Model eksperymentalny do badania koinfekcji gruźlicą i malarią po naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei

Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie eksperymentalnego modelu mysiego, który można wykorzystać do zbadania konsekwencji jednoczesnego zakażenia gruźlicą i malarią in vivo. Osiąga się to najpierw poprzez wystawienie na działanie nich zwierząt doświadczalnych. Gruźlica zawierająca zakaźne kropelki aerozolu przy użyciu systemu narażenia wziewnego.

W drugim etapie wychwyt pożądanej liczby gruźlicy M jest weryfikowany za pomocą analizy CFU tkanki płucnej. Dzień po zakażeniu aerozolem, 40 dni później, myszy są narażone na zakaźne komary w celu naturalnego przenoszenia sporozoitów zarodźca, które odkładają się pod całą skórą podczas posiłku z krwi. W ostatnim etapie monitorowany jest rozwój pasożyta w stadium malarii we krwi poprzez analizę plam giemsa, rozmazów krwi.

Ostatecznie można wyliczyć obciążenie gruźlicą płuc i liczbę pasożytów we krwi współzakażonych zwierząt w celu określenia przebiegu odpowiednio gruźlicy i malarii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gruźlicy, koinfekcji malarii, takie jak: Jak kozakażenie pasożytem malarii wpływa na patogenezę i zwalczanie zakażenia prątkami gruźlicy? Protokół ten został opracowany w celu zbadania, w jaki sposób koinfekcja odium buri wpływa na przewlekłą fazę gruźlicy mikrobowej, immunokompetentnych myszy C 57 PL six.

Może być również stosowany do innych szczepów myszy, w tym myszy z nokautem, lub stosowany z innymi gatunkami prątków lub odium. Zacznij od ocieplenia prątków gruźlicy. Stado o znanym mianie jtk.

Po rozmrożeniu komórek użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby ostrożnie wymieszać zawiesinę pięć razy, aby rozproszyć grudki bakteryjne, unikając wytwarzania aerozoli, w zależności od pożądanej dawki infekcji przenieś wymaganą objętość materiału prątków do 50-mililitrowej probówki zawierającej sterylny PBS do końcowej objętości sześciu mililitrów. Następnie umieść zwierzęta doświadczalne pojedynczo w koszach siatkowych z przegródkami. Umieść kosze w okrągłej komorze aerozolowej i zamknij pokrywę komory.

Przymocuj nebulizator Venturiego do trzech złączy kielichowych ze stali nierdzewnej. Odessać zawiesinę prątków do 10-mililitrowej strzykawki, wyposażonej w igłę o rozmiarze 18 i przenieść strzykawkę do komory aerozolowej w zamkniętym pudełku transportowym. Teraz zdejmij nakrętkę zakrętki nebulizatora i ostrożnie wstrzyknij zawiesinę prątków do urządzenia.

Uważaj, aby uniknąć powstawania aerozolu. Wyrzuć strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty zawierającego 2% Burtona, a następnie zamknij nebulizator. Uruchom aparat do inhalacji po zakończeniu cyklu.

Upewnij się, że zawiesina prątków została całkowicie poddana nebulizacji przed otwarciem komory aerozolowej. Załóż przyłbice z respiratorem oczyszczającym powietrze z zasilaniem, a następnie wróć do klatek, wysterylizuj kosze nebulizatora i wnętrze komory aerozolowej dzień po zakażeniu aerozolem, umieść wyznaczone uśpione zwierzęta kontrolne na papierze chłonnym na desce sekcyjnej w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej i zdezynfekuj myszy 70% etanolem dla każdej myszy. Najpierw wykonaj małe nacięcie na środku brzucha, a następnie cofnij skórę nad głową zwierzęcia.

Następnie użyj nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć brzuch i klatkę piersiową. Usuń ścianę klatki piersiowej, aby płuca były dostępne, a następnie usuń je. Przenieś płuca do 15-mililitrowej probówki z dwoma mililitrami buforu homogenizacyjnego, a następnie użyj tłoka z pięciomililitrowej strzykawki, aby przecedzić tkankę przez sita o wielkości 100 mikrometrów na małą szalkę Petriego.

Za pomocą jednomililitrowej pipety wyposażonej w końcówkę barierową kilkakrotnie przepłukać sito, a następnie rozprowadzić około 250 mikrolitrów homogenatu płucnego na ośmiu płytkach agarowych. Użyj jednorazowych rozsiewaczy, aby ostrożnie pokryć płytki próbki, gdy płytki są suche. Uszczelnij każdą płytkę perfilem.

Zawiń je w folię aluminiową i inkubuj w pozycji pionowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery tygodnie. Aby zarazić myszy naiwne lub zakażone prątkami malarii przez ukąszenia komarów, umieść znieczulone zwierzęta na siatce klatek na komary, umożliwiając zakaźnym komarom przejście przez błonę, aby zapewnić pomyślne przenoszenie sporozoitów. Pozostaw myszy w klatkach na 10 do 15 minut.

Przenieś myszy z powrotem do klatek na ręcznik papierowy i przykryj je ręcznikiem papierowym, aby utrzymać je w cieple, dopóki nie obudzą się ze znieczulenia. Zabij komary, spryskując je 70% etanolem lub innymi środkami dezynfekującymi przez siatkę klatki i wysterylizuj klatki przez autoklawowanie. Aby monitorować para, użyj igły, aby przebić sam koniec żyły każdego zakażonego zwierzęcia i zebrać jedną kroplę krwi.

Na każdym końcu szkiełka użyj innego szkiełka, aby przeciągnąć jedną kroplę krwi na połowę długości dolnego szkiełka. Następnie odwróć suwak rozsiewający i użyj drugiej krawędzi do drugiego rozmazu. Umieść szkiełka w stojaku do barwienia.

Krótko utrwal rozmazy krwi w absolutnym metanolu, a następnie wysusz na powietrzu. Na zjeżdżalniach zanurz smugi w Gizie. Po 10 minutach zanurz i wyjmij szkiełka z żyłek barwiących wypełnionych wodą dejonizowaną, aby spłukać nadmiar plamy.

Na koniec wysusz szkiełka na powietrzu w pozycji pionowej. Zakażenie zwierząt doświadczalnych wywołane sporozoitem przez ukąszenia komarów skutkuje 100% wskaźnikiem infekcji, co potwierdza obecność pasożytów we krwi cztery do pięciu dni później. Jak pokazano w tabeli, zakażenie zarówno myszy niezakażonych, jak i zakażonych gruźlicą Plasmodium buri przez ukąszenia komarów skutkuje spójnym i powtarzalnym zakażeniem wszystkich zwierząt w grupie doświadczalnej.

Porównując myszy pre patiency i nieleczone myszy kontrolne ze zwierzętami zakażonymi jednocześnie Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium tuberculosis, można zaobserwować, że prepatia jest nieco opóźniona. U myszy, które zostały wstępnie zakażone Mycobacterium tuberculosis u myszy z Mycobacterium tuberculosis za pomocą systemu narażenia inhalacyjnego, powoduje pomyślne osadzanie się bakterii w płucach zwierzęcia przy stosunkowo niskiej zmienności między poszczególnymi myszami. Obciążenia prątkami w płucach zakażonych myszy czarnych C 57 są zwiększone w obecności p burga.

W przeciwieństwie do tego, współzakażone myszy mają zmniejszoną paraemię w porównaniu z pojedynczymi zakażonymi myszami zarodźca. Po tej procedurze można wykonać metody takie jak cytometria przepływowa, PCR, Eliza lub techniki histologiczne na tkankach lub płynach ustrojowych będących przedmiotem zainteresowania, aby przeanalizować odpowiedzi immunologiczne jednocześnie wywołane przeciwko pasożytom mal i gruźlicy oraz ich interakcjom w współzakażonym gospodarzu. Nie zapominaj, że praca z ludzkim patogenem gruźlicy mikrobakterii może być niezwykle niebezpieczna i należy podjąć środki, aby przez cały czas unikać narażenia na zakaźne aerozole.

Wszystkie prace doświadczalne związane z gruźlicą mikrobakterii muszą być prowadzone w obiektach o odpowiednim trzecim poziomie bezpieczeństwa biologicznego.