Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

W ciągu ostatnich 15 lat, wektory pochodzące od psiego adenowirusa typu 2 (CAV2) udowodniły swoją skuteczność w transdukcji komórek in vitro i in vivo i są szeroko stosowane w szczepieniach i terapii genowej. W tym miejscu opisujemy procedurę konstruowania, wytwarzania i oczyszczania wektorów CAV2, w wyniku której powstają zawiesiny wirusa o wysokim mianie.

Ogólnym celem tej procedury jest skonstruowanie, wyprodukowanie i oczyszczenie wektorów pochodnych adenowirusa psów typu drugiego. Osiąga się to poprzez najpierw sklonowanie interesującego genu do plazmidu wahadłowego. Drugim krokiem jest uzyskanie rekombinowanego plazmidu genomowego za pomocą rekombinacji homologicznej.

Następnie rekombinowane wadliwe cielę, dwa wirusy wyprodukowane i amplifikowane w linii komórkowej dopełniającej trans. Ostatnim krokiem jest oczyszczenie i zagęszczenie powstałego w ten sposób rekombinowanego wirusa do różnych zastosowań in vivo i in vitro. Ostatecznie immunofluorescencyjna mikroskopia konfokalna służy do pokazania przykładów transdukcji wirusa w mózgu gryzonia.

Główną przewagą tych technik nad istniejącymi metodami, takimi jak wektory pochodzące z ludzkiej nerwicy, jest to, że w populacjach ludzkich nie ma wcześniej istniejącej odporności na cielę nr dwa. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie szczepień lub terapii genowej, takie jak ocena roli białek ulegających ekspresji w określonych obszarach mózgu. Tak więc tę procedurę zademonstrują May KY i Corin Bergeron.

Dwóch badaczy z tytułem doktora z naszych laboratoriów przygotowuje się do tej procedury na dzień przed transfekcją, wysiewając komórki DKE one na sześciodołkowej płytce do uprawy komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 w DMEM z wysoką glukozą zawierającą 7% ciepła, inaktywowane cielę płodu, surowicę sodu, pirogronian, penicylinę i streptomycynę. Następnego dnia komórki powinny być w 70 do 80% zlewające się do transfekcji, trawić dwa mikrogramy PCAL GOI, rekombinowany plazmid genomowy cav dwa z ASC, aby uwolnić niewirusową sekwencję plazmidu, sprawdź wynikowy wzór restrykcji o 0,8%Trawienie elektroforezą w żelu agro powinno dać około 31 kilo fragmentu pary zasad zawierającego rekombinowany genom i fragment dwóch par kilozasad odpowiadający szkieletowi plazmidu. Wymieszaj strawione DNA z 200 mikrolitrami bufora jet prime i wiruj przez 10 sekund.

Dodaj cztery mikrolitry jet prime i mieszaj przez wirowanie przez 10 sekund. Krótko odkręć, aby usunąć kropelki i inkubować przez 10 minut. W temperaturze pokojowej dodawać mieszankę transfekcyjną kroplami na komórki DKE one.

Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Tydzień po transfekcji zbierz komórki i pożywkę hodowlaną w 15-mililitrowej probówce polipropylenowej. Zarąb komórki za pomocą trzech cykli myślowych zamrażania.

Oczyść lizat przez odwirowanie przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 1 800 razy G. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze minus 20 do późniejszej propagacji wirusa w celu namnażania wirusa zainfekować 80 do 90% zlewającą się monowarstwę komórek DKE jeden wyhodowanych w jednym dołku sześciodołkowej płytki z 0,5 mililitra wirusa zawierającego supernatant. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę przy łagodnym mieszaniu Po godzinie. Usuń inokulum i zastąp je 1,5 mililitra kompletnego DMEM zawierającego 5% inaktywowanych termicznie komórek FCS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni.

Komórki powinny być codziennie monitorowane pod kątem pojawienia się efektu cytopatycznego lub CPE. Jeśli nie widać wyraźnego CPE. Zbierz komórki po czterech dniach hodowli i powtórz amplifikację wirusa, gdy wyraźny CPE zaatakuje większość komórek.

Zwykle po dwóch do czterech rundach amplifikacji wirusa zbiera się komórki za pomocą pożywki hodowlanej i zamraża rozmrażanie trzy razy, jak wykazano wcześniej. Infekcja od 80 do 90% zlewa. DKE jedną komórkę hodowaną w trzech szalkach do hodowli tkankowej o średnicy 10 centymetrów przy użyciu 1,5 mililitra supernatantu zawierającego wirusa na szalkę po trzech do czterech dniach, gdy CPE jest kompletny.

Zbierz komórki z tych naczyń o średnicy 10 centymetrów, rozbij je w trzech cyklach freestyle i oczyść lizat przez wirowanie przez 10 minut po 1,800 razy. G zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze minus 20 dla dużej skali Cav dwie amplifikacje, aby rozpocząć procedurę skalowania, zainfekować 80 do 90% zlewających się monowarstw DKE jeden komórek wyhodowanych w 40 naczyniach do hodowli tkankowej o średnicy 10 centymetrów na każdą szalkę, użyć 0,1 mililitra wirusa zawierającego supernatant rozcieńczony w jednym mililitrze kompletnego DMEM bez FCS, inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin pod łagodnym wzburzeniem. Po trzech do czterech godzinach dodaj pięć mililitrów kompletnego DMEM uzupełnionego 5% FCS i inkubuj przez trzy dni.

Po trzech dniach zbierz zainfekowane komórki z 40 10-centymetrowych szalek w 50-mililitrowych probówkach polipropylenowych, komórki granulowane pod ciśnieniem 1200 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Resus zawiesił je w 15 mililitrach pożywki DMEM, rozbijając komórki przez trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Usuń resztki komórek, odwirowując w temperaturze 1 800 razy G przez 10 minut.

Przechowywać supernatant w temperaturze minus 20 przed oczyszczeniem cząstek wirusa w celu oczyszczenia z cząstek wirusa. Przygotuj nieciągły gradient chlorku cezu w 14-mililitrowej probówce UltraClear. Najpierw wlej dwa mililitry roztworu chlorku cezu o większej gęstości na dno probówki.

Następnie powoli dodaj dwa mililitry roztworu chlorku cezu o mniejszej gęstości na wierzch pierwszego roztworu. Ostrożnie załaduj supernatant wirusa na gradient chlorku cezu. Napełnij probówkę olejem mineralnym do dwóch do trzech milimetrów od górnej wirówki w wahadłowym wirniku SW 40 na godzinę i 30 minut przy 130 000 razy g i 18 stopniach Celsjusza po odwirowaniu.

Dwa białe paski są wyraźnie widoczne na granicy faz między dwiema warstwami roztworu chlorku cezu. Za pomocą igły o rozmiarze 21 i strzykawki zebrać boczne nakłucie dolnego pasma zawierającego dojrzałe cząstki cav dwie. Staraj się w miarę możliwości unikać gromadzenia się górnego pasma, które odpowiada pustym cząsteczkom wirusa.

Przygotuj ciągły gradient chlorku cezu w 14-mililitrowej przezroczystej probówce, mieszając zbiorcze cząstki wirusa z roztworem chlorku cezu. Napełnij probówkę olejem mineralnym do dwóch do trzech milimetrów od górnej wirówki w wahadłowym wirniku SW 40 przez 18 godzin przy 130 000 razy G i 18 stopniach. Po odwirowaniu zebrać białe cielę, dwa zawierające pasmo, nakłuć bocznie strzykawką, jak pokazano wcześniej.

Ponownie staraj się unikać zbierania pozostałego górnego pasma. Powinno to być łatwiejsze w tym ciągłym gradiencie, który lepiej oddziela dwa pasma. Całkowita objętość zebranej zawiesiny nie powinna przekraczać dwóch mililitrów.

Następnie zrównoważyć kolumnę cidex G 25 PD 10 z 30 mililitrami PBS. Załaduj zawiesinę wirusa na kolumnę i odrzuć przepływ przez elucję z 500 mikrolitrowymi frakcjami PBS, zbierz frakcje od pięciu do siedmiu, które zwykle zawierają odsolone dwie cząstki. Frakcje zawierające wirusa można łatwo zidentyfikować, ponieważ są one błogosławione zapachem.

Na koniec dodać 150 mikrolitrów glicerolu do 1,5 mililitra zawiesiny CAV two i przechowywać w Eloqua w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu miareczkowania Cav 2 przez rozcieńczenie w punkcie końcowym, rozmrozić podwielokrotność oczyszczonego wirusa na lodzie i wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie w zakresie od 10 do minus dwa do 10 do minus 12 w DMEM wolnym od surowicy. Dodaj 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia wirusa do pięciu dołków 96-dołkowej płytki, dodaj 1,5 razy 10 do czwartej DKE po jednej komórce do każdej studzienki, inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez pięć dni w piątym dniu. Monitorowanie wyglądu CPE po infekcji za pomocą obserwacji mikroskopowej.

Miana zakaźne określa się jako medianę dawek zakaźnych w hodowli tkankowej przy użyciu metody statystycznej odczytu i mężczyzn przed wytworzeniem wektorów wirusowych. Rekombinowany genom CAV dwa z kasetą ekspresyjną dla transgenu jest konstruowany przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Po pierwsze, interesujący gen jest klonowany w plazmidzie wahadłowym jako kaseta ekspresyjna z wczesnym promotorem wirusa cytomegalii i sygnałem poliadenylacji otoczonym przez dwie pochodne sekwencje genomowe CAV reprezentujące sekwencje docelowe rekombinacji w górę i w dół.

W drugim etapie kaseta ekspresyjna jest wprowadzana z plazmidu wahadłowego do genomu CAV dwa za pomocą rekombinacji homologicznej. Wprowadzenie kasety ekspresji GOI doprowadzi do delecji EA i części genu E one B w genomie rekombinowanym. Po uzyskaniu rekombinowanego plazmidu genomowego cząsteczki wirusa są wytwarzane przy użyciu dwóch komórek CAV E i uzupełniających DKE jeden.

Wyraźny efekt cytopatyczny spowodowany dużą ilością cząstek wirusa wytwarzanych w zakażonych komórkach można łatwo uwidocznić za pomocą mikroskopii jasnego pola lub ekspresji transgenu. Ten przykład przedstawia GFP wyrażający CAV dwa wektory. Po kilku rundach amplifikacji wirusa przy użyciu świeżych komórek DKE one, cząsteczki wirusa są oczyszczane przez ultrawirowanie na gradientach chlorku cezu.

Skoncentrowane cząsteczki wirusa pojawiają się jako dwa opalizujące pasma w gradiencie cezu. Dolne prążki odpowiadają dojrzałemu rekombinowanemu cav dwa, który należy zebrać. Podczas gdy górne pasmo zawiera puste, niezakaźne cząstki, których należy unikać.

Uzyskany w ten sposób rekombinowany wektor cielęcy może być wykorzystany do transdukcji prawie wszystkich typów komórek u wielu różnych gatunków, zarówno in vitro, jak i in vivo. Pokazano tutaj jeden przykład zastosowania, w którym GFP eksprymujący CAV dwa został wstrzyknięty za pomocą taksówki stereo do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego myszy. Ponieważ protokół ten daje wysokie miano i czyste, czyste zapasy wirusa, wstrzyknięcie zaledwie jednego mikrolitra rozcieńczonego PBS GFP z ekspresją CAV dwa wektory w zakręcie zębatym lub DG prowadzi do 40 do 50% transdukcji neuronalnej.

Ponadto, ze względu na zdolność C dwa do transportu wstecznego w aksonach, wstrzyknięcie dwóch mikrolitrów rozcieńczonego PBS GFP eksprymującego CAV dwa wektory w prążkowiu umożliwia transdukcję prawie 80% neuronów AAL nigro stri w subs, nigra pars compacta Po jego rozwoju. Techniki te torują drogę naukowcom z dziedzin, wakcynologii lub neuronauk do badania nowych antygenów i funkcji genów w mózgu w wielu różnych modelach zwierzęcych. Nie zapominaj więc, że praca z CAF dwoma wektorami pochodnymi może być niezwykle niebezpieczna i ostrożna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować odpowiednie środki ograniczające rozprzestrzenianie się i postępowanie z odpadami, w tym środki ochrony osobistej i pracę w okapach z przepływem laminarnym w dwóch laboratoriach BSL.