Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego
21 grudnia 2013
Opisujemy metodę wszczepiania i utrzymywania szklanych okien nad odsłoniętymi rdzeniami kręgowymi dorosłych myszy do badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia. Okna te zapewniają przewlekły dostęp optyczny do rdzenia kręgowego w celu monitorowania dynamiki komórek na poziomie subkomórkowym u żywych zwierząt za pomocą mikroskopii dwufotonowej.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie widoku z okna rdzenia kręgowego i dorosłych myszy w celu zbadania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia za pomocą podłużnej przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej. Osiąga się to poprzez wszczepienie najpierw zacisku rdzeniowego w celu podparcia kręgów do operacji i obrazowania. Kolejnym krokiem jest odsłonięcie rdzenia kręgowego i przygotowanie bocznych krawędzi kręgów do podparcia szklanego okna.
Następnie wszczepia się w okno cienką warstwę elastomeru silikonowego między oknem a oponą twardą. Ostatnim krokiem kilka tygodni po implantacji jest indukcja EAE u wszczepionych myszy. Ostatecznie wyniki mogą pokazać czasoprzestrzenne zmiany w rozmieszczeniu komórek i interakcjach komórkowych w rdzeniach kręgowych myszy EAE przy użyciu dwóch mikroskopii fotonowych.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Metoda może być trudna do nauczenia, ponieważ jest wrażliwa na czas i wymaga dużej precyzji. Zacznij od znieczulenia dorosłej myszy podczas operacji i nałożenia maści do oczu.
Jego grzbiet o szerokości około dwóch centymetrów i długości pięciu centymetrów był wyśrodkowany na garbie piersiowym i oczyszczał odsłoniętą skórę za pomocą mydła jodowego, a następnie roztworu jodu. Za pomocą nożyczek do tkanek przetnij skórę grzbietową wzdłuż około dwóch centymetrów nad T 11 do L jeden. Następnie za pomocą skalpela wykonaj obustronne podłużne nacięcia między wyrostkami kolczystymi i poprzecznymi od T 11 do L.
Zawieś mysz w widelcu kręgosłupa stereotaktycznie, najpierw zaciskając prawy górny widelec kręgosłupa na miejscu. Po drugie, chwyć T 11 za pomocą dodatkowych kleszczy i umieść wyrostek poprzeczny T 11 nad nieruchomym widelcem kręgosłupa, stosując tę samą procedurę, ustawiając L jeden w widelcu kręgosłupa. Teraz za pomocą skalpela numer 23 delikatnie zeskrob mięśnie między wyrostkami kolczystymi i poprzecznymi od T 11 do L jeden, aby lemoniada była wyraźnie widoczna.
Aby uzyskać lepszy widok na szypułki T 11, odetnij ścięgno wystające z wierzchołka wyrostka poprzecznego. Opłucz zmodyfikowane zszywki uzupełnionym PBS. Następnie włóż końcówki zszywek bocznie do szypułek kręgów T 11 i L.
Dostosuj odległość między końcówkami tak, aby lekko dotykały szypułek Przyklej, zszywki umieść na miejscu z niewielką kroplą cyjanoakrylanu w każdym punkcie włożenia i wyjmij mysz z widełek kręgosłupa. Teraz nałóż cienką warstwę cyjanoakrylanu na przecięte krawędzie skóry i odsłonięte mięśnie wokół oczyszczonych kręgów. Uważaj, aby nie przykleić kręgów.
Zegnij końcówki zmodyfikowanego spinacza tak, aby wchodziły pod wystające odcinki wszczepionych zszywek i spoczywały równolegle do długiej osi izolowanego kręgosłupa i pozostaw w tej pozycji. Zaczynając od interfejsu mięśni skóry, nałóż kilka warstw cementu dentystycznego, aby pokryć cały otwór, z wyjątkiem odsłoniętych kręgów, uważając, aby bezpiecznie wszczepić spinacz w cement dentystyczny. Po pięciu do 15 minutach cement dentystyczny utwardzi się.
Następnie przymocuj mysz do urządzenia, które może bezpiecznie chwycić odsłoniętą część spinacza do papieru bez powodowania naprężeń klipsa lub komory. Za pomocą kleszczy usuń mięśnie i inne tkanki miękkie między wyrostkami kolczystymi a laminatem odsłoniętych kręgów. Teraz za pomocą wiertła do usuwania kości, a następnie obustronnie laminat T 12 i T 13.
Następnie przystąp do usunięcia kości grzbietowej. Chwyć wyrostek kolczysty kleszczami i podnieś, uważając, aby nie wywierać siły skierowanej w dół w kierunku rdzenia kręgowego. Jeśli kość nie odchodzi łatwo, kontynuuj rozrzedzanie blaszki, aż kręgosłup zostanie przetworzony, można go łatwo usunąć.
Za pomocą wiertła do usuwania kości kontynuuj kształtowanie bocznych krawędzi kręgów, aby utworzyć strukturę podporową. Do okna. Delikatnie usuń wszystkie małe fragmenty kości stykające się z oponą twardą.
Używając kleszczy, pamiętaj o utrzymaniu wilgotności opony twardej. Korzystając z PBS, wybierz jedno z przygotowanych okien, które jest nieco szersze niż otwór laminektomii i sprawdź, jak dobrze opiera się na odsłoniętej kości. Idealnie, okno będzie spoczywać obustronnie na obu kręgach, tak aby środek okna dotykał opony twardej.
Okienko nie powinno jednak uciskać rdzenia kręgowego, nawet gdy popycha okienko w kierunku rdzenia kręgowego. Jeśli okno jest niezrównoważone lub spoczywa nad oponą twardą, należy dodatkowo ukształtować boczne krawędzie kręgów. Gdy będziesz zadowolony z laminektomii, umieść mały kawałek bibuły nasączonej PBS na rdzeniu kręgowym, aby zapobiec wysuszeniu opony twardej i odłóż mysz na bok.
Namocz okno w roztworze czyszczącym na kilka sekund. Następnie za pomocą kawałka chusteczki soczewki mikroskopu wytrzyj okno do sucha mikroskopem chirurgicznym. Sprawdź, czy okno jest czyste.
W przeciwnym razie powtórz proces czyszczenia. Następnie utrzymuj okno w czystym miejscu, gotowe do implantacji. Nałożenie elastomeru silikonowego na rdzeń kręgowy, a następnie umieszczenie okienka, musi być wykonane szybko, najlepiej w mniej niż 15 sekund.
Bardzo ważne jest, aby miejsce pracy było zaaranżowane w taki sposób, aby wszystkie materiały były łatwo dostępne. Najpierw na myszy usuń bibułkę i delikatnie usuń wszelkie zanieczyszczenia z opony twardej za pomocą kleszczyków i pozwól oponie twardej wyschnąć, aż stanie się lekko lepka. Teraz szybko napełnij silikonową rurkę miksera silikonem w temperaturze poniżej 27 stopni Celsjusza, wyciśnij silikon na czysty szkiełko, aż nie pojawią się żadne pęcherzyki.
Następnie natychmiast podaj małą kulkę silikonu wzdłuż linii środkowej odsłoniętego rdzenia kręgowego. Podnieś czyste okno za pomocą kleszczy i umieść na silikonie. Za pomocą kleszczy.
Lekko dociśnij okno, aby rozprowadziło silikon na krawędziach okna i przytrzymaj w miejscu przez około minutę. Powoli zwolnij ciśnienie z okna. Jeśli okno podnosi się po zwolnieniu ciśnienia, utrzymuj nacisk na okno, aby utrzymać je na miejscu.
Następnie nałóż cyjanoakryl, rostral i rozpieszczanie okna. Użyj wykałaczki, w razie potrzeby poprowadź cyjanoakrylan do krawędzi. Następnie poprowadź klej wzdłuż bocznych krawędzi okna, aby pokryć wszystkie otaczające mięśnie.
Zasłoń tylko zewnętrzne krawędzie okna, w przeciwnym razie przejrzystość optyczna zostanie naruszona. Niewystarczająca ilość kleju spowoduje powstawanie pęcherzyków powietrza między silikonem a okienkiem, aby chronić cyjanoakrylany i zwiększyć integralność strukturalną komory. Nałóż cement dentystyczny na wszystkie obszary pokryte cyjanoakrylanem.
Podobnie jak w przypadku cyjanoakrylanu, zacznij od krawędzi rostral i coddle i prowadź cement dentystyczny wzdłuż krawędzi okna. Najpierw należy wstrzykiwać deksametazon i ril w okolice miednicy co dwa dni przez 10 dni. Wstrzyknąć deksametazon i ril, aby wstrzyknąć mysz z wszczepionym oknem.
Najpierw lekko uspokojony izofluorem w komorze indukcyjnej. Nie należy szorować myszy z wszczepionymi oknami w celu robienia zdjęć, lekko znieczulić mysz i mocno przymocować ją do uchwytu na klips za odsłoniętą część wszczepionego spinacza do papieru metodą implantacji. Większość okien była wolna w momencie wprowadzenia EAE i pozostaje jasna przez cały okres postępów EAE.
Obrazowanie dwoma fotonami było możliwe do 12 razy w ciągu 36 dni. Porównując progresję kliniczną EAE u zwierząt z wszczepionymi oknami i bez nich, myszy EAE miały niewielkie opóźnienie w wystąpieniu objawów klinicznych. Jednak po wystąpieniu objawów nie stwierdzono różnicy w ogólnej progresji ani w szczytowym wyniku klinicznym.
Oś czasu zwyrodnienia aksonów typowego dla EAE badano w rdzeniu kręgowym w trakcie progresji EAE za pomocą mikroskopii dwufotonowej intrażyciowej. Było wiele nieuszkodzonych aksonów, a także aksonów w różnych stadiach zwyrodnienia, takich jak aksony z ogniskowym obrzękiem. Zaobserwowano również rozdrobnione aksony.
Średnią liczbę nieuszkodzonych aksonów w wielu punktach czasowych w stosunku do wystąpienia objawów klinicznych policzono w pięciu. Liczenie myszy dokonywano w tym samym regionie z sesji na sesję, orientując się na markery naczyniowe w regionach zainteresowania. Liczbę aksonów z ogniskowymi obrzękami określono ilościowo, podobnie jak rozdrobnione aksony.
Liczba uszkodzonych aksonów zwiększała się wraz z wystąpieniem objawów klinicznych EAE, a pogorszenie stanu aksonów postępowało od obrzęków do fragmentacji w późniejszym czasie. Punkty Po opanowaniu operacji implantacji okiennej można ją wykonać w około półtorej godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Jest więc kilka rzeczy, na które powinniśmy zwrócić uwagę w związku z dzisiejszą operacją.
Po pierwsze, podczas implantacji okienka doszło do niewielkiego ucisku żyły centralnej. To jest to, co uważam za maksymalną dopuszczalną wielkość kompresji, zanim dojdzie do uszkodzenia aksonów. Po drugie, pod oknem w uszczelce szybkiej paczki po umieszczeniu znajdowały się bąbelki.
Kilka z tych pęcherzyków było kulistych i znajdowało się w obrębie szybkiej pieczęci, podczas gdy jedna znajdowała się między zewnętrzną częścią zarodka a szybką uszczelką. Po około 15 minutach. Ten drugi pęcherzyk został ponownie wchłonięty i naprawdę nie wpłynie to w żaden sposób na obrazowanie.
Pozostałe dwie bańki były rostralne i rozpieszczane w polu widzenia, więc nadal możemy uzyskać bardzo ładne obrazy pomiędzy tymi dwoma lokalizacjami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę implantacji szklanych okien nad odsłoniętymi rdzeniami kręgowymi dorosłych myszy w celu badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Technika ta umożliwia chroniczny dostęp optyczny do monitorowania dynamiki komórek na poziomie subkomórkowym przy użyciu mikroskopii dwufotonowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Mikroskopia
Wstęp
- Eksperymentalne autoimmune zapalenie mózgu i rdzenia jest modelem do badania stwardnienia rozsianego.
- Mikroskopia dwufotonowa umożliwia obrazowanie tkanek żywych z wysoką rozdzielczością.
- Techniki obrazowania chronicznego są niezbędne do zrozumienia progresji choroby.
- Okienka szklane ułatwiają długotrwałą obserwację interakcji komórkowych.
Cel badania
- Utworzenie okna obserwacyjnego rdzeni kręgowych u dorosłych myszy.
- Badanie dynamiki EAE za pomocą obrazowania podłużnego.
- Obserwacja spatiotemporalnych zmian w rozkładzie i oddziaływaniach komórek.
Zastosowane metody
- Implantacja zacisku kręgowego w celu stabilizacji kręgów.
- Odsłonięcie rdzenia kręgowego i przygotowanie krawędzi kręgów.
- Implantacja okna szklanego z elastomerem silikonowym.
- Indukcja EAE kilka tygodni po implantacji.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie chroniczne dynamiki rdzenia kręgowego.
- Obserwacja interakcji komórkowych u myszy z indukowanym EAE.
- Wgląd w postęp odpowiedzi autoimmunologicznych.
- Wykazanie użyteczności mikroskopii dwufotonowej w obrazowaniu na żywo.
Wnioski
- Metoda ta stanowi cenne narzędzie do badania EAE.
- Przewlekły dostęp optyczny pozwala na lepsze zrozumienie zachowania komórkowego.
- Mikroskopia dwufotonowa jest skuteczna w badaniach podłużnych u żywych zwierząt.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia chroniczne obrazowanie intravitalne patologii rdzenia kręgowego w klinicznie istotnym modelu EAE, dostarczając badaczom z sektora biofarmaceutycznego narzędzia do podłużnego monitorowania dynamiki komórkowej oraz stopnia zaangażowania celów terapeutycznych w rozdzielczości podkomórkowej. Dzięki możliwości przeprowadzania wielokrotnych sesji obrazowania w dłuższych odstępach czasu, metoda ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku kandydatów na leki immunomodulujące i zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznych ocenach skuteczności. Podejście to odpowiada potrzebom etapu odkrywania leków w zakresie powtarzalnych i ilościowych odczytów, które stanowią podstawę decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w programach dotyczących chorób autoimmunologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią obserwację degeneracji aksonalnej i dynamiki rekrutacji komórek odpornościowych w celu walidacji celów terapeutycznych w szlakach autoimmunologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną preparację chirurgiczną dla spójnych pomiarów bazowych w kohortach badawczych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wygenerowanie ilościowych wskaźników integralności aksonalnej (np. obrzęki, fragmentacja), które nadają się do wysokoprzepustowego przesiewania bibliotek związków.
- Wartość operacyjna: Standaryzowana implantacja okna redukuje zmienność w głębokości obrazowania i przejrzystości optycznej, co zwiększa powtarzalność testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia korelację wczesnych uszkodzeń aksonalnych z klinicznym początkiem EAE, wspierając wysiłki w zakresie kwalifikacji biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Przewlekły dostęp umożliwia podłużne profilowanie farmakodynamiczne immunomodulatorów u tego samego zwierzęcia, co zmniejsza zapotrzebowanie na liczebność grup badawczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, dostarczając danych z walidacji funkcjonalnej po identyfikacji celu, lecz przed optymalizacją związku wiodącego, co pozwala zespołom na ograniczenie ryzyka związanego z mechanizmami działania przy użyciu patofizjologii istotnej dla danej choroby.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących interakcji neuroimmunologicznych poprzez bezpośrednią wizualizację interakcji komórkowych w miąższu rdzenia kręgowego.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów stanu aksonów o rozdzielczości subkomórkowej, co umożliwia porównanie różnych warunków terapeutycznych.
- Analityka: Wyniki obejmują liczbę obrzęków aksonalnych, indeksy fragmentacji oraz mapy rozkładu przestrzennego, które służą do modelowania zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Łączy wczesną patologię aksonalną z progresją niepełnosprawności klinicznej, zgodnie ze strategiami biomarkerów translacyjnych w chorobach neurozapalnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma z implantowanym okienkiem może być wykorzystywana w wielu sesjach obrazowania i dostosowywana do różnych modeli chorób wymagających dostępu do rdzenia kręgowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w autoimmunologicznych schorzeniach OUN, dostarczając bezpośrednich dowodów na zależną od celu ochronę lub uszkodzenie aksonów.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane protokoły chirurgiczne i pooperacyjne zwiększają powtarzalność wyników w różnych ośrodkach i u różnych operatorów w wieloośrodkowych badaniach przedklinicznych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wcześniejsze wykrycie sygnałów zaangażowania celu, co poprawia efektywność kapitałową poprzez ograniczenie inwestycji w biologicznie nieaktywne kandydaty.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację związków modyfikujących trajektorie degeneracji aksonów przed wystąpieniem szczytowych objawów klinicznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii, zarządzania znieczuleniem oraz opieki pooperacyjnej w celu utrzymania chronicznego okna obserwacyjnego.
- Zależność od infrastruktury mikroskopii dwufotonowej, sterylnego pola operacyjnego oraz aplikacji silikonu w kontrolowanej temperaturze.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w zakresie chirurgii, obrazowania i opieki nad zwierzętami w celu zapewnienia spójnej integralności okna.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują dostosowanie poziomu odsłonięcia kręgów dla różnych obszarów rdzenia kręgowego lub modeli chorobowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują złożoność chirurgiczną, ryzyko ucisku rdzenia kręgowego podczas implantacji oraz konieczność profilaktyki przeciwzapalnej w celu utrzymania przejrzystości optycznej.
