadku tkanek, które rozwijają się głęboko w zarodku, co nie jest oczywiste po wyhodowaniu bloku tkanki z zarodka. Dobrym tego przykładem są zęby, które rozwijają się w obrębie żuchwy, szczęki i przedniego wyrostka nosowego. Gdy cała żuchwa jest hodowana, można zobaczyć powierzchowne struktury zęba, ale zmiany w morfologii można analizować dopiero po przekroju utrwalonej tkanki2. Dostosowaliśmy technikę hodowli żywych plastrów, co pozwala nam śledzić rozwój zarodków zęba i zapewnia dostęp do różnych części zęba podczas rozwoju. Technika ta polega na hodowli wycinków zarodka zęba na granicy faz gaz-ciecz, przy użyciu zmodyfikowanej metody Trowella3. Te kultury warstwowe były bardzo przydatne w bezpośrednim śledzeniu morfogenezy zęba i umożliwieniu śledzenia linii różnych elementów, takich jak węzeł szkliwa oraz brodawka zębowa i mieszek włosowy1,4-7. Technika ta nie ogranicza się do zarodków myszy i została z powodzeniem zastosowana do hodowli żywych plastrów tkanki zębowej świni i węża8,9. Oprócz korzyści płynących z możliwości wizualizacji rozwoju zębów, metoda plasterkowa ma również tę zaletę, że cienkie plasterki tkanki mają zwiększony dostęp do składników odżywczych z pożywki i powietrza z inkubatora. Powoduje to lepszy wzrost zarodków zębów, które pasują do rozwoju in vivo i wykazują inwazję komórek śródbłonka do brodawki7. W przeciwieństwie do tego, zarodki zębów w całych kulturach żuchwy rozwijają się wolniej niż te in vivo, a centrum kultury jest często nekrotyczne w kulturach długotrwałych. W hodowli plastrowej ząb rozwija się w obrębie wycinka szczęki i można monitorować jego interakcję z otaczającą rozwijającą się kością i innymi tkankami. W naszej metodzie tkanka jest rozdrabniana bezpośrednio po rozwarstwieniu, bez konieczności zatapiania w podłożu10,11 i bez konieczności stosowania jakiegokolwiek systemu do mocowania tkanki do bloku tnącego. Metoda jest zatem nieinwazyjna i szybka, co pozwala na przecięcie wielu żuchw podczas jednej sesji.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>101077Y</td><td>100% etanol rozcieńczono w destylowanym H2O do 70%.</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>DiI (Sondy molekularne)</td><td>Vybrant</td><td>V-22885</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td></td> do znakowania komórek <td>Invitrogen</td><td></td><td>Cell tracker CM-DiI, C-7000</td></tr><tr><td>DiO ( Sondy molekularne)</td><td>Vybrant</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Geminator 500</td><td>Thomas</td><td>Thomas No. 3885A20</td><td>Sterylizacja na sucho</td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek McIlwain</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td>Stół standardowy</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli narządów (naczynie do hodowli narządów w studzience centralnej)</td><td>Membrany Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>(wkładki do hodowli komórkowych, 0,4 &mu; m wielkość porów)</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Membrana PET z wytrawionymi ścieżkami, format 6-dołkowy</td></tr><tr><td>Siatki metalowe (stal nierdzewna - AISI 304 - siatka)</td><td>Goodfellow</td><td>FE228710</td><td>(Fe/Cr18/Ni10)</td></tr><tr><td>AutoFlow Direct Heat CO2 Inkubator</td><td>Nuaire</td><td>NU-5500</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Intracel Ltd</td><td>051-0500-900 0-100 psi</td><td>Jednokanałowy picospritzer III</td></tr><tr><td>Kapilara szklana z żarnikiem 1 mm</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy 0,1 mm</td><td>Goodfellow</td><td>W005138</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy 0,38 mm</td><td>Rurki</td> aspiratora Goodfellow <td>W005155</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td>Używany do śledzenia linii aspiracji ust</td></tr></tbody></table>

metoda hodowli slice do śledzenia rozwoju zarodków zębów w hodowli eksplantatów

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Hodowla eksplantatów pozwala na manipulowanie rozwijającymi się organami w określonych punktach czasowych i dlatego jest ważną metodą dla biologa rozwojowego. W przypadku wielu narządów dostęp do rozwijającej się tkanki jest utrudniony, co umożliwia monitorowanie podczas hodowli ex vivo. Metoda hodowli warstwowej umożliwia dostęp do tkanki, dzięki czemu można śledzić ruchy morfogenetyczne, a określone populacje komórek mogą być celem manipulacji lub śledzenia linii.
W tym artykule opisujemy metodę hodowli plastrów, która okazała się bardzo skuteczna w hodowli zarazków zębów u wielu gatunków. Metoda zapewnia doskonały dostęp do zarodków zębów, które rozwijają się w tempie podobnym do obserwowanego in vivo, otoczone pozostałymi tkankami szczęki. Pozwala to na monitorowanie interakcji tkankowych między zębem a otaczającymi tkankami. Chociaż ten artykuł koncentruje się na zarodkach zębów, ten sam protokół można zastosować do śledzenia rozwoju wielu innych narządów, takich jak gruczoły ślinowe, chrząstka Meckela, gruczoły nosowe, język i ucho.

Aby śledzić ruch mieszka zębowego pierwszego trzonowca, wykonano czołowe przekroje żuchwy o grubości 250 μm, stosując opisaną powyżej metodę. Mieszek zębowy to warstwa mezenchymy otaczająca zewnętrzne nabłonkiem szkliwa (OEE) rozwijającego się zęba, o której wcześniej wykazano, że bierze udział w formowaniu tkanki błony dziąsłowej 6. Żuchwy wypreparowano w dniu E14.5, w stadium czapy rozwoju zęba. Na przekroju zarys nabłonka zębowego był wyraźny, a zagęszczającą się mezenchymę zębową można było zidentyfikować ...

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę hodowli zarazków zębów w wycinkach żuchwy za pomocą rozdrabniacza tkanek. Metoda ta pozwala na unikalny dostęp do zęba podczas rozwoju, zapewniając doskonałą możliwość manipulacji i śledzenia linii, niedostępną przy użyciu bardziej tradycyjnych metod hodowli.

Metoda hodowli Slice do śledzenia rozwoju zarodków zębów w hodowli eksplantatów

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest śledzenie rozwoju zębów przez kilka dni. Hodowla in vitro explan osiąga się poprzez rozwarstwienie rozwijającej się żuchwy płodu myszy na żywe plastry w celu odsłonięcia rozwijających się zarodków zębów w drugim kroku. Plastry są wybierane, umieszczane na filtrach na pożywce hodowlanej i inkubowane, aby umożliwić rozwój.Następnie wycinki są znakowane znacznikiem linii w celu śledzenia ruchu komórek w okresie hodowli, uzyskuje się wyniki, które pokazują dynamiczną naturę tkanek zębowych w miarę ich rozwoju podczas hodowli explan. Główną przewagą tej techniki nad konwencjonalną hodowlą eksplantatów jest to, że wewnętrznie rozwijające się narządy, takie jak klejnoty zębów, można obserwować przez cały okres ich rozwoju w kontekście otaczającej tkanki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy siekania i selekcji mogą być trudne, jeśli konfiguracja maszyny lub orientacja tkanki są niedokładne.Najpierw przygotuj pożywkę preparacyjną i hodowlaną dla narządów embrionalnych, dodając 1% glutaminianu i 1% streptomycyny penicyliny do 500 mililitrów zaawansowanego podłoża orła F 12 modyfikowanego ECCO. Następnie, jak opisano w artykule wideo Takahashi, Sumi przeprowadza sekcję zarodków myszy między etapami E 11.5 i E 15.5 rozwoju i umieszcza je na szalce Petriego zawierającej świeżą pożywkę. Następnie odetnij głowy zarodkom za pomocą świeżo naostrzonej sterylnej igły wolframowej i przenieś głowy do świeżego naczynia z wstępnie schłodzonym podłożem na lodzie.Następnie odizoluj żuchwy od głów, umieszczając igłę w jamie ustnej i tymczasowo tnąc w kierunku tyłu głowy. Przechowywać odizolowane żuchwy we wstępnie schłodzonym podłożu na lodzie przed podziałem na sekcje. Przed przecięciem tkanki żuchwy wyczyść tarczę montażową i ostrze rozdrabniacza tkanek 70% etanolem i upewnij się, że ostrze leży równo z tarczą montażową.Kiedy upadnie, ostrze będzie musiało zostać wymienione po przecięciu około 200 żuchw, ustaw odległość cięcia na od 200 do 400 mikrometrów w zależności od wieku próbki i w zależności od tego, czy cały zarodek zęba jest wymagany dla zarodka E 14,5, w którym wymagana jest izolacja zarodka zęba, stosuje się odległość cięcia 250 mikrometrów. Następnie przenieś żuchwę na plastikową tarczę montażową i ułóż ją tak, aby rozwijający się język znajdował się w przedniej orientacji poprzecznej. Podczas preparowania zębów trzonowych w celu wyizolowania siekaczy, weź strzałkowe plastry przez żuchwę.Po prawidłowym zorientowaniu usuń nadmiar podłoża z okolic tkanki. Używając bibuły filtracyjnej, lekko wbije żuchwę, mocując ją na miejscu na tarczy montażowej. Natychmiast po wysuszeniu bibułą filtracyjną umieść krążek na okrągłym stole rozdrabniacza ze stali nierdzewnej.Następnie ustaw siłę ostrza na maksimum, włącz maszynę i naciśnij start. Stół przesuwa się automatycznie od lewej do prawej, podczas gdy w tym samym czasie ramię tnące przenoszące ostrze jest podnoszone i opuszczane z prędkością do 200 uderzeń na minutę. Gdy chusteczka zostanie całkowicie pokrojona, wyłącz maszynę.Upewnij się, że ramię ostrza jest w pozycji podniesionej, a następnie wyjmij dysk. Pamiętaj, aby nie wkładać palców pod ramię ostrza ani nie pozostawiać maszyny bez nadzoru. Podczas siekania chusteczki weź tarczę montażową i natychmiast dodaj pożywkę do plastrów na krążku, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu.Następnie ostrożnie usunąć tkankę z plastra z dna dysku za pomocą igły wolframowej lub pipety i pipetować je do małej szalki Petriego z podłożem. Następnie oddziel poszczególne wycinki za pomocą igły, a następnie wybierz wycinki tkanki zawierające obszar zainteresowania pod mikroskopem stereoskopowym. Umieść wybrane plastry w naczyniach hodowlanych ze świeżym, średnim podłożem, przygotuj metalowe siatki do systemu hodowlanego, wycinając paski o wymiarach cztery centymetry na 1,5 centymetra z arkuszy o splocie płóciennym ze stali nierdzewnej.Następnie wybij otwór w środku za pomocą standardowego stacjonarnego dziurkacza i zegnij boki tak, aby siatka pasowała płasko w poprzek środkowej studzienki i leżała równolegle do dna naczynia. Po prawidłowym ukształtowaniu siatek wysterylizuj je w autoklawie przed użyciem. Następnie przygotuj naczynia do hodowli narządów w centralnej studni do hodowli, dodając dwa mililitry wody z autoklawu do zewnętrznej studzienki, aby zapobiec odwodnieniu.Następnie umieść sterylną metalową siatkę na środku naczynia. Wytnij kawałek przezroczystej membrany z politereftalanu etylenu o wielkości porów 0,4 mikrometra, tak aby był wystarczająco duży, aby zakryć otwór w siatce. Następnie umieść przeciętą błonę w naczyniu z wybranym plastrem żuchwy, jeśli pożądane jest śledzenie linii.Najpierw przygotuj szklaną igłę kapilarną, rysując szklankę za pomocą ściągacza do igieł. Następnie złamij końcówkę igły i umieść ją końcówką w dół w lipofilowym roztworze barwnika, takim jak dai eye lub dai o, i nabierz część roztworu barwnika przez działanie kapilarne. Po kilku minutach umieść wypełnioną igłę w uchwycie i przymocuj ją do aspiratora do ust.Umieść końcówkę igły w pożywce hodowlanej tak, aby dotykała obszaru, który ma być oznaczony, takiego jak pokazany tutaj mieszek włosowy. Następnie wypieraj niewielką ilość barwnika na tkankę. Następnie przenieś plasterek na stolik mikroskopu fluorescencyjnego i sprawdź, czy plasterek został pomyślnie oznaczony.Po pomyślnym oznaczeniu ostrożnie podnieś plasterek na wierzch membrany, a następnie przenieś membranę z pożywki z plastrem spłaszczonym w środku. Następnie umieść filtr nad okrągłym otworem w środku siatki na około jednym mililitrze pożywki hodowlanej do studzienki, aż poziom pożywki znajdzie się na poziomie membrany. W tym momencie dodaj do pożywki wszelkie białka lub inhibitory małych cząsteczek.Zobrazuj również wycinek, aby zarejestrować morfologię w dniu zero, używając mikroskopu preparacyjnego, aby uzyskać najlepszą fotografię, obejrzyj plasterki ze źródłem światła od spodu. Utrzymuj naczynia w nawilżonej atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni w regularnych odstępach czasu. Kontynuuj obrazowanie kultur, aby śledzić postępy.Pokazano tutaj serię zdjęć dokumentujących rozwój pierwszego trzonowca pęcherzyka zębowego, który jest oznaczony barwnikiem fluorescencyjnym oka. Plasterek jest przednim plasterkiem o grubości 250 mikronów wyciętym z żuchwy myszy w temperaturze E 14,5. Ząb, który jest obrysowany czarnymi kropkami, zaczyna się w fazie czapeczki w dniu zero.Czwartego dnia zarodek zęba osiągnął stadium dzwonu, a komórki mieszków włosowych rozchodzą się po łuku wokół rozwijającego się szkliwa zewnętrznego. Nabłonek Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu trzech godzin od zarodka do końcowej hodowli. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie wizualizować rozwój narządów w kulturze.

the-slice-culture-method-for-following-development-tooth-germs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne korzyści, ...

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

Organotypowe pierwotne kultury eksplantatów tkankowych, które zawierają precyzyjnie wycięte plastry, reprezentują trójwymiarową (3-D) architekturę tkanki, jak również wielokomórkowe interakcje natywnej tkanki. Ten film opisuje hodowlę wycinków tkanek pochodzących z mysiego guza płuc przy użyciu obrotowej jednostki inkubacyjnej, systemu, który umożliwia okresową ekspozycję tkanek na tlen i składniki odżywcze. Protokół opisuje metodologię generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych wycinków guza...

Hodowla eksplantatów tkanki guza płuc: procedura generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych plastrów guza płuc

Wideo pokazuje tworzenie i utrzymywanie organtypowych kultur warstwowych z tkanki glejaka. Wyizolowaną tkankę osadza się w matrycy agarozowej, a cienkie skrawki uzyskuje się za pomocą wibratomu. Sekcje te są następnie umieszczane na przepuszczalnych wkładkach membranowych w mikropłytce i hodowane w pożywce do hodowli warstwowej w celu długotrwałej konserwacji.

Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

Ten film demonstruje wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do badania interakcji między miazgą zarodkową zęba a zwojami nerwu trójdzielnego. Pokazuje rozmieszczenie tkanek wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego i zapewnia szczegółową wizualizację wzrostu neurytu nerwu trójdzielnego w kierunku zarodka zęba przez mikrorowki urządzenia. Dodatkowo podkreśla rolę czynników molekularnych pochodzących z zębów w promowaniu lub hamowaniu rozszerzania się neurytów do miazgi zarodkowej zęba, co ma...

Analiza interakcji między zarodkami zębów a zwojami nerwu trójdzielnego przy użyciu mikroprzepływowego systemu kohodowli

Współkultury stanowią cenną metodę badania interakcji między nerwami a docelowymi tkankami i narządami. Systemy mikroprzepływowe umożliwiają kokulturację zwojów nerwowych i całych rozwijających się narządów lub tkanek w różnych pożywkach hodowlanych, stanowiąc w ten sposób cenne narzędzie do badania in vitro wzajemnych oddziaływań między neuronami a ich celami.

Analiza rozwoju unerwienia zarodków zębów za pomocą urządzeń do kohodowli mikroprzepływowej

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Metoda hodowli narządów typu Trowella została wykorzystana do rozwikłania skomplikowanych sieci sygnałowych, które regulują rozwój zębów, a ostatnio do badania regulacji związanych z komórkami macierzystymi stale rosnącego siekacza myszy. Fluorescencyjne modele zwierzęce i metody obrazowania na żywo ułatwiają dogłębną analizę komórek macierzystych zębów i ich specyficznego mikrośrodowiska niszowego.

Zastosowanie hodowli narządów typu Trowell do badania regulacji komórek macierzystych zęba

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Poznaj metodę hodowli plastrów szczęki myszy do obserwacji rozwoju zawiązków zębowych w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia śledzenie ruchów komórkowych i dynamiki tkanek dentystycznych.

Metoda hodowli Slice do śledzenia rozwoju zarodków zębów w hodowli eksplantatów

Przeglądaj więcej filmów