Name: Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę wszczepiania szklanych okien rdzenia kręgowego u myszy do badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego. Technika umożliwia długoterminową obserwację dynamiki komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen i S. Meijia-Gervacio za pomocne dyskusje; M. Hocine i C. Meunier oraz personelowi ośrodków obrazowania zwierząt i PicSIL IBDML w celu uzyskania wsparcia technicznego. Prace te były wspierane przez grant instytucjonalny z Centre National de la Recherche Scientifique oraz z grantów z Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (dla G.R. i K.K.F), Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) (dla FD). Projekt K.K.F. był wspierany przez stypendium ARSEP. Obrazowanie wykonano na ośrodku obrazowania PIcSIL IBDML.

1. Przygotowanie okien i konstrukcji wsporczych
<ol>
	<li>Przygotowanie okna - przygotuj kilka okien o różnych rozmiarach (szerokość = 1,8-2,2 mm; długość = 4,5-5,2 mm) do implantacji.
	<ol>
		<li>Wykonanie zmodyfikowanego zadzioru wiertarskiego do cięcia szkła nakrywkowego - za pomocą dużej ilości cementu dentystycznego przymocuj zadzior wiertniczy do wału (w naszym przypadku starych zacisków Bulldog). Upewnij się, że zadzior znajduje się pod kątem ~45° w stosunku do wału, aby ułatwić obsługę. 
		Uwaga: rysiki diamentowe sprawdzają się również przy cięciu szkła nakrywkowego.</li>
		<li>Wykonanie szkiełka A - za pomocą standardowego szkiełka mikroskopowego przyklej krótki kawałek papieru linijkowego (~2 cm) do dolnej części szkiełka, tak aby można było zobaczyć linijkę przez szkło. Następnie umieść kawałek taśmy wzdłuż krawędzi znaku 0 mm linijki, aby w następnym kroku działał jako mocowanie do szkła nakrywkowego.</li>
		<li>Używając zmodyfikowanego zadziora wiertarskiego, szkiełka A i niezmodyfikowanego szkiełka mikroskopowego (szkiełko B), umieść kawałek szkła nakrywkowego (grubość nr 1.5) do oznaczenia 0 mm na szkiełku A. Użyj suwaka B, aby przytrzymać szkło nakrywkowe na miejscu i jako przyrząd do zamierzonej linii cięcia. Pokrój szkło nakrywkowe na długi prostokąt o wymiarach około 5 x 22 mm. Obróć przycięte szkło o 90° i przytnij prostokąt na mniejszy prostokąt o wymiarach ~2 x 5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modyfikacja zszywek - zostaną wszczepione dwie zmodyfikowane zszywki w celu podparcia i przymocowania komory okiennej do kręgów (patrz punkt 2.7-8).
	<ol>
		<li>Za pomocą standardowej małej zszywki (korona = 8 mm; noga = 4 mm), zegnij środek korony ~90°, tak aby końcówki nóg prawie się stykały.</li>
		<li>Zegnij końcówki nóg na zewnątrz ~45° w połowie drogi, tak aby dystalna połowa nóg była równoległa.</li>
		<li>Zegnij dystalną połowę nóg ~ 30° w górę w stosunku do płaszczyzny zszywki. Umieść zmodyfikowane zszywki w etanolu przed zabiegiem w celu sterylizacji. 
		Uwaga: Zszywki można również sterylizować za pomocą tlenku etylenu lub sterylizować w autoklawie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modyfikacje spinacza - należy przygotować jeden zmodyfikowany spinacz do wszczepienia jako część komory (patrz punkty 2.9-10) i pełnić funkcję klipsa do przytrzymywania podczas operacji i obrazowania.
	<ol>
		<li>Za pomocą standardowego spinacza do papieru o średnicy 25 mm usuń małe zagięcie, pozostawiając wydłużony kształt litery U.</li>
		<li>Za pomocą szczypiec lub igieł zmniejsz średnicę zgięcia do ~2 mm, utrzymując końcówki równolegle.</li>
		<li>Zegnij końcówki na zewnątrz ~90° w odległości około 8-10 mm od zagięcia. Dokonaj niezbędnych regulacji, aby leżał płasko.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Implantacja okienna
Uwaga: Wszystkie zabiegi chirurgiczne i pielęgnacyjne dla zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich i zostały zatwierdzone przez Narodowy Komitet Badań nad Zwierzętami we Francji (numer autoryzacji 13,300).
<ol>
	<li>Znieczulić mysz (Ket/Xyl; dawka indukcyjna: 120 mg/kg, 12 mg/kg; dawka uzupełniająca, 40 mg/kg, 4 mg/kg), nałożyć maść do oczu na oczy.</li>
	<li>Ogolić jego grzbiet o szerokości około ~2 cm i długości ~5 cm, wyśrodkowany na garbie piersiowym i oczyść odsłoniętą skórę mydłem jodowym, a następnie roztworem jodu. Wyczyść rękawice, spryskując je 90% etanolem. </li>
	<li>Za pomocą nożyczek do tkanek przetnij skórę grzbietową wzdłuż kręgów od T11 do L1 (~2 cm). Za pomocą skalpela wykonaj obustronne podłużne nacięcia między wyrostkami kolczystymi i poprzecznymi od T11 do L1. Uwaga: Jeśli rękawice lub narzędzia dotykają sierści lub skóry zwierzęcia, wyczyść rękawice lub narzędzie za pomocą zimnego sterylizatora, takiego jak 90% etanol lub Germ-X.</li>
	<li>Zawieś mysz w widelcu kręgosłupa stereotaktycznym - Zacznij od zaciśnięcia prawego górnego widelca kręgosłupa na miejscu. Chwyć T11 za pomocą kleszczy Adson i umieść wyrostek poprzeczny T11 nad nieruchomym widelcem kręgosłupa. Trzymając kręg na miejscu, zapnij przeciwległy widelec rdzeniowy pod przeciwległym wyrostkiem poprzecznym.</li>
	<li>Stosując tę samą procedurę, co w kroku 2.4, umieść L1 w widelcu kręgosłupa.</li>
	<li>Za pomocą skalpela (nr 23) delikatnie zeskrob mięśnie między wyrostkami kolczystymi i poprzecznymi od T11 do L1, tak aby blaszki były wyraźnie widoczne. Aby uzyskać lepszy widok na szypułki T11, odetnij ścięgno wystające rostralnie z czubka wyrostka poprzecznego.</li>
	<li>Opłucz zmodyfikowane zszywki PBS i włóż końcówki zszywek bocznie do szypułek kręgów T11 i L1, regulując odległość między końcówkami tak, aby lekko dotykały szypułek. 
	Uwaga: Należy stosować wyłącznie PBS zawierający deksametazon (0,1%), penicylinę (1 000 j./ml) i streptomycynę (1 mg / ml), w celu zmniejszenia stanu zapalnego pooperacyjnego i poprawy przejrzystości okna.</li>
	<li>Przyklej zszywki niewielką kroplą cyjanoakrylanu w każdym punkcie włożenia i wyjmij mysz z wideł kręgosłupa.</li>
	<li>Nałóż cienką warstwę cyjanoakrylanu na przecięte krawędzie skóry i odsłonięte mięśnie wokół oczyszczonych kręgów, uważając, aby nie skleić kręgów. Zegnij końcówki zmodyfikowanego spinacza tak, aby wchodziły pod wystające odcinki wszczepionych zszywek i spoczywały równolegle do długiej osi izolowanego kręgosłupa i pozostaw w tej pozycji.</li>
	<li>Zaczynając od granicy skóra-mięsień, nałóż kilka warstw cementu dentystycznego, aby pokryć cały otwór z wyjątkiem odsłoniętych kręgów, upewniając się, że spinacz do papieru jest bezpiecznie osadzony w cemencie dentystycznym.</li>
	<li>Po utwardzeniu cementu dentystycznego (5-15 minut) przymocuj mysz do "uchwytu na klips" za odsłoniętą część wszczepionego spinacza do papieru. Za pomocą kleszczy usuń mięśnie i inne tkanki miękkie między wyrostkami kolczystymi a blaszkami odsłoniętych kręgów. 
	Uwaga: Każde urządzenie, które może bezpiecznie chwycić odsłoniętą część spinacza bez powodowania naprężeń klipsa/komory i może być manewrowane w celu zmiany orientacji myszy podczas operacji, może być używane jako "uchwyt na klips</li>".
	<li>Za pomocą wiertła do usuwania kości rozcieńczyć blaszki T12 i T13 obustronnie. Aby usunąć kość grzbietową, chwyć wyrostek kolczysty kleszczami i podnieś, uważając, aby nie wywierać siły w dół w kierunku rdzenia kręgowego. Jeśli kość nie odchodzi łatwo, kontynuuj rozrzedzanie blaszek, aż wyrostek kolczysty będzie można łatwo usunąć.</li>
	<li>Za pomocą wiertła do usuwania kości kontynuuj kształtowanie bocznych krawędzi kręgów, aby utworzyć konstrukcję nośną okna. Delikatnie usuń wszystkie małe fragmenty kości dotykające opony twardej za pomocą kleszczy. Pamiętaj, aby utrzymać wilgotność opony twardej za pomocą PBS.</li>
	<li>Wybierz jedno z przygotowanych okien, które jest nieco szersze niż otwór laminektomii i sprawdź, jak dobrze opiera się na odsłoniętej kości. Idealnie byłoby, gdyby okno spoczywało obustronnie na obu kręgach, tak aby środek okna dotykał opony twardej (ryc. 1a). Okienko nie powinno jednak uciskać rdzenia kręgowego nawet podczas popychania okienka w kierunku rdzenia kręgowego. Jeśli okienko jest niewyważone lub spoczywa nad oponą twardą, powtórz krok 2.13.</li>
	<li>Gdy będziesz zadowolony z laminektomii, umieść mały kawałek autoklawowanej bibuły nasączonej PBS na rdzeniu kręgowym, aby zapobiec wysuszeniu opony twardej i odłóż mysz na bok.</li>
	<li>Mycie okna - umieść okno w roztworze płynu do mycia okien na kilka sekund. Za pomocą kawałka chusteczki do soczewek mikroskopu wytrzyj okno do sucha. Za pomocą mikroskopu chirurgicznego sprawdź, czy okno jest czyste, a jeśli nie, powtórz proces czyszczenia. Umieść okno w czystym miejscu z łatwym dostępem w celu szybkiego wyjęcia i umieszczenia okna w kroku 2.19.</li>
	<li>Chwyć mysz i wyjmij bibułę. Delikatnie usuń wszelkie zanieczyszczenia z opony twardej za pomocą kleszczy i pozwól oponie twardej wyschnąć, aż stanie się lekko lepka.</li>
	<li>Szybko napełnij silikonową rurkę miksera (Kwik-sil) i wyciśnij silikon na czysty szkiełko, aż z końcówki nie będą wydobywać się pęcherzyki. Natychmiast podaj małą kulkę silikonu wzdłuż linii środkowej odsłoniętego rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Wyjmij umyte okna za pomocą kleszczy i natychmiast umieść na silikonie. Za pomocą kleszczyków przyłóż niewielką siłę nacisku na okno, aby rozprowadzić silikon na krawędziach okna i przytrzymaj w miejscu przez ~1 min. 
	Uwaga: Przed zmieszaniem silikon należy przechowywać w temperaturze poniżej 27 °C, w przeciwnym razie czas utwardzania może się znacznie wydłużyć i nie będzie przylegał do okienka lub opony twardej, co prowadzi do zmniejszenia przejrzystości optycznej.</li>
	<li>Powoli zwolnij ciśnienie z okna. Jeśli okno się nie porusza, przejdź natychmiast do kroku 2.21. Jeśli jednak okno podnosi się po zwolnieniu nacisku (tj. ruchy kręgów), przejdź do kroku 2.21, utrzymując nacisk na okno, aby utrzymać je na miejscu.</li>
	<li>Zastosuj cyjanoakrylan rostral i ogonowy okna. Jeśli cyjanoakrylan nie zakrywa rostralnych i ogonowych krawędzi okna, użyj wykałaczki, aby poprowadzić część płynnego cyjanoakrylanu przez te krawędzie. Następnie poprowadź klej wzdłuż bocznych krawędzi okienka (ryc. 1a), aby pokryć wszystkie otaczające mięśnie. Uwaga: Sicyjanoakrylan powinien pokrywać powierzchnię zewnętrznych krawędzi okna. Zbyt dużo cyjanoakrylanu może zagrozić przejrzystości optycznej, niewystarczająca ilość cyjanoakrylanu spowoduje powstawanie pęcherzyków powietrza między silikonem a oknem.</li>
	<li>Aby chronić cyjanoakrylan i zwiększyć integralność strukturalną komory, należy nałożyć cement dentystyczny na wszystkie obszary pokryte cyjanoakrylanem (rysunek 1a). Podobnie jak w przypadku cyjanoakrylanu, zacznij od krawędzi rostralnej i ogonowej i użyj małego drewnianego patyczka, aby poprowadzić cement dentystyczny wzdłuż krawędzi okna.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna, indukcja EAE i konserwacja okien
<ol>
	<li>Wstrzyknąć deksametazon (0,2 mg/kg) i rimadyl (5 mg/kg) domięśnie domięśniowo w okolice miednicy. Przenieś mysz do ciepłej klatki (~26 °C) z materiałem do zagnieżdżania. Myszy powinny być w pełni mobilne, eksplorować klatkę i pielęgnować po całkowitym ustąpieniu działania środka znieczulającego (zwykle 2-3 godziny). Trzymaj zwierzęta indywidualnie i upewnij się, że mają łatwy dostęp do jedzenia i wody przez pierwsze 1-2 dni. Gdy mysz zacznie dochodzić do siebie po znieczuleniu, wstrzyknij buprenorfinę (0,05 mg/kg) doq. Po pełnym wyzdrowieniu po znieczuleniu mysz nie powinna wykazywać żadnych oznak bólu. Uwaga: Po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia wszelkie oznaki bólu lub nieprawidłowej aktywności motorycznej wskazują, że okienko nie zostało prawidłowo wszczepione.</li>
	<li>Deksametazon (0,2 mg/kg) i rimadyl (5 mg/kg) należy wstrzykiwać co 2 dni przez pierwsze 10 dni po zabiegu chirurgicznym (ryc. 1a). Aby wstrzyknąć myszom okienka, lekko uspokój zwierzę izofluranem w komorze indukcyjnej (~1,75% izofluranu w powietrzu przez 1-2 minuty). Wyjmij mysz z komory i natychmiast wstrzyknij leki. Mysz powinna być w pełni obudzona w ciągu <1 min. 
	Uwaga: Nie należy szorować myszy z wszczepionymi oknami, ponieważ może to spowodować oddzielenie skóry od implantu. Możliwe jest wstrzyknięcie myszom i.p. bez sedacji, pozwalając im chwycić pokrywę klatki przednimi łapami i delikatnie unosząc tylne kończyny. Jednak w tej pozycji mysz czasami się odsuwa, powodując naprężenia w wszczepionym oknie. Może to prowadzić do krwawienia między okienkiem a rdzeniem kręgowym, pogarszając w ten sposób przejrzystość optyczną.</li>
	<li>EAE można wywołać po 2-3 tygodniach od zaprzestania leczenia przeciwzapalnego (~3-4 tygodnie po zabiegu). Lekko uspokój mysz zgodnie z opisem w kroku 3.2. Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i utrzymuj sedację za pomocą maski izofranowej umieszczonej na nosie.</li>
	<li>Wstrzyknąć peptyd MOG35-55 (75 μg w adiuwant Freunda zawierający 800 μg Mycobacterium tuberculosis) w 3 różne miejsca s.q. (obustronnie nad kością udową i u podstawy ogona) oraz toksynę krztuśca (400 ng) i.p.14,15 
	Uwaga: Myszy z EAE wymagają dodatkowej opieki w porównaniu z myszami z samym systemem Windows. Waż myszy EAE codziennie i miej pewność, że przez cały czas mają łatwy dostęp do jedzenia i wody. Suplement z 3% galaretką agarozową zawierającą w celu utrzymania nawodnienia i wagi zwierząt. Glukozę (1-3%) można również dodać do galaretki, aby uzyskać dodatkowe kalorie.</li>
	<li>Dwa dni po indukcji EAE powtórz protokół sedacji opisany w kroku 3.2 i wstrzyknij drugą dawkę toksyny krztuścowej (400 ng) i.p.</li>
	<li>Aby zobrazować rdzeń kręgowy, najpierw uspokój zwierzę zgodnie z opisem w kroku 3.2 i lekko znieczulej ketaminą/ksylazyną (100 mg/kg; 10 mg/kg) i.p. Zapewni to ~ 1 godzinę obrazowania.</li>
	<li>W przypadku sesji obrazowania trwających <2 godziny lekkie znieczulenie można utrzymać poprzez dodatkowe wstrzyknięcia ketaminy/ksylazyny (50 mg/kg; 5 mg/kg) co 45-60 minut. Alternatywnie, w przypadku dłuższych sesji obrazowania, myszy mogą być w sposób ciągły uspokajane izofluranem (0,75-1,25% izofluranu w wilgotnym powietrzu). 
	Uwaga: okna można czyścić pod mikroskopem chirurgicznym, delikatnie wycierając zanieczyszczenia rogiem chusteczki lub wacikiem z bawełnianą końcówką. Nie używaj alkoholu do czyszczenia okna, ponieważ może on degradować niektóre rodzaje cementu dentystycznego i może ochłodzić rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Po lekkim znieczuleniu mysz jest mocno przymocowana do uchwytu na klips za pomocą odsłoniętej części wszczepionego spinacza do papieru (ryc. 1b).</li>
	<li>Rdzeń kręgowy jest ustawiony prostopadle do soczewki obiektywu poprzez regulację położenia klipsa w uchwycie, regulację położenia uchwytu i regulację położenia stolika. Grzbietowa powierzchnia rdzenia kręgowego jest szybko obrazowana, a unaczynienie grzbietowe służy do określenia orientacji rdzenia kręgowego.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J. V., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+response+to+focal+necrotic+injury+inside+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate response to focal necrotic injury inside the blood-brain barrier.</a> J. Immunol. 177 (8), 5269-5277 (2006).</li>
<li>Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat. Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+by+in+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+vascular+and+axonal+networks+in+injured+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (23), 9459-9464 (2009).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerschensteiner%2C+M+%22In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal%22">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal</a>. 11 (5), 572-577 (2005).</li>
<li>Ylera, B., Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronically+CNS-injured+adult+sensory+neurons+gain+regenerative+competence+upon+a+lesion+of+their+peripheral+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon.</a> Curr. Biol. 19 (11), 930-936 (2009).</li>
<li>Dibaj, P., Nadrigny, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).</li>
<li>Dibaj, P., Steffens, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+imaging+reveals+distinct+inflammatory+activity+of+CNS+microglia+versus+PNS+macrophages+in+a+mouse+model+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS.</a> PloS One. 6 (3), (2011).</li>
<li>Johannssen, H. C., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Ca2%2B+imaging+of+dorsal+horn+neuronal+populations+in+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo Ca2+ imaging of dorsal horn neuronal populations in mouse spinal cord.</a> J. Physiol. 588 (18), 3397-3402 (2010).</li>
<li>Nikić, I., Merkler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis).</a> Nat. Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Di Maio, A., Skuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration%3A+rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS%2FPNS+border%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dorsal root regeneration: rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> J. Neurosci. 31 (12), 4569-4582 (2011).</li>
<li>Laffray, S., Pagès, S., Dufour, H., De Koninck, P., De Koninck, Y., Côté, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+movement+compensation+for+in+vivo+imaging+of+fast+cellular+dynamics+within+a+moving+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Adaptive movement compensation for in vivo imaging of fast cellular dynamics within a moving tissue.</a> PloS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> J. Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li>
<li>Kuerten, S., Angelov, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+CNS+morphology+and+immunobiology+of+different+EAE+models+in+C57BL%2F6+mice+-+a+step+towards+understanding+the+complexity+of+multiple+sclerosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparing the CNS morphology and immunobiology of different EAE models in C57BL/6 mice - a step towards understanding the complexity of multiple sclerosis).</a> Ann. Anat. 190 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur. J. Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).</li>
<li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Moreno, B., Jukes, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+inflammation+induces+axon+injury+during+brain+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Systemic inflammation induces axon injury during brain inflammation.</a> Ann. Neurol. 70 (6), 932-942 (2011).</li>
<li>Lassmann, H., van Horssen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+neurodegeneration+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of neurodegeneration in multiple sclerosis.</a> FEBS Lett. 585 (23), 3715-3723 (2011).</li>
<li>Yenari, M. A., Han, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+mechanisms+of+hypothermia+in+brain+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective mechanisms of hypothermia in brain ischaemia.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 267-278 (2012).</li>
<li>Kalmbach, A. S., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+surface+temperature+under+a+craniotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Brain surface temperature under a craniotomy.</a> J. Neurophysiol. 108 (11), 3138-3146 (2012).</li>
<li>Pérez-Nievas, B. G., García-Bueno, B., Madrigal, J. L. M., Leza, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+immobilisation+stress+ameliorates+clinical+score+and+neuroinflammation+in+a+MOG-induced+EAE+in+Dark+Agouti+rats%3A+mechanisms+implicated%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Chronic immobilisation stress ameliorates clinical score and neuroinflammation in a MOG-induced EAE in Dark Agouti rats: mechanisms implicated.</a> J. Neuroinflammation. 7, 60 (2010).</li>
<li>Bjartmar, C., Kidd, G., Mörk, S., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+disability+correlates+with+spinal+cord+axonal+loss+and+reduced+N-acetyl+aspartate+in+chronic+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neurological disability correlates with spinal cord axonal loss and reduced N-acetyl aspartate in chronic multiple sclerosis patients.</a> Ann. Neurol. 48 (6), 893-901 (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisaliśmy metodę wszczepiania i utrzymywania szklanych okien nad odsłoniętymi rdzeniami kręgowymi dorosłych myszy w celu zbadania dynamicznego postępu EAE w czasie. Podobne podejście do implantacji szklanego okna zostało wykorzystane do badania modeli urazów rdzenia kręgowego13 i może być również przydatne do badania innych patologii rdzenia kręgowego, takich jak glejaki, zapalenie opon mózgowych lub fizjologia komórkowa normalnego rdzenia kręgowego. W przypadku naszej metody stabilizacja kręgów została osiąg...

Stwardnienie rozsiane jest chorobą autoimmunologiczną OUN, która powoduje postępujące uszkodzenie mieliny i aksonów. Standardowym modelem badawczym autoimmunologicznych chorób demielinizacyjnych OUN jest EAE u dorosłych gryzoni. Jednak dynamiczne zdarzenia komórkowe leżące u podstaw progresji EAE pozostają w dużej mierze niezbadane. Jednym z podejść jest wykorzystanie przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej do wizualizacji populacji komórkowych z markerami fluorescencyjnymi przez dłuższy czas w rdzeniach kręgowych dorosłych myszy z EAE.
Mikroskopia dwufotonowa w trybie przyżyciowym to potężny sposób na badanie fizjologii komórkowej, interakcji komórkowych i dynamicznego postępu choroby u żywych zwierząt z subkomórkową rozdzielczością1. Jednak główną przeszkodą w tym podejściu jest to, że wymaga ono optycznego dostępu do obszaru zainteresowania. Na przykład szklane okna czaszki są dobrze ugruntowaną metodologią wielokrotnego obrazowania tych samych mikrostruktur w mózgu przez kilka tygodni2,3. Adaptacja tej metodologii do obrazowania rdzenia kręgowego nie jest jednak prosta i wymaga kilku modyfikacji technicznych w celu unieruchomienia grzbietowej tkanki rdzenia kręgowego w obrębie kręgów przegubowych.
Poprzednio, dostęp optyczny do rdzenia kręgowego wymagał chirurgicznego ponownego odsłonięcia rdzenia kręgowego na początku każdej sesji obrazowania i zszycia skóry zamykanej na końcu każdej sesji4-12. Te powtarzające się operacje są traumatyczne dla zwierzęcia, ograniczają liczbę i długość sesji obrazowania oraz zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia artefaktów związanych z operacją, takich jak zapalenie i uszkodzenie rdzenia kręgowego w wyniku zaburzeń mechanicznych. Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, niedawno opracowaliśmy protokół wszczepiania szklanych okien na odsłonięte rdzenie kręgowe dorosłych fluorescencyjnych myszy transgenicznych z urazowymi uszkodzeniami rdzenia kręgowego do długoterminowych eksperymentów in vivo z mikroskopią dwufotonową bez powtarzaniaoperacji. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową adaptację protokołu implantacji w kontekście jego zastosowania do badania dynamicznych zdarzeń komórkowych leżących u podstaw progresji EAE u dorosłych myszy.

<table><tbody><tr><td>Wiertło do usuwania kości</td><td>World Precision Instruments</td><td>IDEALNA MIKRO-WIERTARKA</td><td>Sprzedawane również przez Harvard Apparatus. Wystarczy każde wysokiej jakości chirurgiczne wiertło do kości.</td></tr><tr><td>Frez wiertarski (#1/4 lub 1/2 Frez okrągły z węglika spiekanego)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860 (#1/4) 501860 (#1/2)</td><td>Sprzedawane również przez Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Staples</td><td>Lyreco</td><td>5.002.567</td><td>Korona = 8 mm Noga = 4 mm</td></tr><tr><td>Spinacz</td><td></td><td></td> do papieru <td>Dowolny standardowy spinacz do papieru 25 mm</td></tr><tr><td>Sterowniki igłowe</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>12003-15</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td> <td>do tkanekFine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td>1 x 2 zęby</td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>Widelce kręgosłupa</td><td>Aparat Harvarda</td><td>724813</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>GACD</td><td>12-565 i 12-568</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Dostępny również w Coherent Scientific i Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cyjanoakrylan</td><td>Eleco-EFD</td><td>Cyanolit 201</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>7MP</td><td>Nasz mikroskop jest w konfiguracji pionowej i jest wyposażony w 5 detektorów NDD.</td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm</td><td>Odległość robocza = 1,8 mm</td></tr></tbody></table>

wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) u dorosłych gryzoni jest standardowym modelem eksperymentalnym do badania autonomicznych chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane. Tutaj przedstawiamy tani i powtarzalny protokół implantacji szklanego okna, który jest odpowiedni do mikroskopii przyżyciowej i badania dynamiki cytoarchitektury rdzenia kręgowego z rozdzielczością subkomórkową u żywych dorosłych myszy z EAE. Krótko mówiąc, chirurgicznie odsłaniamy kręgi T12-L2 i budujemy komorę wokół odsłoniętych kręgów za pomocą kombinacji cyjanoakrylanu i cementu dentystycznego. Laminektomię wykonuje się od T13 do L1, a cienką warstwę przezroczystego elastomeru silikonowego nakłada się na grzbietową powierzchnię odsłoniętego rdzenia kręgowego. Zmodyfikowane szklane szkiełko nakrywkowe wszczepia się na odsłonięty rdzeń kręgowy, uważając, aby szkło nie stykało się bezpośrednio z rdzeniem kręgowym. Aby zmniejszyć naciekanie komórek zapalnych między okienkiem a rdzeniem kręgowym, leczenie przeciwzapalne podaje się co 2 dni (zgodnie z zaleceniami komisji etycznej) przez pierwsze 10 dni po implantacji. EAE indukuje się dopiero 2-3 tygodnie po zaprzestaniu leczenia przeciwzapalnego.
Korzystając z tego podejścia, udało nam się wywołać EAE u 87% zwierząt z wszczepionymi oknami i, używając myszy Thy1-CFP-23 (niebieskie aksony w grzbietowym rdzeniu kręgowym), określiliśmy ilościowo utratę aksonów podczas progresji EAE. Podsumowując, protokół ten może być przydatny do badania rekrutacji różnych populacji komórek, a także dynamiki ich interakcji, z rozdzielczością subkomórkową i przez dłuższy czas. Ta metoda obrazowania przyżyciowego stanowi cenne narzędzie do opracowywania strategii terapeutycznych w leczeniu autoimmunologicznych chorób demielinizacyjnych, takich jak EAE.

Wykorzystanie chronicznie implantowanych okien szklanych w połączeniu z intravitalną mikroskopią dwufotonową i modelami EAE może być użytecznym narzędziem do zrozumienia mechanizmów komórkowych leżących u podstaw patologii autoimmunologicznych chorób demielinizacyjnych. Stosując naszą metodę implantacji, stwierdziliśmy, że większość okien była przejrzysta w momencie indukcji EAE i pozostawała przejrzysta przez cały okres postępu EAE (Rycina 1c). Dzięki temu podejściu ustaliliśmy, że okna pozostawały prze...

Opisujemy metodę wszczepiania i utrzymywania szklanych okien nad odsłoniętymi rdzeniami kręgowymi dorosłych myszy do badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia. Okna te zapewniają przewlekły dostęp optyczny do rdzenia kręgowego w celu monitorowania dynamiki komórek na poziomie subkomórkowym u żywych zwierząt za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie widoku z okna rdzenia kręgowego i dorosłych myszy w celu zbadania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia za pomocą podłużnej przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej. Osiąga się to poprzez wszczepienie najpierw zacisku rdzeniowego w celu podparcia kręgów do operacji i obrazowania. Kolejnym krokiem jest odsłonięcie rdzenia kręgowego i przygotowanie bocznych krawędzi kręgów do podparcia szklanego okna.Następnie wszczepia się w okno cienką warstwę elastomeru silikonowego między oknem a oponą twardą. Ostatnim krokiem kilka tygodni po implantacji jest indukcja EAE u wszczepionych myszy. Ostatecznie wyniki mogą pokazać czasoprzestrzenne zmiany w rozmieszczeniu komórek i interakcjach komórkowych w rdzeniach kręgowych myszy EAE przy użyciu dwóch mikroskopii fotonowych.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Metoda może być trudna do nauczenia, ponieważ jest wrażliwa na czas i wymaga dużej precyzji. Zacznij od znieczulenia dorosłej myszy podczas operacji i nałożenia maści do oczu.Jego grzbiet o szerokości około dwóch centymetrów i długości pięciu centymetrów był wyśrodkowany na garbie piersiowym i oczyszczał

implanting-glass-spinal-cord-windows-adult-mice-with-experimental

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Ten film demonstruje rejestrację aktywności neuronalnej mózgu przez okno optyczne u myszy transgenicznych. Myszy wyrażają białko fluorescencyjne, które umożliwia wykrywanie aktywności neuronalnej. Niewielka część czaszki jest ostrożnie usuwana w celu zainstalowania okna optycznego, a następnie czaszka jest pokrywana czarnym cementem, aby zablokować światło przed obrazowaniem.

Instalacja okien optycznych w mózgu myszy transgenicznych w celu zobrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) poprzez wstrzykiwanie peptydów pochodzących z mieliny z adiuwantem w celu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T, które migrują do mózgu. Toksyna krztuścowa jest podawana w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając tym limfocytom T i innym komórkom odpornościowym przedostanie się do mózgu. Te komórki odpornościowe powodują demielinizację, co prowadzi do...

Generowanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Źródło: Pietruczyk, E. A., et al. Laminektomia i implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje wszczepienie okienka rdzenia kręgowego znieczulonej myszy do obrazowania in vivo. Protokół stabilizuje odsłonięty rdzeń kręgowy za pomocą borokrzemianowego szkła osłonowego i wydrukowanej w 3D płyty tylnej. Metoda ta umożliwia mikroskopię dwufotonową o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania dynamiki bariery krew-mózg i interakcji nerwowo-naczyniowych.

Implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy do obrazowania in vivo

Przeszczep komórek macierzystych/progenitorowych (NPC) jest bardzo obiecujący w neurologii regeneracyjnej. Systemowe dostarczanie NPC przekształciło się w skuteczny, mało inwazyjny i bardzo skuteczny terapeutycznie protokół dostarczania komórek macierzystych do mózgu i rdzenia kręgowego gryzoni i naczelnych dotkniętych eksperymentalnym przewlekłym uszkodzeniem zapalnym ośrodkowego układu nerwowego.

Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE

W tym filmie opisujemy procedurę wszczepienia przewlekłej komory obrazowania optycznego do grzbietowego rdzenia kręgowego żywej myszy. Komora, zabieg chirurgiczny i przewlekłe obrazowanie są oceniane i demonstrowane.

Procedura wszczepienia komory rdzeniowej do podłużnego obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Ten protokół opisuje wszczepienie szklanego okienka do rdzenia kręgowego myszy w celu ułatwienia wizualizacji za pomocą mikroskopii przyżyciowej.

Laminektomia i implantacja okienka rdzenia kręgowego u myszy

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Poznaj metodę wszczepiania szklanych okien rdzenia kręgowego u myszy do badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego. Technika umożliwia długoterminową obserwację dynamiki komórkowej.

Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal

Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów