Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza potwierdzającej elastyczności białek i jej zmian w odpowiedzi na środowisko, wiązanie ligandów lub interakcje białek. Osiąga się to poprzez wstępną inkubację białka będącego przedmiotem zainteresowania w różnych warunkach, co do których podejrzewa się, że wpływają na potwierdzenie białka, takich jak wiązanie ligandów. Mieszanina reakcyjna jest następnie rozcieńczana do tlenku deuteru, inkubowana w różnych odstępach czasu, a następnie analizowana za pomocą spektrometrii mas chromatografii cieczowej w celu określenia stopnia włączenia deutero do szkieletu peptydu.

Grupy amidowe, ponieważ obszary chronione mają zmniejszone włączenie deuterosu, porównanie widm peptydów w eksperymencie przy braku i obecności partnera wiążącego ujawnia przesunięcie OID widm ze względu na różnicę masy między protonem a deuteronem. Regiony, które wykazują wyraźną ochronę po dodaniu partnera wiążącego, są potencjalnymi miejscami wiązania. W zależności od pokrycia sekwencji i dostępności nakładających się peptydów, miejsca wiązania można zawęzić do kilku aminokwasów.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fałdowania białek i dynamiki białek, takie jak sposób fałdowania białek, ich rozwój, reakcje na wpływy fizyczne i chemiczne, takie jak wzrost temperatury lub metale ciężkie. Jak podobne wiązanie i interakcje białko-białko mogą wpływać na potwierdzenie białka. Jest to również bardzo ważne dla rozwoju leków białkowych do weryfikacji prawidłowego fałdowania i ogólnej kontroli jakości.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą napotkać kilka trudności. Jeśli na przykład białko nie jest dobrze trawione przez pepsynę, pokrycie sekwencji będzie niskie. Jeśli białko jest bardzo podatne na agregację, może agregować podczas inkubacji lub po dodaniu buforu wygaszającego, co spowoduje niską intensywność sygnału w spektrometrze mas.

W tej demonstracji zbadamy wiązanie drożdżowego molekularnego białka opiekuńczego, HP 90 z jego cos chaperone Sty za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej STY one wiąże się z HP 90 i ułatwia wiązanie klienta poprzez hamowanie aktywności ABA HB dziewięćdziesiąt. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania, próbek i kulek, jak wyszczególniono w protokole tekstowym. Aby przygotować kolumny do wymiany wodoru amidowego, należy odkręcić jedną stronę kolumny ochronnej i szczelnie wyjąć filtr.

Przykręć lejek do pakowania do otwartego końca kolumny. Użyj adaptera 16 cali, aby przymocować pustą pięciomililitrową strzykawkę do dolnego wylotu kolumny. Upewnij się, że jest szczelnie przymocowany do kolumny ochronnej.

Nałóż kilka kropel materiału do kulek gnojowicy na wierzch lejka. Pociągnąć za tłok strzykawki, aby zassać gnojowicę przez lejek do kolumny ochronnej. Nałóż więcej materiału na kulki gnojowicy na lejek i kontynuuj procedurę, aż kolumna ochronna zostanie całkowicie wypełniona materiałem ściegu.

Następnie wyjmij lejek przed szczelnym umieszczeniem filtra i pierścienia filtrującego na otwartym końcu. Przykręcić nasadkę kolumny do kolumny ochronnej i wyjąć strzykawkę z drugiej strony. Zamknij oba końce kolumn ochronnych zaślepkami.

Aby uniknąć wysychania materiału kolumny, należy skonfigurować system do spektrometrii mas wymiany wodoru. Najpierw podłącz kolumnę pułapki do wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub systemu HPLC. Zrównoważyć kolumnę, ustawiając natężenie przepływu pompy A na 0,4 mililitra na minutę z 0,1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnikiem.

Po kalibracji spektrometru masowego podłączyć wylot HPLC do źródła spektrometru masowego. Aby oznaczyć peptydy pepty, najpierw podłącz kolumnę Pepin, a następnie kolumnę analityczną do systemu. Ustaw parametry chromatografii i spektrometrii mas w oprogramowaniu sterującym, wybierając typ gradientu i metodę spektrometrii mas.

Wybierz długi gradient, aby zapewnić dobrą rozdzielczość chromatograficzną. Włącz tandemowe widma masowe na spektrometrze mas. Przygotuj od 100 do 200 pomo białka szoku cieplnego 90 lub HSP 90 w 100 mikrolitrach buforu H two L.

Dodać 100 mikrolitrów buforu hartowniczego i mieszać, pipetując w górę iw dół. Wstrzyknąć próbkę o objętości 200 mikrolitrów do portu wtryskowego zaworu wtryskowego za pomocą strzykawki Hamiltona. Ustawić zawór wtryskowy w pozycji wtrysku i uruchomić program chromatograficzny.

Następnie zidentyfikuj peptydy peptydowe białka szoku cieplnego 90, przeszukując bazę danych w poszukiwaniu powstałych peptydów. Obniż temperaturę systemu do zera stopni Celsjusza, dodając lodowatą wodę. Powtórz ten krok bez tandemowej spektrometrii mas i z gradientem, który zostanie użyty do rzeczywistego eksperymentu wymiany wodoru.

W przypadku białka szoku cieplnego 90 i STI należy użyć 10-minutowego gradientu od 90% rozpuszczalnika, 10% rozpuszczalnika B do 45% rozpuszczalnika, A 55% rozpuszczalnika B, określić czasy retencji zidentyfikowanych peptydów peptydowych w zastosowanym gradiencie i utworzyć listę zawierającą sekwencję peptydów, ładunek peptydu, stan i czas retencji. Zostanie to wykorzystane do identyfikacji każdego peptydu po eksperymentach z wymianą wodoru. Aby zidentyfikować interfejsy interakcji białek białkowych, najpierw skonfiguruj metodę gradientu i spektrometrii mas.

W oprogramowaniu sterującym należy użyć 10-minutowego gradientu liniowego od 90% rozpuszczalnika, 10% rozpuszczalnika B do 45% rozpuszczalnika. Obciążenie 55% rozpuszczalnikiem B to metoda spektrometrii mas, która jest zoptymalizowana pod kątem wykrywania w zakresie od 300 do 1, 500 stosunków masy do ładunku, chociaż większość peptydów będzie poniżej stosunku masy do ładunku 1000. Ustaw zawór wtryskowy w pozycji obciążenia i zawór sześciodrogowy.

W pozycji załadunku odsalania ustaw natężenie przepływu pompy podawczej na 0,4 mililitra na minutę. Po uruchomieniu niezmienionego odniesienia i 100% próbki kontrolnej zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować od 20 do 100 piko moli białka szoku cieplnego 90 w objętości od jednego do pięciu mikrolitrów. Dodać bufor tlenku deuteru o dostosowanej temperaturze, aby zwiększyć objętość próbki do 100 mikrolitrów, inkubować dokładnie przez okres czasu, który został wcześniej zdefiniowany, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Określając dynamiczny zakres wymiany, dodaj 100 mikrolitrów lodowatego zimna, bufor hartowniczy i dwukrotnie pipetę w górę iw dół, szybko wstrzyknij 200 mikrolitrów do zaworu wtryskowego HPLC. Ustawić zawór wtryskowy w pozycji wtrysku i natychmiast uruchomić program chromatograficzny. Po dwóch minutach przełącz zawór sześciodrogowy z pozycji ładowania odsalania do pozycji elucji.

Zrób to dla każdego białka indywidualnie, aby określić inkorporację deuteronu do każdego peptydu pod nieobecność białka oddziałującego, aby określić powierzchnię oddziaływania miesza białko szoku cieplnego 90 z co najmniej dwukrotnym nadmiarem STI jeden, aby przesunąć równowagę do stanu związanego, inkubować w żądanej temperaturze, aż tworzenie kompleksu osiągnie równowagę. Po inkubacji dodać bufor tlenku deuteru o dostosowanej temperaturze, aby zwiększyć objętość próbki do 100 mikrolitrów i inkubować dokładnie przez określony czas. Następnie dodaj 100 mikrolitrów lodowatego buforu hartowniczego i pipetuj dwukrotnie w górę iw dół, szybko wstrzyknij białko i uruchom jak poprzednio.

Przeanalizuj uzyskane dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania i wykorzystaj wyznaczone czasy retencji, aby znaleźć każdy peptyd w analizie. Obliczyć OID rozkładu izotopów dla niezmienionego białka i dla doświadczeń wymiany wodoru, porównać włączenie deuteros samego białka docelowego i z nadmiarem partnera wiążącego. Można to zrobić automatycznie za pomocą komercyjnego oprogramowania lub ręcznie za pomocą arkusza kalkulacyjnego M, bezpośrednia interakcja białka między HS P 90 a STI one została przetestowana poprzez porównanie widm peptydów STI one pod nieobecność i obecność HS P 90 po znakowaniu tlenkiem deuteru.

Wynikowy wykres różnicowy ujawnia, że głównie peptydy w TPR dwa A i TPR dwa B wykazują silną ochronę w obecności HS P 90, co wskazuje, że regiony te oddziałują z HS P 90. Ochronę w TPR dwa A można łatwo zracjonalizować na podstawie struktury krystalicznej STY jeden TPR dwa A TPR dwa B w kompleksie z peptydem HS P 90, który jest zabarwiony zgodnie z liczbą protonów amyloidowych chronionych przed włączeniem DEUTERO. Tak wyraźna ochrona w oddziaływaniach białek nie zawsze jest obserwowana.

Ochrona w HSP 90 w obecności choroby przenoszonej drogą płciową nie jest tak wyraźna i nie tak zlokalizowana jak w przypadku choroby przenoszonej drogą płciową. Wszystkie peptydy wykazują nieco zwiększoną ochronę przed inkorporacją deutero. Pokazano tutaj kreskówkową reprezentację drożdży HS P 90 pokolorowaną zgodnie z liczbą protonów amli chronionych przed włączeniem deuteronu, STY jeden stabilizuje HS P 90 globalnie, ponieważ żaden region białka nie wykazuje większej elastyczności w jego obecności.

Nie jest jasne, czy ta zmniejszona inkorporacja deuteronu wynika z bezpośredniej interakcji z jęczmieniem, czy też z efektów allosterycznych. Po potwierdzeniu ciągłego znakowania HSP 90, wykorzystano wymianę wodoru, spektrometrię mas do badania dynamiki różnych regionów białka. Pokazano tutaj widma peptydu od 43 do 62 z domeny wiążącej nukleotydy HSP 90.

W obecności i braku choroby przenoszonej drogą płciową, widma peptydowe wykazują zależne od czasu włączenie deuteru, które zwiększa się wraz z dłuższą inkubacją. Stopień ochrony zmienia się w czasie inkubacji, wykazując większą różnicę przy krótszych czasach inkubacji i prawie podobnych kursach wymiany w najdłuższym punkcie czasowym. Sugeruje to niższy stopień stabilizacji lub obszar dynamicznych interakcji z częstą dysocjacją i łączeniem.

Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu skrupulatnie stałych warunków i przygotowaniu wszystkiego przed rozpoczęciem reakcji wymiany. Zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak lokalizacja miejsc interakcji w kompleksach białkowych.