Transformacja i klonowanie drożdży

Drożdże, czyli Saccharomyces cerevisiae, to powszechnie stosowany prosty eukariotyczny organizm modelowy wykorzystywany w badaniach nad genetyką i biologią komórki, który pozwala na zrozumienie ludzkich procesów komórkowych. W niniejszym filmie omówiono transformację, czyli pobieranie obcego DNA przez komórkę drożdży. Przedstawione zostaną plazmidy drożdżowe, sposób przygotowania komórek drożdży do transformacji oraz szczegółowa procedura transformacji krok po kroku, a także zaprezentowano zastosowania tej podstawowej techniki.

Zanim omówimy transformację drożdży, przyjrzyjmy się najpierw rodzajowi DNA stosowanemu w tym procesie: plazmidowi. Plazmid to mała, kolista, dwuniciowa cząsteczka DNA, która może przyjmować formę superzwiniętą, co umożliwia jej łatwe przenikanie przez pory w błonie komórkowej.

Plazmidy zawierają wielostronnicowe miejsce klonowania lub MCS, w którym endonukleazy restrykcyjne, znane również jako "enzymy restrykcyjne", mogą przecinać DNA. Fragmenty DNA będące przedmiotem zainteresowania, wycięte za pomocą tych samych enzymów, mogą zostać następnie ligowane do MCS. Plazmidy zawierają również miejsce inicjacji replikacji lub ORI, które sygnalizuje komórce miejsce rozpoczęcia replikacji. Ponadto plazmidy posiadają marker selekcyjny, który pozwala komórkom drożdży zawierającym plazmid na wzrost w określonych warunkach środowiskowych. Drożdże, które nie włączyły plazmidu, nie przeżyją w pożywkach zawierających marker selekcyjny. Markery selekcyjne mogą kodować geny odpowiedzialne za oporność na leki lub geny kodujące enzymy, które umożliwiają szczepowi drożdży syntezę aminokwasów, których w przeciwnym razie nie potrafiłyby wytworzyć.

Wektory wahadłowe to plazmidy, które mogą replikować się w więcej niż jednym gatunku gospodarza. Na przykład plazmid z E. Coli może namnażać się w drożdżach. Plazmidy drożdżowe mogą być nieintegrujące lub integrujące, co oznacza, że plazmid albo łączy się z DNA genomowym, albo pozostaje niezależny.

W drożdżach stosuje się pięć różnych ogólnych typów plazmidów lub wektorów. Dwa najczęściej wykorzystywane w transformacji drożdży to episomalny plazmid drożdżowy (YEp) oraz centromeryczny plazmid drożdżowy (YCp). Oba te typy wektorów zawierają autonomiczną sekwencję replikacyjną lub ARS. ARS zawiera miejsce inicjacji replikacji i umożliwia replikację pozachromosomalną w drożdżach.

Istnieje kilka różnych procedur, które można zastosować do transformacji drożdży, w tym metoda sferoplastów, elektroporacja oraz transformacja zapośredniczona przez octan litu. W tym filmie skupimy się na procedurze z wykorzystaniem octanu litu.

W tej metodzie transformacji dodatnio naładowane kationy litu neutralizują ładunki na błonie komórkowej i plazmidowym DNA. Jednoniciowe DNA – dodane do mieszaniny transformacyjnej – wiąże się ze ścianą komórkową drożdży, pozostawiając plazmidowe DNA dostępny do pobrania przez komórki drożdży. Narażenie na nagły wzrost temperatury, czyli szok termiczny, powoduje powstanie różnicy ciśnień między wnętrzem a zewnętrzem komórki, co tworzy pory, przez które może przeniknąć plazmidowe DNA. Po obniżeniu temperatury ściana komórkowa drożdży regeneruje się, a proces transformacji zostaje zakończony.

Zacznijmy od procedury krok po kroku dotyczącej przygotowania drożdży do transformacji. Komórki drożdży należy przygotować, najpierw pobierając kolonię z płytki z agarem, a następnie namnażając ją w pożywce ekstraktu drożdżowego, peptonu i dekstrozy, w skrócie YPD – kompletnej pożywce do wzrostu drożdży.

Po pobraniu kolonii z płytki i przeniesieniu jej do pożywki YPD, kulturę inkubuje się przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem na inkubatorze z wytrząsaniem lub urządzeniu wałkowym, takim jak ten widoczny tutaj. Komórki drożdży osadza się w drodze wirowania, a następnie usuwa nadsącz. Osad komórek resuspensuje się w odpowiednim buforze lub sterylnej wodzie. Tak przygotowane kompetentne komórki drożdży zostaną wykorzystane w procedurze transformacji.

Po przygotowaniu komórek drożdży można przeprowadzić transformację, zaczynając od przygotowania mieszaniny transformacyjnej.

Mieszanina odczynników powinna zawierać: sterylną wodę destylowaną, 50% roztwór glikolu polietylenowego (PEG), 1M octanu litu, roztwór jednoniciowego DNA o stężeniu 10 mg/ml, DNA plazmidowe oraz kompetentne komórki drożdży. Dokładne proporcje każdego roztworu należy obliczyć przed rozpoczęciem eksperymentu, korzystając ze standardowego protokołu transformacji drożdży obowiązującego w danym laboratorium.

Mieszaninę inkubuje się następnie w temperaturze 30 °C przez 30 minut z wytrząsaniem. Roztwór należy mieszać, nie stosując wirówki typu vortex, aby zapobiec rozpadaniu się komórek drożdży.

Komórki poddaje się szokowi termicznemu poprzez umieszczenie ich w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 15 minut, a następnie chłodzenie na lodzie przez 2 minuty. Następnie komórki odzyskuje się poprzez wirowanie.

Komórki resuspensuje się w wodzie dwukrotnie destylowanej i wysiewa na płytki z agarem, które pozwolą na selekcję pożądanych transformantów. Płytki transformacyjne inkubuje się w temperaturze 30 °C od dwóch do czterech dni, aż do pojawienia się kolonii.

Procedury transformacji powinny zawsze obejmować płytki kontrolne dodatnie i ujemne, dopóki nie zostaną one zoptymalizowane. Kontrola dodatnia powinna stanowić zawiesina komórek drożdży z DNA plazmidowym na płytce YPD, która nie zawiera żadnego markera selekcyjnego. Dowodzi to, że komórki są zdrowe po przeprowadzeniu procedury transformacji. Płytka kontrolna ujemna powinna zawierać zawiesinę komórek drożdży na odpowiedniej płytce selekcyjnej, na przykład takiej, która zawiera antybiotyki. Na płytce nie powinny pojawić się żadne kolonie, co świadczy o braku kontaminacji.

Istnieje mnóstwo różnych zastosowań transformacji drożdży. Jednym z nich jest wykorzystanie systemu drożdżowego dwuhybrydowego do identyfikacji białek oddziałujących z badanym białkiem, zwanym białkiem przynętą (bait protein). Gdy plazmid z biblioteki potencjalnych partnerów wiążących, czyli białek ofiar (prey proteins), zostanie poddany transformacji i dojdzie do interakcji, uwalniany jest czynnik transkrypcyjny, który aktywuje gen reporterowy, taki jak Beta-galaktozydaza. Gen reporterowy spowoduje, że kolonie wykazujące interakcję zabarwią się na niebiesko na płytkach zawierających X-gal — substrat dla beta-galaktozydazy.

W drożdżach można wprowadzić wiele delecji za pomocą techniki wykorzystującej cykle rozmnażania płciowego. Komórki haploidalne zawierające reporter i locus z delecją są łączone w jedną komórkę poprzez losowy rozkład lub rekombinację mejotyczną. Markerów selekcyjnych używa się do wyselekcjonowania drożdży, które pomyślnie włączyły delecje. W tym przypadku do selekcji komórek wykazujących ekspresję GFP wykorzystuje się cytometrię przepływową.

Drożdże można transformować białkami znakowanymi fluorescencyjnie, aby zaobserwować wpływ mutacji na oddziaływania białko-białko. W niniejszym artykule wideo wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną do zbadania wpływu różnych mutacji na oddziaływania białko-białko niezbędne dla endocytozy.

Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE na temat transformacji drożdży. Powinni Państwo teraz rozumieć podstawowe aspekty budowy plazmidu, sposób przygotowania komórek drożdży do transformacji oraz sposób przeprowadzenia procedury transformacji. Jak zawsze, dziękujemy za uwagę!