Metoda hodowli Slice do śledzenia rozwoju zarodków zębów w hodowli eksplantatów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest śledzenie rozwoju zębów przez kilka dni. Hodowla in vitro explan osiąga się poprzez rozwarstwienie rozwijającej się żuchwy płodu myszy na żywe plastry w celu odsłonięcia rozwijających się zarodków zębów w drugim kroku. Plastry są wybierane, umieszczane na filtrach na pożywce hodowlanej i inkubowane, aby umożliwić rozwój.

Następnie wycinki są znakowane znacznikiem linii w celu śledzenia ruchu komórek w okresie hodowli, uzyskuje się wyniki, które pokazują dynamiczną naturę tkanek zębowych w miarę ich rozwoju podczas hodowli explan. Główną przewagą tej techniki nad konwencjonalną hodowlą eksplantatów jest to, że wewnętrznie rozwijające się narządy, takie jak klejnoty zębów, można obserwować przez cały okres ich rozwoju w kontekście otaczającej tkanki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy siekania i selekcji mogą być trudne, jeśli konfiguracja maszyny lub orientacja tkanki są niedokładne.

Najpierw przygotuj pożywkę preparacyjną i hodowlaną dla narządów embrionalnych, dodając 1% glutaminianu i 1% streptomycyny penicyliny do 500 mililitrów zaawansowanego podłoża orła F 12 modyfikowanego ECCO. Następnie, jak opisano w artykule wideo Takahashi, Sumi przeprowadza sekcję zarodków myszy między etapami E 11.5 i E 15.5 rozwoju i umieszcza je na szalce Petriego zawierającej świeżą pożywkę. Następnie odetnij głowy zarodkom za pomocą świeżo naostrzonej sterylnej igły wolframowej i przenieś głowy do świeżego naczynia z wstępnie schłodzonym podłożem na lodzie.

Następnie odizoluj żuchwy od głów, umieszczając igłę w jamie ustnej i tymczasowo tnąc w kierunku tyłu głowy. Przechowywać odizolowane żuchwy we wstępnie schłodzonym podłożu na lodzie przed podziałem na sekcje. Przed przecięciem tkanki żuchwy wyczyść tarczę montażową i ostrze rozdrabniacza tkanek 70% etanolem i upewnij się, że ostrze leży równo z tarczą montażową.

Kiedy upadnie, ostrze będzie musiało zostać wymienione po przecięciu około 200 żuchw, ustaw odległość cięcia na od 200 do 400 mikrometrów w zależności od wieku próbki i w zależności od tego, czy cały zarodek zęba jest wymagany dla zarodka E 14,5, w którym wymagana jest izolacja zarodka zęba, stosuje się odległość cięcia 250 mikrometrów. Następnie przenieś żuchwę na plastikową tarczę montażową i ułóż ją tak, aby rozwijający się język znajdował się w przedniej orientacji poprzecznej. Podczas preparowania zębów trzonowych w celu wyizolowania siekaczy, weź strzałkowe plastry przez żuchwę.

Po prawidłowym zorientowaniu usuń nadmiar podłoża z okolic tkanki. Używając bibuły filtracyjnej, lekko wbije żuchwę, mocując ją na miejscu na tarczy montażowej. Natychmiast po wysuszeniu bibułą filtracyjną umieść krążek na okrągłym stole rozdrabniacza ze stali nierdzewnej.

Następnie ustaw siłę ostrza na maksimum, włącz maszynę i naciśnij start. Stół przesuwa się automatycznie od lewej do prawej, podczas gdy w tym samym czasie ramię tnące przenoszące ostrze jest podnoszone i opuszczane z prędkością do 200 uderzeń na minutę. Gdy chusteczka zostanie całkowicie pokrojona, wyłącz maszynę.

Upewnij się, że ramię ostrza jest w pozycji podniesionej, a następnie wyjmij dysk. Pamiętaj, aby nie wkładać palców pod ramię ostrza ani nie pozostawiać maszyny bez nadzoru. Podczas siekania chusteczki weź tarczę montażową i natychmiast dodaj pożywkę do plastrów na krążku, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu.

Następnie ostrożnie usunąć tkankę z plastra z dna dysku za pomocą igły wolframowej lub pipety i pipetować je do małej szalki Petriego z podłożem. Następnie oddziel poszczególne wycinki za pomocą igły, a następnie wybierz wycinki tkanki zawierające obszar zainteresowania pod mikroskopem stereoskopowym. Umieść wybrane plastry w naczyniach hodowlanych ze świeżym, średnim podłożem, przygotuj metalowe siatki do systemu hodowlanego, wycinając paski o wymiarach cztery centymetry na 1,5 centymetra z arkuszy o splocie płóciennym ze stali nierdzewnej.

Następnie wybij otwór w środku za pomocą standardowego stacjonarnego dziurkacza i zegnij boki tak, aby siatka pasowała płasko w poprzek środkowej studzienki i leżała równolegle do dna naczynia. Po prawidłowym ukształtowaniu siatek wysterylizuj je w autoklawie przed użyciem. Następnie przygotuj naczynia do hodowli narządów w centralnej studni do hodowli, dodając dwa mililitry wody z autoklawu do zewnętrznej studzienki, aby zapobiec odwodnieniu.

Następnie umieść sterylną metalową siatkę na środku naczynia. Wytnij kawałek przezroczystej membrany z politereftalanu etylenu o wielkości porów 0,4 mikrometra, tak aby był wystarczająco duży, aby zakryć otwór w siatce. Następnie umieść przeciętą błonę w naczyniu z wybranym plastrem żuchwy, jeśli pożądane jest śledzenie linii.

Najpierw przygotuj szklaną igłę kapilarną, rysując szklankę za pomocą ściągacza do igieł. Następnie złamij końcówkę igły i umieść ją końcówką w dół w lipofilowym roztworze barwnika, takim jak dai eye lub dai o, i nabierz część roztworu barwnika przez działanie kapilarne. Po kilku minutach umieść wypełnioną igłę w uchwycie i przymocuj ją do aspiratora do ust.

Umieść końcówkę igły w pożywce hodowlanej tak, aby dotykała obszaru, który ma być oznaczony, takiego jak pokazany tutaj mieszek włosowy. Następnie wypieraj niewielką ilość barwnika na tkankę. Następnie przenieś plasterek na stolik mikroskopu fluorescencyjnego i sprawdź, czy plasterek został pomyślnie oznaczony

Po pomyślnym oznaczeniu ostrożnie podnieś plasterek na wierzch membrany, a następnie przenieś membranę z pożywki z plastrem spłaszczonym w środku. Następnie umieść filtr nad okrągłym otworem w środku siatki na około jednym mililitrze pożywki hodowlanej do studzienki, aż poziom pożywki znajdzie się na poziomie membrany. W tym momencie dodaj do pożywki wszelkie białka lub inhibitory małych cząsteczek.

Zobrazuj również wycinek, aby zarejestrować morfologię w dniu zero, używając mikroskopu preparacyjnego, aby uzyskać najlepszą fotografię, obejrzyj plasterki ze źródłem światła od spodu. Utrzymuj naczynia w nawilżonej atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni w regularnych odstępach czasu. Kontynuuj obrazowanie kultur, aby śledzić postępy.

Pokazano tutaj serię zdjęć dokumentujących rozwój pierwszego trzonowca pęcherzyka zębowego, który jest oznaczony barwnikiem fluorescencyjnym oka. Plasterek jest przednim plasterkiem o grubości 250 mikronów wyciętym z żuchwy myszy w temperaturze E 14,5. Ząb, który jest obrysowany czarnymi kropkami, zaczyna się w fazie czapeczki w dniu zero.

Czwartego dnia zarodek zęba osiągnął stadium dzwonu, a komórki mieszków włosowych rozchodzą się po łuku wokół rozwijającego się szkliwa zewnętrznego. Nabłonek Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu trzech godzin od zarodka do końcowej hodowli. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie wizualizować rozwój narządów w kulturze.