Name: Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj metody badania homeostazy białek w Caenorhabditis elegans na poziomie organizmu, komórek i białek. Techniki obejmują testy behawioralne, mikroskopię immunofluorescencyjną oraz analizę Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie szczepy nicieni użyte w tej pracy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez NIH National Center for Research Resources (NCRR). Przeciwciała monoklonalne opracowane przez H.F. Epsteina uzyskano z Banku Hybrydomy Badań Rozwojowych opracowanego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez Wydział Biologii Uniwersytetu Iowa. N. Shemesh był wspierany przez Fay and Harbour Award. A.B.-Z. był wspierany przez izraelską Radę ds. Szkolnictwa Wyższego Alon Fellowship, przez międzynarodowy grant reintegracyjny Marie Curie oraz przez granty Binational Science Foundation i Israeli Science Foundation (grant nr 91/11).

Używanie testów behawioralnych do monitorowania fałdowania białek w żywym organizmie
1. Synchronizacja zwierząt do testów behawioralnych
<ol>
	<li>Należy postępować zgodnie ze standardowymi metodami utrzymania C. elegans36, w tym przygotowywaniem pożywek i płytek, przygotowywaniem żywności i warunkami wzrostu zwierząt. Dokładnie kontroluj warunki uprawy, w tym temperaturę (15-25 °C), wielkość populacji i dostępność żywności. Wyrzuć każdą płytkę, która wykazuje zanieczyszczenie bakteryjne lub grzybicze.</li>
	<li>Weź 15-30 zarodków, przenieś je na nowe płytki i hoduj w żądanej temperaturze (15-25 °C) przez czas trwania eksperymentu. Alternatywnie, połóż 10-20 ciężarnych dorosłych na talerzu, pozwól im składać jaja przez 30-60 minut, a następnie wyjmij je z talerza. Zarówno bezpośrednie pobieranie zarodków, jak i ustawianie ciężaru dorosłych osobników spowoduje pewną zmienność wieku (±6 godz.). Aby zmniejszyć tę zmienność, wybierz zarodki na określonym etapie, na przykład w fazie przecinka, lub ustaw 10-20 dorosłych osobników, którzy dopiero zaczynają składać jaja (2 dzień dorosłości). Unikaj synchronizacji przez wybielanie, jeśli to możliwe, biorąc pod uwagę, że zabieg ten jest stresujący i może wpływać na proteostazę.</li>
	<li>Wybierz zsynchronizowane zwierzęta, przenieś je na płytkę testową w celu oceny, a następnie odrzuć.</li>
</ol>
2. Test ruchu
Wybierz zsynchronizowane zwierzęta i przenieś je na czystą płytę w pożądanej temperaturze do oceny ruchu (15-25 °C). Dla każdej kontrpróby biologicznej należy ocenić >20 zwierząt i powtórzyć test co najmniej 3 razy na warunek doświadczalny. Użyj testu sumy rang Wilcoxona Manna-Whitneya, aby porównać dwa niezależne warunki eksperymentalne.
<ol>
	<li>Aby sprawdzić, czy nie ma łagodnych zaburzeń ruchowych, ustaw 5-7 zwierząt razem na środku czystego trawnika bakteryjnego i pozwól zwierzętom poruszać się po talerzu przez 2 minuty. Ten przedział czasu został określony na podstawie czasu, w którym 90% zwierząt typu dzikiego pokonało 1-centymetrowy okrąg.</li>
	<li>Policz liczbę zwierząt, które nie opuściły okręgu o szerokości 1 cm (np. które pozostały w promieniu 1 cm od punktu, w którym zostały ustawione) w ciągu 2 minut jako nieskoordynowane.</li>
	<li>Aby stwierdzić poważne upośledzenie ruchowe, umieść zwierzęta na czystym trawniku bakteryjnym.</li>
	<li>Sfotografuj kilka zwierząt w czasie zero (t=0) i ponownie 5 minut później (t=5). Oceniaj zwierzęta, które nie poruszyły się o jedną długość ciała po 5 minutach, jako sparaliżowane.</li>
</ol>
3. Odporność termiczna
<ol>
	<li>Wybrać >20 zsynchronizowanych zwierząt i przenieść je na 24-dołkową płytkę zawierającą 450 μl buforu szoku cieplnego (HS) (Tabela 1). Dla każdej kontrpróby biologicznej należy ocenić wynik >20 zwierząt i powtórzyć test co najmniej 4 razy na każdy warunek doświadczalny.</li>
	<li>Przenieść płytkę 24-dołkową do podgrzewanej kąpieli. Temperatura i czas trwania HS silnie zależą od warunków wzrostu, w szczególności od temperatury uprawy.</li>
	<li>Uzupełnić bufor HS 9 μl oranżerii SYTOX.</li>
	<li>Oceń przeżywalność zwierząt, monitorując wychwyt barwnika za pomocą stereoskopu fluorescencyjnego z filtrem TXR. Zwierzęta, które przyjęły barwnik, nie żyją. Użyj testu sumy rang Wilcoxona Manna-Whitneya, aby porównać dwa niezależne warunki eksperymentalne.</li>
</ol>
Używanie barwienia immunologicznego i oznaczonych białek do monitorowania fałdowania białek w określonych komórkach
4. Monitorowanie lokalizacji białek za pomocą barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Na wymaganym etapie przenieść co najmniej 30 zwierząt do probówki Eppendorfa zawierającej buforM9 36.</li>
	<li>Umyj zwierzęta kilka razy buforem M9, wykonując krótki etap wirowania przy niskiej prędkości (3 000 obr./min/900 x g, 2 min) i ponownie zawiesić.</li>
	<li>Umieść rurki na lodzie na kilka minut, aby ostygły.</li>
	<li>Usunąć nadmiar płynu i inkubować z 500 μl lodowatego 4% roztworu paraformaldehydu (Tabela 2). Czas inkubacji musi być skalibrowany dla każdego badanego białka i powinien wynosić około 5-30 minut w temperaturze pokojowej. Można również przeprowadzić przedłużoną inkubację w temperaturze 4 °C, ale może to pogorszyć przepuszczalność próbki.</li>
	<li>Utrwalone zwierzęta umyć 3x buforem PBS-Tween (pH 7,2) przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min). Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>Zbierz zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min).</li>
	<li>Z okapu usunąć większość supernatantu i ponownie zawiesić osad w 1 ml roztworu β-merkaptoetanolu (β-ME) (Tabela 2).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, delikatnie kołysząc na nutatorze.</li>
	<li>W kapturze umyj zwierzęta 3x buforem PBS-Tween (pH 7,2).</li>
	<li>Zawiesić zwierzęta w 50-100 μl PBS-Tween (pH 7,2). Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>Zbierz zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min) i usuń większość buforu PBS-Tween.</li>
	<li>Dodać 100-150 μl roztworu kolagenazy do każdej probówki i inkubować w temperaturze 37 °C z silnym mieszaniem (przy użyciu mieszalnika termicznego lub inkubatora z wytrząsaniem).</li>
	<li>Badaj zwierzęta często pod mikroskopem stereoskopowym, rozpoczynając po 5 minutach inkubacji. Gdy 20% zwierząt zostanie złamanych, przerwij reakcję, umieszczając rurkę na lodzie. Ten krok jest bardzo wrażliwy! Czas trwania leczenia zależy od warunków utrwalenia i może się znacznie różnić w zależności od szczepu. Długotrwała inkubacja może spowodować całkowitą degradację zwierząt. Warunki muszą być skalibrowane dla każdej użytej partii enzymu, a degradacja powinna być dokładnie monitorowana.</li>
	<li>Umyj zwierzęta dwukrotnie w PBS-Tween (pH 7,2), a następnie zbierz zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min) i usuń większość buforu PBS-Tween.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu AbA (Tabela 2) i inkubować z delikatnym kołysaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>Zebrać zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min) i ponownie zawiesić w 200 μl AbA.</li>
	<li>Dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:100-1:1,000 w roztworze AbA i inkubować, delikatnie kołysząc. Temperatura i czas trwania inkubacji mogą się różnić w zależności od przeciwciał i powinny być kalibrowane dla każdego badanego białka. Zaczynamy od całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj zwierzęta przez odwirowanie (3 000 obr./min, 1-2 min).</li>
	<li>Dodać bufor AbA (1 ml) i inkubować z delikatnym mieszaniem przez 15-60 minut w temperaturze pokojowej. Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>Opcjonalnie: Próbka może być również barwiona barwnikami fluorescencyjnymi. W tym celu należy dodać barwnik (np. DAPI (2 mg/ml) lub falloidynę (1:100)) do 200 μl AbA i inkubować z delikatnym kołysaniem przez maksymalnie 1 godzinę. Ten krok można wykonać podczas jednego z etapów płukania przeciwciała wtórnego.</li>
	<li>Umyj zwierzęta 3x, powtarzając kroki 4.18-4.19.</li>
	<li>Dodać 100 μl AbA z odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym, rozcieńczonym w stosunku 1:100.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać pod przykryciem (lub w ciemnej probówce) i inkubować z kołysaniem przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć zwierzęta 3x przez inkubację w buforze AbA (1 ml) z delikatnym mieszaniem przez 15-60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować (3 000 obr./min, 1-2 min). Na tym etapie zwierzęta mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	<li>Aby zamontować zwierzęta na szkiełkach, należy usunąć cały płyn i ponownie zawiesić w 10 μl tego samego buforu.</li>
	<li>Odetnij koniec końcówki pipety, aby uniknąć przecierania się zwierząt, i przenieś 1-2 μl próbki na szkiełko</li> podstawowe.
	<li>Dodaj medium montażowe w proporcji 1:1.</li>
	<li>Delikatnie przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci. Jeśli szkiełko nie jest natychmiast monitorowane, można je przechowywać w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.</li>
</ol>
5. Monitoruj lokalizację oznaczonych białek
<ol>
	<li>Na wymaganym etapie zebrać co najmniej 15 zwierząt do 10 ml kropli buforu M9 na szkiełku.</li>
	<li>Za pomocą "wykałacza do robaków" przenieś zwierzęta do 10 ml kropli roztworu paraformaldehydu (4%) (Tabela 2) i poczekaj, aż wszystkie zwierzęta przestaną się poruszać (około 5 minut).</li>
	<li>Za pomocą "wytrycha do robaków" przenieś zwierzęta do 2 ml kropli buforu M9 i podłoża montażowego (1:1) (Tabela 2).</li>
	<li>Delikatnie przykryj zwierzęta szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci.</li>
</ol>
Używanie testów ex vivo do monitorowania fałdowania i stabilności białek
6. Częściowe trawienie
<ol>
	<li>Umyj zwierzęta z 15 płytek (60 mm) za pomocą 1-2 ml buforu M9 w probówce do mikrofuge. Należy pamiętać, że zwierzęta nie powinny być stłoczone, a wystarczająca ilość pożywienia powinna być dostępna przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Umyj zwierzęta kilka razy buforem M9 poprzez odwirowanie (3 000 obr./min, 2 min) i ponowne zawieszenie zwierząt.</li>
	<li>Po ostatnim wirowaniu ponownie zawieś zwierzęta w buforze M9 o pojemności 100 μl.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrażanie w cieczy N2. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Za pomocą schłodzonego tłuczka i zmotoryzowanego wiertła (można również użyć ręcznej wiertarki do hodowli tkankowych), zmielić próbkę. Trzymaj próbkę na lodzie i unikaj przegrzania.</li>
	<li>Często badaj zwierzęta pod mikroskopem stereoskopowym, aby określić, czy mielenie zostało zakończone. Jeśli pozostaną nienaruszone zwierzęta, powtórz procedurę.</li>
	<li>Oszacuj objętość, pipetując ekstrakt z robaków.</li>
	<li>Dodać w stosunku 1:1 (2x) roztworu do lizy robaków (Tabela 3). Nie należy stosować żadnych inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Usunąć zanieczyszczenia przez odwirowanie (1 000 x g przez 2 min) we wstępnie schłodzonej wirówce (4 °C).</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrofuge. Próbki mogą być używane bezpośrednio lub przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór chymotrypsyny (Tabela 3) i przechowywać na lodzie do momentu użycia.</li>
	<li>Określ całkowite stężenie białka za pomocą testu Bradforda.</li>
	<li>W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę tak, aby całkowite stężenie białka wynosiło 3-3,5 mg/ml.</li>
	<li>Dodać roztwór chymotrypsyny do całkowitego lizatu białkowego (1:1,200).</li>
	<li>Aby określić czas inkubacji, inkubować próbkę z chymotrypsyną przez 60 minut. Usunąć 20 μl podwielokrotności z próbki w różnych punktach czasowych (np. 0, 5, 20, 40 i 60 min), natychmiast wymieszać z buforem próbki SDS i gotować przez 5 minut w temperaturze 96 °C. *Alternatywnie, inkubować próbkę z różnymi stężeniami chymotrypsyny i zatrzymać reakcję po określonym czasie, dodając bufor próbki SDS i gotując przez 5 minut w temperaturze 96 °C.</li>
	<li>Uruchom próbki na żelu SDS-PAGE.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał w celu określenia względnej stabilności białka.</li>
	<li>Określ optymalne warunki (stężenie chymotrypsyny i czas trawienia), które wykazują znaczące zmiany między próbkami i wykorzystaj te warunki do przyszłych eksperymentów.</li>
	<li>Określ intensywność różnych produktów trawienia (fragmenty o niższej masie cząsteczkowej) za pomocą oprogramowania do densytometrii, takiego jak moduł żelu do obrazowania NIH.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Sondy o zdolności proteostazy komórkowej muszą być bardzo wrażliwe na zmiany w środowisku fałdowania i być łatwe do monitorowania, aby zapewnić ocenę w czasie rzeczywistym możliwości kontroli jakości fałdowania białek. Używając białek metastabilnych jako sond zdolności proteostazy, monitorowaliśmy zmiany w fenotypie, lokalizacji białek subkomórkowych i konformacji białek. Przedstawione tutaj protokoły koncentrują się na fenotypach związanych z białkami mięśniowymi, w tym ruchliwości, organizacji włókien mięśniowych i sta...

Wzajemne oddziaływanie różnych etapów biosyntezy białek, takich jak transkrypcja, przetwarzanie i translacja mRNA, a także fałdowanie, translokacja i składanie/demontaż białek, determinuje obciążenie metastabilnych białek, które zależą od maszynerii kontroli jakości białek komórkowych dla ich funkcji1. Brak lub nieprawidłowe działanie mechanizmów kontroli jakości białek może zatem skutkować pogorszeniem funkcjonalności różnych typów maszynerii komórkowej i wystąpieniem chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek2-7. Gdy zdolność maszynerii do fałdowania i usuwania białek jest zrównoważona z obciążeniem metastabilnych białek, osiąga się homeostazę białek (proteostazę), stan, który ostatecznie zapobiega akumulacji nieprawidłowo sfałdowanych białek i agregacji w komórkach6. Uważa się, że akumulacja nieprawidłowo sfałdowanych białek jest sygnałem, który aktywuje czynniki transkrypcyjne indukowane stresem, takie jak czynnik szoku cieplnego (HSF-1), i powoduje aktywację cytoprotekcyjnych odpowiedzi na stres6,8.
Nasze zrozumienie funkcji sieci proteostazy w metazoanach pochodzi głównie z badań nad rekonstytucją in vitro oraz z obserwacji przeprowadzonych na komórkach hodowli tkankowej i organizmach jednokomórkowych9. Na przykład badania nad molekularnymi białkami opiekuńczymi, które zapobiegają uszkodzeniom białek i je rozwiązują, koncentrowały się na badaniach biochemicznych i biologicznych komórek nad mechanizmami fałdowania, dezagregacji i translokacji białek za pośrednictwem białek opiekuńczych10-13. Dla porównania, dostępne są tylko ograniczone informacje na temat zintegrowanej funkcji różnych składników proteostazy w różnych komórkach i tkankach metazoanów w "normalnych" warunkach wzrostu i w odpowiedzi na stres11. Odkrycie, że u C. elegans kontrola jakości białek komórkowych może być również regulowana w komórce nieautonomicznie, co znalazło odzwierciedlenie w eksperymentach pokazujących, że mutacje w dwóch neuronach, które postrzegają temperaturę, mogą blokować aktywację reakcji na szok cieplny i zmniejszać tolerancję termiczną, wykazało potrzebę zbadania regulacji proteostazy w organizmach wielokomórkowych14-17. Brakuje jednak spójnego obrazu tego, w jaki sposób sieci proteostazy, takie jak różne rodziny molekularnych białek opiekuńczych, funkcjonują w tkankach nienaruszonego metazoanu i jak dynamiczne są te sieci podczas rozwoju i starzenia się. Aby osiągnąć ten cel, potrzebne są niezawodne czujniki do monitorowania utrzymania proteomu u żywych zwierząt, aby określić zdolność proteostatyczną różnych komórek w organizmie wielokomórkowym w trakcie rozwoju i starzenia się.
Aby dane białko mogło funkcjonować jako czujnik proteostazy komórkowej, musi reagować na zmiany w środowisku fałdowania komórek, tylko minimalnie ingerując w fałdowanie niepowiązanych białek w komórce. Aby zbadać utrzymanie i regenerację proteostazy komórkowej w żywym organizmie, można zastosować dwa uzupełniające się podejścia, które zależą od składanych czujników. Pierwszy z nich opiera się na zaprojektowanych czujnikach składania, opartych na eksperymentalnie zidentyfikowanych metastabilnych białkach, o których wiadomo, że zależą od maszynerii proteostazy, takich jak lucyferazy świetlika18-20 lub GFP oznaczone degronem21-24. W drugim podejściu endogenne białka metastabilne, takie jak białka wrażliwe na temperaturę (ts) lub zależne od wieku białka agregujące, które reagują na przyrostowe zmiany w środowisku komórkowym, są śledzone25-27. Zaprojektowane czujniki składane nie pełnią żadnej istotnej funkcji biologicznej, a mimo to mają tę zaletę, że są wykrywalne za pomocą potężnych testów sprawozdawczych, takich jak białka znakowane GFP, i mogą być stosowane w wielu różnych modelach komórkowych i zwierzęcych18. Ponieważ jednak wprowadzenie pojedynczego obcego białka może wpływać na środowisko fałdowania27, takie polipeptydy mogą przeciążać maszynerię proteostazy komórkowej. Alternatywnie, zaprojektowane czujniki składania, które nie są natywne dla komórki, na którą składają raport, mogą nie być dotknięte zmianami w zdolności komórki do proteostazy. Na przykład, jeden substrat reporterowy proteasomu znakowany GFP wymagał zahamowania ~90% proteasomu przed wykryciem fenotypu23. W przeciwieństwie do tego, endogenne białka metastabilne, które opierają się na maszynerii proteostazy komórki, mają tę zaletę, że mieszczą się w zakresie wrażliwości komórkowej. Jednak utrata funkcji związana z nieprawidłowym fałdowaniem takich białek może również wpływać na funkcjonowanie komórek i żywotność organizmu. W tym miejscu skupimy się na zastosowaniu endogennych czujników składania C. elegans.
C. elegans to dobrze znany model metazoanowy do badania zarówno rozwoju, jak i starzenia się, który wykorzystuje wiele zachowanych szlaków biologicznych i może być używany do śledzenia fałdowania białek w komórce, przy użyciu kombinacji podejścia biochemicznego i genetycznego. Wykorzystaliśmy białka metastabilne jako sondy zdolności proteostatycznej, monitorując zmiany w ich fenotypie, lokalizacji i stabilności. Co więcej, różne funkcje białek można badać za pomocą prostej analizy behawioralnej. Podobnie, znaczna błędna lokalizacja białek występuje, gdy sieci kontroli jakości białek komórkowych nie dostosowują się do wymagań komórkowych. Białka można łatwo uwidocznić w komórkach żywych zwierząt za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie lub poprzez barwienie immunologiczne. Wreszcie, przy użyciu metod ex vivo, możliwe jest monitorowanie ekspresji i stabilności białek. Pozwala to na szybkie i proste badania przesiewowe zmian behawioralnych i fizjologicznych, w połączeniu z dogłębną analizą lokalizacji i stabilności białek, co pozwala na monitorowanie modyfikatorów proteostazy. Łącząc te różne metody, można uzyskać szeroki obraz środowiska fałdowania białek w komórce. Rzeczywiście, strategia ta została z powodzeniem wykorzystana do monitorowania zaburzeń proteostazy u C. elegans, drożdży, kultur tkankowych i bakterii15,25-35.

<table><tbody><tr><td>Ustalanie i fialekcja przeciwciał</td><td>paraformaldehyd</td><td>Merc</td><td></td></tr><tr><td>8187151000 Tween-20&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merc</td><td>8034560100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa</td><td>Aesar A16046</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -ME</td><td>Sigma 8057400250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Di Cam</td><td>000-40-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Częściowe podsumowanie&nbsp;</td><td>Chymotrypsyna</td><td>Sigma</td><td>C4129-250MG</td></tr><tr><td>Odporność termiczna</td><td>SYTOX Orange</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Amaresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>SPRZĘT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC fluorescencyjny stereoskop</td><td>Filtr Leica</td><td></td><td>TXR</td></tr><tr><td>EXi Kamera do mikroskopii fluorescencyjnej</td><td>niebieskiej QImaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny ConfoCor 3/510 META</td><td>Tłuczki do pelletu Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Akumulatorowy silnik do granulek</td><td>Kontes</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17 Seria mikrowirówek</td><td>Thermo</td><td>75002455</td><td>Chłodzenie, 230 V 50/60 Hz, zawiera 24x rotor 1,5/2,0 ml z pokrywą biologiczną ClickSeal</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Składanie i składanie białek jest niezbędne dla funkcjonowania białek, długoterminowego zdrowia komórki i długowieczności organizmu. Historycznie rzecz biorąc, funkcję i regulację fałdowania białek badano in vitro, w izolowanych komórkach hodowli tkankowej oraz w organizmach jednokomórkowych. Ostatnie badania ujawniły powiązania między homeostazą białek (proteostazą), metabolizmem, rozwojem, starzeniem się i wykrywaniem temperatury. Odkrycia te doprowadziły do opracowania nowych narzędzi do monitorowania fałdowania białek w modelowym organizmie metazoańskim Caenorhabditis elegans. W naszym laboratorium łączymy testy behawioralne, obrazowanie i podejścia biochemiczne, wykorzystując wrażliwe na temperaturę lub naturalnie występujące białka metastabilne jako czujniki środowiska fałdowania w celu monitorowania nieprawidłowego fałdowania białek. Testy behawioralne, które są związane z nieprawidłowym fałdowaniem określonego białka, zapewniają prosty i potężny odczyt fałdowania białek, umożliwiając szybkie badanie przesiewowe genów i warunków, które modulują fałdowanie. Podobnie, takie nieprawidłowe fałdowanie może być związane z nieprawidłową lokalizacją białka w komórce. Monitorowanie lokalizacji białek może zatem uwidocznić zmiany w zdolności fałdowania komórek zachodzące w różnych tkankach, na różnych etapach rozwoju i w obliczu zmieniających się warunków. Wreszcie, korzystając z narzędzi biochemicznych ex vivo, możemy bezpośrednio monitorować stabilność i konformację białek. W ten sposób, łącząc testy behawioralne, obrazowanie i techniki biochemiczne, jesteśmy w stanie monitorować nieprawidłowe fałdowanie białek z rozdzielczością odpowiednio organizmu, komórki i białka.

Zaburzone środowisko fałdowania może prowadzić do błędnego fałdowania i agregacji białek. Błędne fałdowanie białek wiąże się ze zmianą konformacji i skutkuje utratą funkcji białka. Stosujemy uzupełniające podejścia w celu monitorowania fałdowania i funkcji białek w całych organizmach, konkretnych komórkach oraz ekstraktach białkowych. Inteligentny dobór sensora fałdowania, oparty na silnych fenotypach behawioralnych i komórkowych związanych ze znaną mutacją destabilizującą, może następnie służyć do monitorowania zmian w ...

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Ogólnym celem poniższych eksperymentów na genetycznie podatnym metazoanie elegancji CENO R jest monitorowanie nieprawidłowego fałdowania białek na trzech poziomach: organizmu, komórek i białek. Fenotypy behawioralne, takie jak ruchliwość lub odporność termiczna, funkcjonują jako odczyty zmian w homeostazie białek na poziomie organizmu, wrażliwych na temperaturę lub występujących naturalnie. Białka metastabilne są wykorzystywane do śledzenia lokalizacji mis białek, co może być związane z nieprawidłowym fałdowaniem białek.Test częściowego trawienia ex vivo monitoruje stabilność białka bezpośrednio. Wyniki mogą wykazać zmiany zdolności proteostazy w różnych temperaturach uprawy w oparciu o test odporności termicznej, mikroskopię immunofluorescencyjną i zachodnią analizę krwi. Procedury te zostaną zademonstrowane przez doktorantów w moim laboratorium.Test behawioralny zostanie zademonstrowany przez ish ido, a Shai zademonstruje barwienie immunologiczne i ANA flunking, a sheron wykaże częściowe trawienie. Temu protokołowi pomiaru tolerancji temperatury towarzyszą etapy przygotowawcze do synchronizacji zwierząt i test ruchu. Oba są opisane w protokole tekstowym, zaczynają się od zebrania replik zawierających co najmniej 20 zsynchronizowanych zwierząt.W 24 dobrze rozegranych studniach zawierających 450 mikrolitrów bufora szoku cieplnego. Uzupełnij każdą studzienkę dziewięcioma mikrolitrami cytoksyny. Teraz przenieś talerz do podgrzewanej kąpieli.Szok cieplny, temperatura i czas trwania silnie zależą od warunków wzrostu. W szczególności temperatura uprawy wpływa na przeżywalność zwierzęcia poprzez monitorowanie jego pobierania przez matrycę. Używając fluorescencyjnego stereoskopu z filtrem TXR, zwierzęta, które biorą do ręki matrycę, są martwe.Główną zaletą tej techniki istniejących metod, takich jak kine, tolerancja przez ręczną punktację, jest wykorzystanie wizualnego odczytu śmiertelności zwierząt, co sprawia, że ten esej jest znacznie szybszy i bardziej powtarzalny. Na wymaganym etapie przenieść co najmniej 30 zwierząt do probówki mikrowirówki zawierającej bufor M nine. Umyj zwierzęta kilka razy za pomocą M nine, wykonując krótkie etapy wirowania z małą prędkością, a Resus zawiesza je w M nine.Następnie umieść probówki na lodzie na kilka minut, aby ostygły. Po schłodzeniu usuń nadmiar płynu i inkubuj probówki. W 500 mikrolitrach lodowatego zimnego 4% aldehydu PARAFORM.Czas inkubacji musi być skalibrowany dla każdego badanego białka i powinien wynosić około pięciu do 30 minut w temperaturze pokojowej. Teraz umyj utrwalone zwierzęta trzykrotnie za pomocą PBS tween o pH 7,2 przez odwirowanie. Wirowanie odbywa się zawsze z prędkością 3000 obr./min przez jedną lub dwie minuty, chyba że określono inaczej.W kapturze usuń większość supernatantu i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze roztworu merkaptoetanolu wiązkowego. Następnie wysiaduj zwierzęta w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, a następnego dnia delikatnie kołysząc w kapturze. Umyj zwierzęta trzykrotnie PBST przez odwirowanie i Resus.Zakończ mycie od 50 do 100 mikrolitrów PBST i usuń większość tego PBST po kolejnym odwirowaniu. Następnie dodaj 100 do 150 mikrolitrów roztworu kolagenazy i inkubuj zwierzęta w temperaturze 37 stopni Celsjusza z silnym mieszaniem. Użyj miksera termicznego lub inkubatora z wytrząsaniem.Po pięciu minutach zacznij wykonywać okresowe kontrole pod mikroskopem stereoskopowym. Gdy jedna piąta zwierząt zostanie złamana, przerwij reakcję, umieszczając rurkę na lodzie. Ten krok jest bardzo wrażliwy.Czas trwania leczenia zależy od warunków utrwalenia i może się znacznie różnić w zależności od szczepu. Długotrwała inkubacja może spowodować całkowitą degradację zwierząt. Warunki muszą być skalibrowane przed każdą partią enzymu, a degradacja powinna być dokładnie monitorowana.Następnie umyj zwierzęta dwukrotnie w PBST. Zebrać zwierzęta przez odwirowanie i usunąć większość PBST. Następnie dodać jeden mililitr roztworu BA, a następnie inkubować z delikatnym kołysaniem przez godzinę w temperaturze pokojowej, zebrać zwierzęta przez odwirowanie i ponownie zawiesić je w 200 mikrolitrach b b, A. Teraz dodaj przeciwciało pierwszorzędowe i rozpocznij inkubację przez noc z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej.Parametry te należy skalibrować. Następnie umyj zwierzęta przez odwirowanie. Zawieś je ponownie w mililitrze b, A i inkubuj je z delikatnym mieszaniem przez 15 minut do godziny W temperaturze pokojowej.W tym momencie można dodać opcjonalny dodatek barwnika fluorescencyjnego. Następnie powtórzyć płukanie buforem BA jeszcze trzy razy i zakończyć płukanie za pomocą Resus, zawieszając w 100 mikrolitrach BA z odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym w rozcieńczeniu jeden do 100. Próbki należy inkubować, kołysząc przez kilka godzin w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem w celu usunięcia materiału wtórnego.Wykonaj trzy prania za pomocą a, b, a. Następnie zamontuj zwierzęta na szkiełkach za pomocą najpierw Resus, zawieszając je w 10 mikrolitrach a, b, a, a następnie za pomocą pipety o szerokim otworze przenieś jeden lub dwa mikrolitry próbki do każdego szkiełka, dodaj równą objętość podłoża montażowego i przykryj szkiełko. Delikatnie uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci.Szkiełka mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dłuższy czas. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tym protokole będą miały problemy, ponieważ protokół jest długi i zawiera wiele kroków, które mogą wpłynąć na jego skuteczność, utrudniając rozwiązywanie problemów. Zacznij od zebrania zwierząt z około 1560 milimetrowych płytek do jednego lub dwóch mililitrów buforu M nine.Zwierzęta nie powinny być przeludnione. Umyj zwierzęta kilka razy buforem M nine, odwirowując i zawieszając zwierzęta. Po ostatnim wirowaniu resus zawiesza zwierzęta w 100 mikrolitrach bufora M nine.Następnie błyskawicznie zamroź zwierzęta i za pomocą schłodzonego tłuczka i wiertła zmiel próbkę na lodzie. Często zatrzymywane w celu sprawdzenia, czy zwierzęta są wystarczająco zmielone. Gdy zwierzęta zostaną całkowicie zmiażdżone, oszacuj objętość ekstraktu z robaków.Następnie dodać równą objętość dwóch x roztworu do lizy robaków i inkubować próbkę na lodzie przez 15 minut. Następnie usuń zanieczyszczenia w schłodzonym cyklu wirowania i przenieś supernatant do czystej probówki z mikro fuge. Po teście Bradforda rozcieńczyć próbkę do trzech do 3,5 miligrama białka na mililitr.Następnie dodaj świeżo przygotowany schłodzony roztwór trypsyny kamuflażowej w proporcji jeden do 1200. W tym momencie ustaw próbkę do inkubacji przez godzinę. Podczas inkubacji okresowo pobieraj 20 mikrolitrów podwielokrotności i natychmiast mieszaj je z buforem SDS, a następnie przez pięć minut w temperaturze 96 stopni Celsjusza.Uruchom próbki i przeprowadź analizę krwi zachodniej, aby określić względną stabilność białka. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie dodawać koktajlu inhibitorów proteazy do próbki trawiennej, a zamiast tego szybko i przetrzymujemy próbki na lodzie. Mutacja E 781 K ts w mięśniu opiekuńczym na 45 silnie wpływa na fałdowanie i składanie miozyny, a tym samym wpływa na ruchliwość zwierząt.Kiedy te mutanty były hodowane w temperaturach powyżej 20 stopni Celsjusza, były całkowicie sparaliżowane, ale nie w temperaturze 15 stopni Celsjusza. Kiedy zwierzęta typu dzikiego hodowane w temperaturze 25 stopni Celsjusza zostały poddane długotrwałemu szokowi cieplnemu, większość z nich przeżyła. Podczas gdy tylko 30% przeżyło, jeśli podniesiono temperaturę od 15 do 20 stopni Celsjusza, aby monitorować skuteczne modyfikatory reakcji na szok cieplny, warunki stresu kontrolnego zostały podwyższone do 70% wskaźnika przeżycia dla zwierząt typu dzikiego.Zwierzęta były wystawione na szok cieplny o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. W pierwszym dniu dorosłości przeżywalność oceniano za pomocą testu wychwytu pomarańczy cyt. Martwe zwierzęta są oznaczone białymi strzałkami, a żywe zwierzęta żółtymi strzałkami.Lokalizacja kilku metastabilnych białek została zwizualizowana przy użyciu specyficznych przeciwciał. Na przykład paraminty są zlokalizowane w zespołach polikrystalicznych zamiast w sarkomerze mięśniowym w restrykcyjnych warunkach. Podobnie, miozyna TS tworzy zdezorganizowane włókna zamiast wysoce uporządkowanych struktur nitkowatych w restrykcyjnej temperaturze.Zwierzęta wykazujące ekspresję różnych zmutowanych białek TS ulegających koekspresji z myo three. GFP wykazał szybkie pogorszenie organizacji włókien mio, co wykryto poprzez monitorowanie GFP, zmiany w potwierdzeniu miozyny mogą odzwierciedlać zmiany w zdolności fałdowania komórek mięśniowych. Wzorzec fragmentacji proteolitycznej łańcucha ciężkiego miozyny, współwyrażany z UNC 45 Ts, wykazuje wyraźne cechy w porównaniu z profilem trawienia miozyny od zwierząt typu dzikiego, co potwierdza twierdzenie, że UNC 45 wpływa na fałdowanie miozyny.Utrata funkcji. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji proteostazy w elegancji morskiej, może być również stosowana w innych systemach, takich jak różne organizmy modelowe.

using-caenorhabditis-elegans-as-model-system-to-study-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Vibrio cholerae: organizm modelowy do badania patogenezy bakteryjnej – wywiad

Poznaj metody badania homeostazy białek w Caenorhabditis elegans na poziomie organizmu, komórek i białek. Techniki obejmują testy behawioralne, mikroskopię immunofluorescencyjną oraz analizę Western blot.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Przeglądaj więcej filmów