Transformacja i klonowanie drożdży
Drożdże lub Saccharomyces cerevisiae, to szeroko rozpowszechniony prosty eukariotyczny organizm modelowy używany w badaniach genetyki i biologii komórki, który może dać wgląd w ludzkie procesy komórkowe. Ten film omawia transformację - wychwyt obcego DNA przez komórkę drożdży. Przedstawi plazmidy drożdży, sposób przygotowania komórek drożdży do transformacji, procedurę transformacji krok po kroku oraz przedstawi niektóre zastosowania tej podstawowej techniki.
Zanim porozmawiamy o transformacji drożdży, omówmy najpierw rodzaj DNA używanego w transformacji: plazmid. Plazmid to mały, okrągły, dwuniciowy DNA, który może się superzwijać, dzięki czemu może łatwo przechodzić przez pory w błonie komórkowej.
Plazmidy zawierają wiele miejsc klonowania lub MCS, w których endonukleazy restrykcyjne, znane również jako "enzymy restrykcyjne", mogą ciąć DNA. Interesujące nas fragmenty DNA wycięte tymi samymi enzymami mogą być następnie ligowane do MCS. Plazmidy zawierają również początek replikacji lub ORI, który sygnalizuje komórce, gdzie powinna rozpocząć się replikacja. Ponadto plazmidy mają wybieralny marker, który pozwala komórkom drożdży zawierającym plazmid rosnąć w określonych warunkach środowiskowych. Drożdże, które nie wprowadzą plazmidu z pożywką, nie przetrwają w pożywkach zawierających marker do wyboru. Markery selekcyjne mogą kodować geny, które umożliwiają oporność na leki lub geny kodujące enzymy, które umożliwiają szczepowi drożdży syntezę aminokwasów, których w przeciwnym razie nie mogłyby wyprodukować.
Wektory wahadłowe to plazmidy, które mogą replikować się w więcej niż jednym gatunku gospodarza. Na przykład plazmid E. Coli może rosnąć w drożdżach. Plazmidy drożdży mogą być nieintegrujące lub integrujące, co oznacza, że plazmid albo łączy się z genomowym DNA, albo pozostaje niezależny.
Istnieje pięć różnych ogólnych typów plazmidów lub wektorów, które są używane w drożdżach. Dwa, które są najczęściej używane w przemianie drożdży, to plazmid episomalny drożdży lub YEp i plazmid centrometyczny drożdży lub YCp . Oba te typy wektorów zawierają autonomiczną sekwencję replikacji lub ARS. ARS zawiera początek replikacji i pozwala na replikację pozachromosomalną u drożdży.
Istnieje kilka różnych procedur, które można zastosować do transformacji drożdży, w tym metoda sferoplastyczna, elektroporacja i przemiana za pośrednictwem octanu litu. W tym filmie skupimy się na procedurze octanu litu.
W tej metodzie przemiany dodatnio naładowane kationy litu neutralizują ładunki na błonie komórkowej i plazmidowym DNA Jednoniciowy DNA - dodany do mieszaniny transformacyjnej - wiąże się ze ścianą komórkową drożdży i pozostawia plazmidowe DNA dostępne do pobrania przez komórki drożdży. Narażenie na nagły wzrost temperatury lub szok cieplny powoduje różnicę ciśnień między wnętrzem a zewnętrzem komórki, tworząc pory, przez które może przejść plazmidowe DNA. Gdy temperatura spadnie, ściana komórkowa drożdży zreformuje się, a transformacja zostanie zakończona.
Zacznijmy od procedury krok po kroku, jak przygotować drożdże do transformacji. Komórki drożdży należy przygotować, najpierw wybierając kolonię z płytki agarowej i amplifikując kolonię w pożywce z dekstrozy peptonu z ekstraktem drożdżowym, w skrócie YPD - kompletnej pożywce do wzrostu drożdży.
Po pobraniu kolonii z płytki i umieszczeniu w pożywce YPD, kultura jest inkubowana przez noc w temperaturze 30 °C z mieszaniem na wytrząsarce lub aparacie rolkowym, jak widać tutaj. Komórki drożdży są granulowane przez odwirowanie, a nadnik jest usuwany. Granulowane komórki są ponownie zawieszane z żądanym buforem lub sterylną wodą. Te kompetentnie przygotowane komórki drożdży zostaną wykorzystane w procedurze transformacji.
Po przygotowaniu komórek drożdży transformację można przeprowadzić, przygotowując najpierw mieszaninę transformacyjną.
Ta mieszanina odczynników powinna zawierać: sterylną wodę destylowaną; roztwór 50% glikolu polietylenowego lub PEG, 1M octanu litu, 10 mg/ml roztworu jednoniciowego DNA, plazmidowego DNA i kompetentnych komórek drożdży. Dokładne proporcje każdego roztworu należy obliczyć przed rozpoczęciem eksperymentu, zapoznając się ze standardowym protokołem transformacji drożdży w laboratorium.
Mieszaninę inkubuje się następnie w temperaturze 30 °C przez 30 minut z wytrząsaniem. Roztwór należy mieszać, a nie wirować, aby komórki drożdży się nie rozpadły.
Komórki są poddawane szokowi cieplnemu poprzez umieszczenie w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 15 minut, a następnie chłodzenie na lodzie przez 2 minuty. Komórki są następnie zbierane przez odwirowanie.
Komórki są ponownie zawieszane w podwójnie destylowanej wodzie i są powlekane na płytkach agarowych, które wybiorą pożądane transformanty. Płytki transformacyjne są następnie inkubowane w temperaturze 30 °C przez dwa do czterech dni, aż do powstania kolonii.
Procedury transformacji powinny zawsze obejmować płytki kontroli dodatniej i ujemnej, dopóki nie zostaną zoptymalizowane. Kontrolą pozytywną powinna być zawiesina komórek drożdży z plazmidowym DNA na płytce YPD, która nie zawiera żadnego markera wybieralnego. Pokazuje to, że komórki są zdrowe po procedurze transformacji. Płytka kontroli ujemnej powinna być zawiesiną komórek drożdży na odpowiedniej płytce selekcyjnej, takiej jak płytka zawierająca antybiotyki. Na płytce nie powinno być żadnych kolonii i widać, że nie ma zanieczyszczeń.
Istnieje niezliczona ilość różnych zastosowań do transformacji drożdży. Jednym z zastosowań transformowanych drożdży jest użycie systemu hybrydowego drożdży i dwóch do identyfikacji białek, które wchodzą w interakcję z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania lub białkiem przynęty. Kiedy plazmid z biblioteki kandydatów na partnerów wiążących lub białka ofiary jest przekształcany i dochodzi do interakcji, uwalniany jest czynnik transkrypcyjny, który aktywuje gen reporterowy, taki jak beta-galaktozydaza. Gen reporterowy zmieni kolor kolonii, które mają interakcję, na niebieski, gdy znajdzie się na płytkach zawierających X-gal - substrat dla beta-galadozy.
Wielokrotne delecje można przekształcić w drożdże za pomocą techniki wykorzystującej cykl seksualny. Komórki haploidalne, które zawierają locus reporterowy i usunięty, są łączone w jedną komórkę poprzez losowy asortyment lub rekombinację mejotyczną. Markery do wyboru służą do selekcji drożdży, które pomyślnie włączyły delecje. W tym przypadku cytometria przepływowa służy do selekcji komórek wykazujących ekspresję GFP.
Drożdże mogą być przekształcane za pomocą białek, które są znakowane fluorescencyjnie, aby zobaczyć wpływ mutacji na interakcje białko-białko. W tym artykule wideo wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną do zbadania wpływu różnych mutacji na interakcje białko-białko niezbędne dla endocytozy.
Właśnie obejrzałeś film JoVEs na temat przemiany drożdży. Powinieneś teraz zrozumieć podstawowe aspekty plazmidu, jak przygotować komórki drożdży do transformacji i jak przeprowadzić procedurę transformacji. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
S. cerevisiae to jednokomórkowe eukarionty, które są powszechnie używanym organizmem modelowym w badaniach biologicznych. W trakcie swojej pracy nauko…
Drożdże lub Saccharomyces cerevisiae, to szeroko rozpowszechniony prosty eukariotyczny organizm modelowy używany w badaniach genetyki i biologii komórki, który może dać wgląd w ludzkie procesy komórkowe. Ten film omawia transformację - wychwyt obcego DNA przez komórkę drożdży. Przedstawi plazmidy drożdży, sposób przygotowania komórek drożdży do transformacji, procedurę transformacji krok po kroku oraz przedstawi niektóre zastosowania tej podstawowej techniki.
Zanim porozmawiamy o transformacji drożdży, omówmy najpierw rodzaj DNA używanego w transformacji: plazmid. Plazmid to mały, okrągły, dwuniciowy DNA, który może się superzwijać, dzięki czemu może łatwo przechodzić przez pory w błonie komórkowej.
Plazmidy zawierają wiele miejsc klonowania lub MCS, w których endonukleazy restrykcyjne, znane również jako "enzymy restrykcyjne", mogą ciąć DNA. Interesujące nas fragmenty DNA wycięte tymi samymi enzymami mogą być następnie ligowane do MCS. Plazmidy zawierają również początek replikacji lub ORI, który sygnalizuje komórce, gdzie powinna rozpocząć się replikacja. Ponadto plazmidy mają wybieralny marker, który pozwala komórkom drożdży zawierającym plazmid rosnąć w określonych warunkach środowiskowych. Drożdże, które nie wprowadzą plazmidu z pożywką, nie przetrwają w pożywkach zawierających marker do wyboru. Markery selekcyjne mogą kodować geny, które umożliwiają oporność na leki lub geny kodujące enzymy, które umożliwiają szczepowi drożdży syntezę aminokwasów, których w przeciwnym razie nie mogłyby wyprodukować.
Wektory wahadłowe to plazmidy, które mogą replikować się w więcej niż jednym gatunku gospodarza. Na przykład plazmid E. Coli może rosnąć w drożdżach. Plazmidy drożdży mogą być nieintegrujące lub integrujące, co oznacza, że plazmid albo łączy się z genomowym DNA, albo pozostaje niezależny.
Istnieje pięć różnych ogólnych typów plazmidów lub wektorów, które są używane w drożdżach. Dwa, które są najczęściej używane w przemianie drożdży, to plazmid episomalny drożdży lub YEp i plazmid centrometyczny drożdży lub YCp . Oba te typy wektorów zawierają autonomiczną sekwencję replikacji lub ARS. ARS zawiera początek replikacji i pozwala na replikację pozachromosomalną u drożdży.
Istnieje kilka różnych procedur, które można zastosować do transformacji drożdży, w tym metoda sferoplastyczna, elektroporacja i przemiana za pośrednictwem octanu litu. W tym filmie skupimy się na procedurze octanu litu.
W tej metodzie przemiany dodatnio naładowane kationy litu neutralizują ładunki na błonie komórkowej i plazmidowym DNA Jednoniciowy DNA - dodany do mieszaniny transformacyjnej - wiąże się ze ścianą komórkową drożdży i pozostawia plazmidowe DNA dostępne do pobrania przez komórki drożdży. Narażenie na nagły wzrost temperatury lub szok cieplny powoduje różnicę ciśnień między wnętrzem a zewnętrzem komórki, tworząc pory, przez które może przejść plazmidowe DNA. Gdy temperatura spadnie, ściana komórkowa drożdży zreformuje się, a transformacja zostanie zakończona.
Zacznijmy od procedury krok po kroku, jak przygotować drożdże do transformacji. Komórki drożdży należy przygotować, najpierw wybierając kolonię z płytki agarowej i amplifikując kolonię w pożywce z dekstrozy peptonu z ekstraktem drożdżowym, w skrócie YPD - kompletnej pożywce do wzrostu drożdży.
Po pobraniu kolonii z płytki i umieszczeniu w pożywce YPD, kultura jest inkubowana przez noc w temperaturze 30 °C z mieszaniem na wytrząsarce lub aparacie rolkowym, jak widać tutaj. Komórki drożdży są granulowane przez odwirowanie, a nadnik jest usuwany. Granulowane komórki są ponownie zawieszane z żądanym buforem lub sterylną wodą. Te kompetentnie przygotowane komórki drożdży zostaną wykorzystane w procedurze transformacji.
Po przygotowaniu komórek drożdży transformację można przeprowadzić, przygotowując najpierw mieszaninę transformacyjną.
Ta mieszanina odczynników powinna zawierać: sterylną wodę destylowaną; roztwór 50% glikolu polietylenowego lub PEG, 1M octanu litu, 10 mg/ml roztworu jednoniciowego DNA, plazmidowego DNA i kompetentnych komórek drożdży. Dokładne proporcje każdego roztworu należy obliczyć przed rozpoczęciem eksperymentu, zapoznając się ze standardowym protokołem transformacji drożdży w laboratorium.
Mieszaninę inkubuje się następnie w temperaturze 30 °C przez 30 minut z wytrząsaniem. Roztwór należy mieszać, a nie wirować, aby komórki drożdży się nie rozpadły.
Komórki są poddawane szokowi cieplnemu poprzez umieszczenie w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 15 minut, a następnie chłodzenie na lodzie przez 2 minuty. Komórki są następnie zbierane przez odwirowanie.
Komórki są ponownie zawieszane w podwójnie destylowanej wodzie i są powlekane na płytkach agarowych, które wybiorą pożądane transformanty. Płytki transformacyjne są następnie inkubowane w temperaturze 30 °C przez dwa do czterech dni, aż do powstania kolonii.
Procedury transformacji powinny zawsze obejmować płytki kontroli dodatniej i ujemnej, dopóki nie zostaną zoptymalizowane. Kontrolą pozytywną powinna być zawiesina komórek drożdży z plazmidowym DNA na płytce YPD, która nie zawiera żadnego markera wybieralnego. Pokazuje to, że komórki są zdrowe po procedurze transformacji. Płytka kontroli ujemnej powinna być zawiesiną komórek drożdży na odpowiedniej płytce selekcyjnej, takiej jak płytka zawierająca antybiotyki. Na płytce nie powinno być żadnych kolonii i widać, że nie ma zanieczyszczeń.
Istnieje niezliczona ilość różnych zastosowań do transformacji drożdży. Jednym z zastosowań transformowanych drożdży jest użycie systemu hybrydowego drożdży i dwóch do identyfikacji białek, które wchodzą w interakcję z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania lub białkiem przynęty. Kiedy plazmid z biblioteki kandydatów na partnerów wiążących lub białka ofiary jest przekształcany i dochodzi do interakcji, uwalniany jest czynnik transkrypcyjny, który aktywuje gen reporterowy, taki jak beta-galaktozydaza. Gen reporterowy zmieni kolor kolonii, które mają interakcję, na niebieski, gdy znajdzie się na płytkach zawierających X-gal - substrat dla beta-galadozy.
Wielokrotne delecje można przekształcić w drożdże za pomocą techniki wykorzystującej cykl seksualny. Komórki haploidalne, które zawierają locus reporterowy i usunięty, są łączone w jedną komórkę poprzez losowy asortyment lub rekombinację mejotyczną. Markery do wyboru służą do selekcji drożdży, które pomyślnie włączyły delecje. W tym przypadku cytometria przepływowa służy do selekcji komórek wykazujących ekspresję GFP.
Drożdże mogą być przekształcane za pomocą białek, które są znakowane fluorescencyjnie, aby zobaczyć wpływ mutacji na interakcje białko-białko. W tym artykule wideo wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną do zbadania wpływu różnych mutacji na interakcje białko-białko niezbędne dla endocytozy.
Właśnie obejrzałeś film JoVEs na temat przemiany drożdży. Powinieneś teraz zrozumieć podstawowe aspekty plazmidu, jak przygotować komórki drożdży do transformacji i jak przeprowadzić procedurę transformacji. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Drożdże lub Saccharomyces cerevisiae, to szeroko rozpowszechniony prosty eukariotyczny organizm modelowy używany w badaniach genetyki i biologii komórki, który może dać wgląd w ludzkie procesy komórkowe. Ten film omawia transformację - wychwyt obcego DNA przez komórkę drożdży. Przedstawi plazmidy drożdży, sposób przygotowania komórek drożdży do transformacji, procedurę transformacji krok po kroku oraz przedstawi niektóre zastosowania tej podstawowej techniki.
Zanim porozmawiamy o transformacji drożdży, omówmy najpierw rodzaj DNA używanego w transformacji: plazmid. Plazmid to mały, okrągły, dwuniciowy DNA, który może się superzwijać, dzięki czemu może łatwo przechodzić przez pory w błonie komórkowej.
Plazmidy zawierają wiele miejsc klonowania lub MCS, w których endonukleazy restrykcyjne, znane również jako "enzymy restrykcyjne", mogą ciąć DNA. Interesujące nas fragmenty DNA wycięte tymi samymi enzymami mogą być następnie ligowane do MCS. Plazmidy zawierają również początek replikacji lub ORI, który sygnalizuje komórce, gdzie powinna rozpocząć się replikacja. Ponadto plazmidy mają wybieralny marker, który pozwala komórkom drożdży zawierającym plazmid rosnąć w określonych warunkach środowiskowych. Drożdże, które nie wprowadzą plazmidu z pożywką, nie przetrwają w pożywkach zawierających marker do wyboru. Markery selekcyjne mogą kodować geny, które umożliwiają oporność na leki lub geny kodujące enzymy, które umożliwiają szczepowi drożdży syntezę aminokwasów, których w przeciwnym razie nie mogłyby wyprodukować.
Wektory wahadłowe to plazmidy, które mogą replikować się w więcej niż jednym gatunku gospodarza. Na przykład plazmid E. Coli może rosnąć w drożdżach. Plazmidy drożdży mogą być nieintegrujące lub integrujące, co oznacza, że plazmid albo łączy się z genomowym DNA, albo pozostaje niezależny.
Istnieje pięć różnych ogólnych typów plazmidów lub wektorów, które są używane w drożdżach. Dwa, które są najczęściej używane w przemianie drożdży, to plazmid episomalny drożdży lub YEp i plazmid centrometyczny drożdży lub YCp . Oba te typy wektorów zawierają autonomiczną sekwencję replikacji lub ARS. ARS zawiera początek replikacji i pozwala na replikację pozachromosomalną u drożdży.
Istnieje kilka różnych procedur, które można zastosować do transformacji drożdży, w tym metoda sferoplastyczna, elektroporacja i przemiana za pośrednictwem octanu litu. W tym filmie skupimy się na procedurze octanu litu.
W tej metodzie przemiany dodatnio naładowane kationy litu neutralizują ładunki na błonie komórkowej i plazmidowym DNA Jednoniciowy DNA - dodany do mieszaniny transformacyjnej - wiąże się ze ścianą komórkową drożdży i pozostawia plazmidowe DNA dostępne do pobrania przez komórki drożdży. Narażenie na nagły wzrost temperatury lub szok cieplny powoduje różnicę ciśnień między wnętrzem a zewnętrzem komórki, tworząc pory, przez które może przejść plazmidowe DNA. Gdy temperatura spadnie, ściana komórkowa drożdży zreformuje się, a transformacja zostanie zakończona.
Zacznijmy od procedury krok po kroku, jak przygotować drożdże do transformacji. Komórki drożdży należy przygotować, najpierw wybierając kolonię z płytki agarowej i amplifikując kolonię w pożywce z dekstrozy peptonu z ekstraktem drożdżowym, w skrócie YPD - kompletnej pożywce do wzrostu drożdży.
Po pobraniu kolonii z płytki i umieszczeniu w pożywce YPD, kultura jest inkubowana przez noc w temperaturze 30 °C z mieszaniem na wytrząsarce lub aparacie rolkowym, jak widać tutaj. Komórki drożdży są granulowane przez odwirowanie, a nadnik jest usuwany. Granulowane komórki są ponownie zawieszane z żądanym buforem lub sterylną wodą. Te kompetentnie przygotowane komórki drożdży zostaną wykorzystane w procedurze transformacji.
Po przygotowaniu komórek drożdży transformację można przeprowadzić, przygotowując najpierw mieszaninę transformacyjną.
Ta mieszanina odczynników powinna zawierać: sterylną wodę destylowaną; roztwór 50% glikolu polietylenowego lub PEG, 1M octanu litu, 10 mg/ml roztworu jednoniciowego DNA, plazmidowego DNA i kompetentnych komórek drożdży. Dokładne proporcje każdego roztworu należy obliczyć przed rozpoczęciem eksperymentu, zapoznając się ze standardowym protokołem transformacji drożdży w laboratorium.
Mieszaninę inkubuje się następnie w temperaturze 30 °C przez 30 minut z wytrząsaniem. Roztwór należy mieszać, a nie wirować, aby komórki drożdży się nie rozpadły.
Komórki są poddawane szokowi cieplnemu poprzez umieszczenie w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 15 minut, a następnie chłodzenie na lodzie przez 2 minuty. Komórki są następnie zbierane przez odwirowanie.
Komórki są ponownie zawieszane w podwójnie destylowanej wodzie i są powlekane na płytkach agarowych, które wybiorą pożądane transformanty. Płytki transformacyjne są następnie inkubowane w temperaturze 30 °C przez dwa do czterech dni, aż do powstania kolonii.
Procedury transformacji powinny zawsze obejmować płytki kontroli dodatniej i ujemnej, dopóki nie zostaną zoptymalizowane. Kontrolą pozytywną powinna być zawiesina komórek drożdży z plazmidowym DNA na płytce YPD, która nie zawiera żadnego markera wybieralnego. Pokazuje to, że komórki są zdrowe po procedurze transformacji. Płytka kontroli ujemnej powinna być zawiesiną komórek drożdży na odpowiedniej płytce selekcyjnej, takiej jak płytka zawierająca antybiotyki. Na płytce nie powinno być żadnych kolonii i widać, że nie ma zanieczyszczeń.
Istnieje niezliczona ilość różnych zastosowań do transformacji drożdży. Jednym z zastosowań transformowanych drożdży jest użycie systemu hybrydowego drożdży i dwóch do identyfikacji białek, które wchodzą w interakcję z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania lub białkiem przynęty. Kiedy plazmid z biblioteki kandydatów na partnerów wiążących lub białka ofiary jest przekształcany i dochodzi do interakcji, uwalniany jest czynnik transkrypcyjny, który aktywuje gen reporterowy, taki jak beta-galaktozydaza. Gen reporterowy zmieni kolor kolonii, które mają interakcję, na niebieski, gdy znajdzie się na płytkach zawierających X-gal - substrat dla beta-galadozy.
Wielokrotne delecje można przekształcić w drożdże za pomocą techniki wykorzystującej cykl seksualny. Komórki haploidalne, które zawierają locus reporterowy i usunięty, są łączone w jedną komórkę poprzez losowy asortyment lub rekombinację mejotyczną. Markery do wyboru służą do selekcji drożdży, które pomyślnie włączyły delecje. W tym przypadku cytometria przepływowa służy do selekcji komórek wykazujących ekspresję GFP.
Drożdże mogą być przekształcane za pomocą białek, które są znakowane fluorescencyjnie, aby zobaczyć wpływ mutacji na interakcje białko-białko. W tym artykule wideo wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną do zbadania wpływu różnych mutacji na interakcje białko-białko niezbędne dla endocytozy.
Właśnie obejrzałeś film JoVEs na temat przemiany drożdży. Powinieneś teraz zrozumieć podstawowe aspekty plazmidu, jak przygotować komórki drożdży do transformacji i jak przeprowadzić procedurę transformacji. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and what are its key components?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that can supercoil to pass through cell membrane pores. Key components include a multiple cloning site (MCS) where restriction enzymes cut DNA, an origin of replication (ORI) that signals where replication begins, and a selectable marker allowing transformed cells to survive under specific environmental conditions.
Q2: How do yeast cells prepare for transformation?
Yeast cells are prepared by picking a colony from an agar plate and amplifying it in YPD medium overnight at 30°C with agitation. Cells are then pelleted by centrifugation, the supernatant is removed, and pelleted cells are resuspended in buffer or sterile water to create competent cells ready for the transformation procedure. Growth and maintenance of saccharomyces cerevisiae requires careful culture conditions.
Q3: What happens during the lithium acetate transformation method?
Positively-charged lithium cations neutralize charges on the cell membrane and plasmid DNA. Single-stranded DNA binds to the cell wall, leaving plasmid DNA available for uptake. Heat shock at 42°C creates pores allowing DNA entry. When temperature decreases, the cell wall reforms, completing transformation.
Q4: What is the difference between YEp and YCp plasmid vectors?
YEp (yeast episomal plasmid) and YCp (yeast centromeric plasmid) are the most commonly used vectors in yeast transformation. Both contain an autonomous replication sequence (ARS) that enables extrachromosomal replication in yeast. YEp plasmids are non-integrating and replicate as independent elements, while YCp plasmids associate with yeast centromeres.
Q5: Why are positive and negative controls important in yeast transformation?
Positive controls use plasmid DNA on YPD plates without selectable markers to confirm cells remain healthy after transformation. Negative controls use selection plates with no plasmid to verify absence of contamination. These controls validate that the transformation procedure works correctly and results are reliable.
Q6: How does the yeast-two hybrid system identify protein interactions?
Transformed yeast containing prey protein plasmids from a library are screened for interactions with a bait protein. When interaction occurs, a transcription factor activates a reporter gene like beta-galactosidase. Colonies with interactions turn blue on plates containing X-gal substrate, allowing researchers to identify binding partners.
Q7: What are practical applications of yeast transformation in research?
Yeast transformation enables control of gene expression, induction of genetic deletions, expression of recombinant proteins, and labeling of subcellular structures. Researchers use fluorescently-labeled proteins to study mutation effects on protein-protein interactions. Flow cytometry selects cells expressing GFP, and fluorescent microscopy visualizes cellular processes essential for understanding human biology.
Rozdziały w tym filmie
0:00
Overview
0:41
Important Aspects of Yeast Transformation
2:42
Principles Behind Yeast Transformation
3:38
Lithium Acetate Transformation Procedure
6:31
Applications
8:04
Summary