Name: Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Poznaj metodę produkcji i oczyszczania niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2 (CAV2) do zastosowań w terapii genowej i szczepieniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana finansowo przez granty z INSERM, CNRS, Fondation pour la Recherche Médicale i Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) dla D.G-D; Siódmy program ramowy Komisji Europejskiej do B.K.; Stypendystka uzyskała stypendium podoktorskie w ramach programu "Equipe FRM 2009"); Firma C.B. otrzymała stypendium podoktorskie z UE, w ramach umowy o grant nr 245266 (Orbivac).

1. Budowa niereplikacyjnego plazmidu genomu CAV2
Uwaga: wszystkie plazmidy opisane w tym protokole zostały opisane wcześniej7 i są dostępne na żądanie.
<ol>
	<li>Sklonuj GOI do plazmidu pShuttle, używając odpowiednich enzymów restrykcyjnych, aby wygenerować pShuttle-GOI (Figura 1A).</li>
	<li>Trawić 2 μg pShuttle-GOI przez AscI/PacI. Trawienie uwalnia fragment Shuttle-GOI (~2,9 kbp + sekwencja GOI ORF) ze szkieletu plazmidu (2,8 kbp).</li>
	<li>Oczyść fragment Shuttle-GOI po elektroforezie w żelu agarozowym, używając żelu NucleoSpin i zestawu do czyszczenia PCR.</li>
	<li>Równolegle trawić 1 μg plazmidu genomowego pCAV2 przez SwaI. Plazmid pCAV2 zawiera unikalne miejsce SwaI zlokalizowane w regionie E1 (Figura 1B). Inaktywuj termicznie ten enzym restrykcyjny w temperaturze 65 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Przekształć kompetentne bakterie E. coli BJ5183 za pomocą 500 ng oczyszczonego fragmentu Shuttle-GOI i 100 ng zlinearyzowanego plazmidu pCAV2 w celu rekombinacji homologicznej (Figure 1B). Rozprowadzić na płytkach LB-Amp. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 godzin.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę PCR bezpośrednio na koloniach bakteryjnych przy użyciu głównej mieszanki EmeraldAmp ze starterami do przodu (5'-CACGAGGCCCTCTCGTCTTCAA-3') i wstecznie (5'-GCGGTAGTTTATCAGTTAAATTGC-3') w następujących warunkach cyklicznych: 10 min w temperaturze 95 °C (dla jednego cyklu), 95 °C dla 1 min; 58 °C dla 1 min; 72 °C dla 1 min/kbp (dla 39 cykli), i wreszcie 5 min w temperaturze 72 °C. Produkt o wartości 1 kbp + sekwencja GOI ORF jest amplifikowany z klonów pCAV-GOI dodatnich, podczas gdy żaden produkt PCR nie może być wykryty z klonami ujemnymi.</li>
	<li>Zaszczepić co najmniej dwie dodatnie kolonie przez noc, każda w 5 ml pożywki LB-amp w temperaturze 37 °C w wytrząsarce (220 obr./min).</li>
	<li>Ekstrakcja plazmidowego DNA za pomocą zestawu plazmidów nukleospinowych. Przekształć kompetentne bakterie E. coli DH5α za pomocą podwielokrotności każdego preparatu DNA. Rozprowadzić zawiesinę bakteryjną na płytkach LB-Amp i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zaszczepić dwie kolonie każdego dodatniego klonu przez noc w 3 ml pożywki LB-amp w temperaturze 37 °C w wytrząsarce (220 obr./min). Ekstrakcja plazmidowego DNA za pomocą zestawu plazmidów nukleospinowych.</li>
	<li>Strawić powstałe DNA i macierzysty plazmid pCAV2 (jako kontrolę) za pomocą NdeI. Wzorzec ograniczeń rodzicielskiego pCAV2 wynosi 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp i 1,6 kbp. Kaseta z wyrażeniami rządu Indii jest umieszczana we fragmencie o rozmiarze 7,9 kbp i zawiera co najmniej jedno miejsce NdeI, tj. jedno miejsce w kasecie oraz potencjalne miejsca obecne w IWP.</li>
	<li>Wybierz pozytywne konstrukcje i przejdź do kroku 2 z co najmniej 2 niezależnymi klonami.</li>
</ol>
2. Transfekcja rekombinowanego plazmidu genomu CAV2 do komórek DK-E1
Uwaga: Wektory niereplikacyjne pochodzące z CAV2 to organizmy modyfikowane genetycznie sklasyfikowane jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), podczas gdy ich stosowanie na modelach zwierzęcych jest klasyfikowane jako BSL-1. Należy stosować odpowiednie środki ograniczające rozprzestrzenianie się odpadów i utylizację odpadów, w tym środki ochrony osobistej, oraz pracować pod okapami z przepływem laminarnym BSL-2.
<ol>
	<li>Dzień przed transfekcją wysiewaj komórki DK-E1 na płytce 6-dołkowej. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, zawierającej 7% inaktywowanej termicznie surowicy cielęcej płodu (FCS), 1 mM pirogronianu sodu i 100 U/ml penicyliny/100 μg/ml streptomycyny. Komórki powinny być w 70-80% zlewające się do transfekcji.</li>
	<li>Trawić 2 μg plazmidu pCAV-GOI za pomocą AscI, aby uwolnić niewirusową sekwencję plazmidu. Sprawdź wynikowy wzór oporu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%. Trawienie powinno dać fragment o wielkości ~31 kpz zawierający rekombinowany genom i fragment o wielkości 2 kpz odpowiadający szkieletowi plazmidu.</li>
	<li>Wymieszaj strawione DNA z 200 μl buforu Jet Prime, wirując przez 10 sekund. Dodać 4 μl Jet Prime i mieszać przez wirowanie przez 10 sekund. Krótko wirować, aby usunąć kropelki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj mieszankę transfekcyjną kroplami na komórki. Delikatnie wstrząsnąć płytkami, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Propagacja rekombinowanego CAV2
<ol>
	<li>Tydzień po transfekcji zebrać komórki i pożywkę hodowlaną w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml. Rozbić komórki w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania (-80 °C/37 °C) i oczyścić lizat przez wirowanie przez 10 minut przy 1 800 x g.</li>
	<li>Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszego namnażania wirusa.</li>
	<li>Zainfekuj 80-90% zlewającą się monowarstwę komórek DK-E1 wyhodowanych w jednym dołku na płytce 6-dołkowej 0,5 ml supernatantu zawierającego wirusa. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, przy łagodnym mieszaniu. Usunąć inokulum i zastąpić je 1,5 ml kompletnego DMEM zawierającego 5% inaktywowanego termicznie FCS.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3-4 dni. Komórki powinny być codziennie monitorowane pod kątem pojawienia się efektu cytopatycznego (CPE, ryc. 2A-B). Jeśli nie widać wyraźnego CPE, należy pobrać komórki po 4 dniach hodowli i powtórzyć kroki 3.1-3.4.</li>
	<li>Gdy wyraźny CPE zaatakuje większość komórek, zwykle po 2-4 rundach amplifikacji wirusa, należy zebrać komórki za pomocą pożywki hodowlanej i zamrozić i rozmrozić 3x, jak opisano powyżej. Zainfekować 80-90% zlewających się komórek DK-E1 wyhodowanych w trzech szalkach do hodowli tkankowych o średnicy 10 cm, używając za każdym razem 0,5 ml supernatantu zawierającego wirusa.</li>
	<li>Po 3-4 dniach (gdy CPE jest kompletny) należy pobrać komórki z tych 10-centymetrowych szalek, ponownie rozbić je w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania, oczyścić lizat przez odwirowanie przez 10 minut przy 1,800 x g, zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu amplifikacji CAV2 na dużą skalę.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie CAV2 na dużą skalę
<ol>
	<li>Zainfekuj 80-90% zlewających się monowarstw komórek DK-E1 wyhodowanych w czterdziestu szalkach do hodowli tkankowych o średnicy 10 cm. Do każdej potrawy należy użyć 0,1 ml supernatantu zawierającego wirusa, rozcieńczonego w 1 ml kompletnego DMEM bez FCS. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny przy łagodnym mieszaniu. Dodać 5 ml kompletnego DMEM uzupełnionego 5% FCS.</li>
	<li>Inkubować przez 3 dni. Zbierz zainfekowane komórki z czterdziestu 10-centymetrowych naczyń w probówkach polipropylenowych o pojemności 50 ml. Komórki osadu w temperaturze 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 15 ml pożywki DMEM.</li>
	<li>Rozbij komórki w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania (-80 °C/37 °C). Usunąć resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 1 800 x g przez 10 minut i przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C przed oczyszczeniem z cząstek wirusa.</li>
	<li>Przygotuj nieciągły gradient CsCl w 14 ml probówce Ultra-Clear. Najpierw wlać 2 ml roztworu CsCl (1,40 g/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem) na dno probówki. Następnie powoli dodawać 2 ml roztworu CsCl (1,25 g/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem) na wierzch pierwszego roztworu.</li>
	<li>Ostrożnie załadować supernatant wirusa na wierzch gradientu CsCl. Napełnij rurkę olejem mineralnym do 2-3 mm od góry. Wirować przez 1,5 godziny przy 130 000 x g i temperaturze 18 °C w wahadłowym wirniku SW40.</li>
	<li>Po odwirowaniu wyraźnie widoczne są dwa białe paski na granicy faz między 2 warstwami roztworu CsCl (rysunek 2C). Za pomocą igły 21 G i strzykawki pobrać boczne nakłucie dolnego pasma zawierającego dojrzałe cząstki CAV2. Staraj się w miarę możliwości unikać gromadzenia się górnego pasma, które odpowiada pustym cząsteczkom wirusa.</li>
	<li>Przygotować ciągły gradient CsCl w przezroczystej probówce o pojemności 14 ml, mieszając zebrane cząstki wirusa z roztworem CsCl (1,34 g/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami). Napełnij rurkę olejem mineralnym do 2-3 mm od góry. Wirować przez 18 godzin przy 130 000 x g i temperaturze 18 °C w obracającym się wirniku SW40.</li>
	<li>Po odwirowaniu zebrać białą opaskę zawierającą CAV2 przez boczne nakłucie strzykawką, jak opisano powyżej. Ponownie staraj się unikać zbierania pozostałego górnego pasma. Powinno to być łatwiejsze w tym ciągłym gradiencie, który lepiej oddziela te dwa pasma. Całkowita objętość pobranej zawiesiny nie powinna przekraczać 2 ml.</li>
	<li>Zrównoważyć kolumnę Sephadex G-25 PD-10 z 30 ml PBS.</li>
	<li>Załadować zawiesinę wirusa i wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Eluować frakcjami 500 μl PBS. Zbierz frakcje 5-7, które zwykle zawierają odsolone cząstki CAV2. Frakcje zawierające wirusa można łatwo zidentyfikować, ponieważ są opalizujące. Dodać 150 μl glicerolu do 1,5 ml zawiesiny CAV2 i przechowywać w porcjach w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Miareczkowanie CAV2 przez rozcieńczenie punktu końcowego
<ol>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność oczyszczonego wirusa na lodzie i wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia (w zakresie od 10-2-10-12) w DMEM bez surowicy.</li>
	<li>Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia wirusa do 5 dołków na 96-dołkowej płytce. Dodaj 1,5 x 104 komórki DK-E1 do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 dni.</li>
	<li>W 5 dniu po zakażeniu należy monitorować wygląd CPE za pomocą obserwacji mikroskopowej (ryc. 2A-B). Miana zakaźne określa się jako medianę dawek zakaźnych w hodowli tkankowej (TCID50), przy użyciu metody statystycznej Reeda i Muencha13.</li>
</ol>

<ol><li>Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+chimeras+for+gene+therapy%2C+vaccination%2C+and+oncolysis%3A+adenoviruses+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond.</a> Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).</li>
<li>Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).</li>
<li>Zak, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merck+Ad5%2FHIV+induces+broad+innate+immune+activation+that+predicts+CD8%28%2B%29+T-cell+responses+but+is+attenuated+by+preexisting+Ad5+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).</li>
<li>Paillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+non-human+adenoviruses+versus+human+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses.</a> Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).</li>
<li>Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+dissemination+in+the+mouse+nervous+system%2C+using+a+green+fluorescent+protein-expressing+Borna+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector.</a> J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).</li>
<li>Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+canine+adenovirus+type+2+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An update on canine adenovirus type 2 and its vectors.</a> Viruses. 2, 2134-2153 (2010).</li>
<li>Bouet-Cararo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenoviruses+elicit+both+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+against+rabies+following+immunisation+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep.</a> Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).</li>
<li>Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+transduction+of+neurons+throughout+the+rat+CNS+using+novel+helper-dependent+CAV-2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors.</a> FASEB J. 18, 391-393 (2004).</li>
<li>Deinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52, 293-305 (2006).</li>
<li>Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+neurons+by+canine+adenovirus+vectors+and+their+efficient+retrograde+transport+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo.</a> FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).</li>
<li>Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotropism+and+retrograde+axonal+transport+of+a+canine+adenoviral+vector%3A+a+tool+for+targeting+key+structures+undergoing+neurodegenerative+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes.</a> Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).</li>
<li>Chartier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli.</a> J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatography+purification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatography purification of canine adenoviral vectors.</a> Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).</li>
<li>Segura, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantification+of+canine+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors.</a> Journal of virological. 163, 129-136 (2010).</li>
<li>Fernandes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+development+for+canine+adenovirus+type+2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors.</a> Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).</li>
<li>Huang, B., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+silencing+of+huntingtin+expression+by+shRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA.</a> Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).</li>
<li>Tordo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+adenovirus+based+rabies+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Canine adenovirus based rabies vaccines.</a> Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj prosta metoda, zaadaptowana z dobrze udokumentowanej technologii Ad5, pozwala na wydajną produkcję niereplikacyjnych wektorów CAV2 o typowej zdolności klonowania ~4,2 kbp. Jeśli chodzi o względy czasowe, rekombinowany genom CAV2 jest zwykle generowany w ciągu dwóch tygodni, podczas gdy amplifikacja, oczyszczenie i mianowanie zawiesin wirusa zajmie dodatkowe 5 tygodni.
Chociaż produkcja pierwszej partii wektorów pochodzących z CAV2 może wydawać się czasochłonna, należy przypomnieć...

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, wektory pochodzące z adenowirusów (reklam) udowodniły swoją skuteczność w terapii genowej i szczepieniach, a także w wirusoterapii onkolitycznej 1. Ads to bezotoczkowe wirusy dwudziestościenne z rodziny Adenoviridae, które zostały wyizolowane ze ssaków, ptaków,, i ryb. Od czasu ich odkrycia w 1953 roku, ADS były intensywnie badane jako modele do badania interakcji wirus/komórka, a ostatnio jako systemy dostarczania genów oparte na wektorach 2. Rzeczywiście, wektory oparte na reklamach oferują wiele zalet, takich jak szeroki zakres gospodarzy i dobrze scharakteryzowana biologia, a także łatwość, z jaką można je genetycznie manipulować i amplifikować do produkcji na dużą skalę.
Aby przezwyciężyć kliniczne trudności związane z istniejącymi wcześniej odpornościami w populacjach ludzkich na wektory pochodzące od ludzkich Ads 3, my i inni zaczęliśmy wyprowadzać wektory z nieludzkich Ads 4. Ponadto wydaje się, że wektory adenowirusowe inne niż ludzkie są lepiej przystosowane do masowych szczepień w medycynie weterynaryjnej niż klasycznie stosowany adenowirus typu 5 (Ad5), ponieważ powinny być bardziej zgodne z wymogami bezpieczeństwa i ochrony podczas oceny ryzyka przez krajowe organy regulacyjne. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych opisaliśmy pierwszy rekombinowany CAV2 jako nieludzką alternatywę dla wektorów pochodzących z Ad5 5. Od tego czasu liczne badania potwierdziły potencjał wektorów CAV2 do terapeutycznego lub antygenowego transferu genów (dla recenzji 6,7). Podobnie jak inne ADS, wektory pochodzące z CAV2 są stabilne i mogą być wytwarzane przy wysokich mianach, co ułatwia ich stosowanie in vivo. Są one również bezpieczne, ponieważ nie mają charakteru integracyjnego, chociaż umożliwiają długotrwałą ekspresję transgenu in vivo (>1 rok) 8. Co ciekawe, wykazano, że lepsze niż ludzkie serotypy ADS, wektory CAV2 są wysoce neurotropowe, z bardzo wydajnym transportem wstecznym w aksonach 9,10. Ta wewnętrzna właściwość przyniosła pomysł wykorzystania rekombinowanych wektorów CAV2 do transdukcji neuronów określonych obszarów mózgu, które są trudno dostępne dla wektorów lentiwirusowych, do tej pory powszechnie stosowanych do transferu genów do ośrodkowego układu nerwowego 11.
Tutaj opisujemy prosty i klasyczny protokół do konstruowania, produkcji i oczyszczania niereplikowalnych wektorów CAV2 pochodzących ze szczepu Manhattan. Rekombinowane genomy CAV2 są konstruowane przez klonowanie pożądanego genu zainteresowania (GOI) w kasecie poniżej wczesnego promotora wirusa cytomegalii (CMV), który zapewnia wszechobecną ekspresję. Wektory CAV2 mają zdolność klonowania na poziomie ~4,2 kbp, co pozwala na ekspresję dużego cDNA. W drugim etapie ta kaseta ekspresyjna jest wprowadzana przez rekombinację homologiczną w miejsce regionu E1 genomu CAV2, co prowadzi do niereplikacyjnego wirusa (dlE1), jak opisano początkowo przez Chartiera i wsp. 12 Wreszcie, cząsteczki wirusa są wytwarzane po transfekcji plazmidu genomowego do linii komórek nerki psów z ekspresją CAV2-E1 (DK-E1) i są seryjnie amplifikowane przed zagęszczeniem i oczyszczeniem zapasów wirusa. Opisana tutaj metoda wykorzystuje dwuetapowe ultrawirowanie w gradientach chlorku cezu (CsCl), co umożliwia wzbogacenie cząstek zakaźnych o wysokie miano końcowe (zwykle ponad 1010 cząstek zakaźnych na ml). Zawiesina wirusa jest następnie odsalana za pomocą chromatografii przez jednorazowe kolumny Sephadex G-25, tak aby była ostatecznie wystarczająco czysta, aby można ją było bezpośrednio zastosować in vivo.

<table><tbody><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>New England Biolabs</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>zestawy do transfekcji Jet Prime</td><td>Polyplus</td><td>114-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Bakterie BJ5183</td><td>Agilent</td><td>200154</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Kolumna odsalająca</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>EmeraldAmp polimeraza</td><td>Takara</td><td>RR320A Zestaw plazmidów</td><td></td></tr><tr><td>nukleospinowych</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740558.250</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Żel i PCR Clean-up</td><td>Probówki Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr>, <tr><td>Ultra Clear</td><td>Beckman</td><td>344060</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Wektory pochodzące z adenowirusa (Ad) były szeroko stosowane do krótko- lub długoterminowego transferu genów, zarówno do terapii genowej, jak i do zastosowań szczepionkowych. Ze względu na częstą wcześniejszą odporność przeciwko klasycznie stosowanemu ludzkiemu adenowirusowi typu 5, adenowirus psów typu 2 (CAV2) został zaproponowany jako alternatywny wektor transferu genów u ludzi. Dobrze scharakteryzowana biologia CAV2, wraz z łatwością manipulacji genetycznej, oferuje duże korzyści, zwłaszcza w zakresie transferu genów do ośrodkowego układu nerwowego lub indukowania szerokiego zakresu ochronnych odpowiedzi immunologicznych, od odporności humoralnej do komórkowej. Obecnie CAV2 stanowi jeden z najbardziej atrakcyjnych adenowirusów innych niż człowiek do stosowania jako wektor szczepionkowy. Protokół ten opisuje prostą metodę konstruowania, wytwarzania i mianowania rekombinowanych wektorów CAV2. Po sklonowaniu kasety ekspresyjnej genu będącego przedmiotem zainteresowania do plazmidu wahadłowego, rekombinowany plazmid genomowy otrzymuje się w drodze rekombinacji homologicznej w szczepie bakteryjnym E. coli BJ5183. Powstały plazmid genomowy jest następnie transfekowany do komórek nerki psów wykazujących ekspresję komplementarnych genów CAV2-E1 (DK-E1). Amplifikacja wirusa umożliwia wytworzenie dużego zapasu wirusa, który jest oczyszczany przez ultrawirowanie przez gradienty chlorku cezu i odsalany przez dializę. Powstała zawiesina wirusowa rutynowo ma miano ponad 1010 zakaźnych cząstek na ml i może być bezpośrednio podawana in vivo.

Produkcja rekombinowanych wektorów CAV2 opiera się na podstawowych, lecz istotnych technikach biologii molekularnej. Przed wytworzeniem wektorów wirusowych konieczne jest skonstruowanie rekombinowanego genomu CAV2 zawierającego kasetę ekspresyjną dla transgenu. Konstrukcja ta obejmuje dwa etapy: najpierw geny zainteresowania (GOI) są klonowane w plazmidzie transportowym jako kaseta ekspresyjna (t.j. z promotorem i sygnałem poliadenylacji). Ten element funkcjonalny jest flankowany przez dwie sekwencje genomowe po...

W ciągu ostatnich 15 lat, wektory pochodzące od psiego adenowirusa typu 2 (CAV2) udowodniły swoją skuteczność w transdukcji komórek in vitro i in vivo i są szeroko stosowane w szczepieniach i terapii genowej. W tym miejscu opisujemy procedurę konstruowania, wytwarzania i oczyszczania wektorów CAV2, w wyniku której powstają zawiesiny wirusa o wysokim mianie.

Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest skonstruowanie, wyprodukowanie i oczyszczenie wektorów pochodnych adenowirusa psów typu drugiego. Osiąga się to poprzez najpierw sklonowanie interesującego genu do plazmidu wahadłowego. Drugim krokiem jest uzyskanie rekombinowanego plazmidu genomowego za pomocą rekombinacji homologicznej.Następnie rekombinowane wadliwe cielę, dwa wirusy wyprodukowane i amplifikowane w linii komórkowej dopełniającej trans. Ostatnim krokiem jest oczyszczenie i zagęszczenie powstałego w ten sposób rekombinowanego wirusa do różnych zastosowań in vivo i in vitro. Ostatecznie immunofluorescencyjna mikroskopia konfokalna służy do pokazania przykładów transdukcji wirusa w mózgu gryzonia.Główną przewagą tych technik nad istniejącymi metodami, takimi jak wektory pochodzące z ludzkiej nerwicy, jest to, że w populacjach ludzkich nie ma wcześniej istniejącej odporności na cielę nr dwa. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie szczepień lub terapii genowej, takie jak ocena roli białek ulegających ekspresji w określonych obszarach mózgu. Tak więc tę procedurę zademonstrują May KY i Corin Bergeron.Dwóch badaczy z tytułem doktora z naszych laboratoriów przy

production-purification-non-replicative-canine-adenovirus-type-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty wyłącznie na infekcji komórek, który zwiększa wydajność produkcji rekombinowanego parwowirusa ponad 100-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu nowego pomocniczego adenowirusa typu 5 zawierającego jednostkę transkrypcyjną VP parwowirusa (Ad-VP).

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

W tym protokole, wektor AAV2 jest wytwarzany przez kokulturację komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9) z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wirusa bakulowirusa (BV)-AAV2-AAV2 lub genem terapeutycznym oraz komórkami Sf9 zakażonymi BV-AAV2-rep-cap w hodowli zawiesinowej. Cząsteczki AAV są uwalniane z komórek za pomocą detergentu, klarowane, oczyszczane za pomocą chromatografii kolumnowej powinowactwa i zagęszczane przez filtrację o przepływie stycznym.

Opracowanie procesu produkcji i oczyszczania wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV)2 przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji, oczyszczania i kwantyfikacji rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie. Protokół ten konsekwentnie daje &gt; 6 × 109 jednostek tworzących blaszki miażdżycowe/ml, zapewniając ilości wirusa odpowiednie do badań in vivo na zwierzętach. Opisano dodatkowe testy kontroli jakości w celu zapewnienia bezpieczeństwa in vivo.

Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Poznaj metodę produkcji i oczyszczania niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2 (CAV2) do zastosowań w terapii genowej i szczepieniach.

Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

Przeglądaj więcej filmów