Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Ogólnym celem poniższych eksperymentów na genetycznie podatnym metazoanie elegancji CENO R jest monitorowanie nieprawidłowego fałdowania białek na trzech poziomach: organizmu, komórek i białek. Fenotypy behawioralne, takie jak ruchliwość lub odporność termiczna, funkcjonują jako odczyty zmian w homeostazie białek na poziomie organizmu, wrażliwych na temperaturę lub występujących naturalnie. Białka metastabilne są wykorzystywane do śledzenia lokalizacji mis białek, co może być związane z nieprawidłowym fałdowaniem białek.

Test częściowego trawienia ex vivo monitoruje stabilność białka bezpośrednio. Wyniki mogą wykazać zmiany zdolności proteostazy w różnych temperaturach uprawy w oparciu o test odporności termicznej, mikroskopię immunofluorescencyjną i zachodnią analizę krwi. Procedury te zostaną zademonstrowane przez doktorantów w moim laboratorium.

Test behawioralny zostanie zademonstrowany przez ish ido, a Shai zademonstruje barwienie immunologiczne i ANA flunking, a sheron wykaże częściowe trawienie. Temu protokołowi pomiaru tolerancji temperatury towarzyszą etapy przygotowawcze do synchronizacji zwierząt i test ruchu. Oba są opisane w protokole tekstowym, zaczynają się od zebrania replik zawierających co najmniej 20 zsynchronizowanych zwierząt.

W 24 dobrze rozegranych studniach zawierających 450 mikrolitrów bufora szoku cieplnego. Uzupełnij każdą studzienkę dziewięcioma mikrolitrami cytoksyny. Teraz przenieś talerz do podgrzewanej kąpieli.

Szok cieplny, temperatura i czas trwania silnie zależą od warunków wzrostu. W szczególności temperatura uprawy wpływa na przeżywalność zwierzęcia poprzez monitorowanie jego pobierania przez matrycę. Używając fluorescencyjnego stereoskopu z filtrem TXR, zwierzęta, które biorą do ręki matrycę, są martwe.

Główną zaletą tej techniki istniejących metod, takich jak kine, tolerancja przez ręczną punktację, jest wykorzystanie wizualnego odczytu śmiertelności zwierząt, co sprawia, że ten esej jest znacznie szybszy i bardziej powtarzalny. Na wymaganym etapie przenieść co najmniej 30 zwierząt do probówki mikrowirówki zawierającej bufor M nine. Umyj zwierzęta kilka razy za pomocą M nine, wykonując krótkie etapy wirowania z małą prędkością, a Resus zawiesza je w M nine.

Następnie umieść probówki na lodzie na kilka minut, aby ostygły. Po schłodzeniu usuń nadmiar płynu i inkubuj probówki. W 500 mikrolitrach lodowatego zimnego 4% aldehydu PARAFORM.

Czas inkubacji musi być skalibrowany dla każdego badanego białka i powinien wynosić około pięciu do 30 minut w temperaturze pokojowej. Teraz umyj utrwalone zwierzęta trzykrotnie za pomocą PBS tween o pH 7,2 przez odwirowanie. Wirowanie odbywa się zawsze z prędkością 3000 obr./min przez jedną lub dwie minuty, chyba że określono inaczej.

W kapturze usuń większość supernatantu i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze roztworu merkaptoetanolu wiązkowego. Następnie wysiaduj zwierzęta w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, a następnego dnia delikatnie kołysząc w kapturze. Umyj zwierzęta trzykrotnie PBST przez odwirowanie i Resus.

Zakończ mycie od 50 do 100 mikrolitrów PBST i usuń większość tego PBST po kolejnym odwirowaniu. Następnie dodaj 100 do 150 mikrolitrów roztworu kolagenazy i inkubuj zwierzęta w temperaturze 37 stopni Celsjusza z silnym mieszaniem. Użyj miksera termicznego lub inkubatora z wytrząsaniem.

Po pięciu minutach zacznij wykonywać okresowe kontrole pod mikroskopem stereoskopowym. Gdy jedna piąta zwierząt zostanie złamana, przerwij reakcję, umieszczając rurkę na lodzie. Ten krok jest bardzo wrażliwy.

Czas trwania leczenia zależy od warunków utrwalenia i może się znacznie różnić w zależności od szczepu. Długotrwała inkubacja może spowodować całkowitą degradację zwierząt. Warunki muszą być skalibrowane przed każdą partią enzymu, a degradacja powinna być dokładnie monitorowana.

Następnie umyj zwierzęta dwukrotnie w PBST. Zebrać zwierzęta przez odwirowanie i usunąć większość PBST. Następnie dodać jeden mililitr roztworu BA, a następnie inkubować z delikatnym kołysaniem przez godzinę w temperaturze pokojowej, zebrać zwierzęta przez odwirowanie i ponownie zawiesić je w 200 mikrolitrach b b, A. Teraz dodaj przeciwciało pierwszorzędowe i rozpocznij inkubację przez noc z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej.

Parametry te należy skalibrować. Następnie umyj zwierzęta przez odwirowanie. Zawieś je ponownie w mililitrze b, A i inkubuj je z delikatnym mieszaniem przez 15 minut do godziny W temperaturze pokojowej.

W tym momencie można dodać opcjonalny dodatek barwnika fluorescencyjnego. Następnie powtórzyć płukanie buforem BA jeszcze trzy razy i zakończyć płukanie za pomocą Resus, zawieszając w 100 mikrolitrach BA z odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym w rozcieńczeniu jeden do 100. Próbki należy inkubować, kołysząc przez kilka godzin w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem w celu usunięcia materiału wtórnego.

Wykonaj trzy prania za pomocą a, b, a. Następnie zamontuj zwierzęta na szkiełkach za pomocą najpierw Resus, zawieszając je w 10 mikrolitrach a, b, a, a następnie za pomocą pipety o szerokim otworze przenieś jeden lub dwa mikrolitry próbki do każdego szkiełka, dodaj równą objętość podłoża montażowego i przykryj szkiełko. Delikatnie uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci.

Szkiełka mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dłuższy czas. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tym protokole będą miały problemy, ponieważ protokół jest długi i zawiera wiele kroków, które mogą wpłynąć na jego skuteczność, utrudniając rozwiązywanie problemów. Zacznij od zebrania zwierząt z około 1560 milimetrowych płytek do jednego lub dwóch mililitrów buforu M nine.

Zwierzęta nie powinny być przeludnione. Umyj zwierzęta kilka razy buforem M nine, odwirowując i zawieszając zwierzęta. Po ostatnim wirowaniu resus zawiesza zwierzęta w 100 mikrolitrach bufora M nine.

Następnie błyskawicznie zamroź zwierzęta i za pomocą schłodzonego tłuczka i wiertła zmiel próbkę na lodzie. Często zatrzymywane w celu sprawdzenia, czy zwierzęta są wystarczająco zmielone. Gdy zwierzęta zostaną całkowicie zmiażdżone, oszacuj objętość ekstraktu z robaków.

Następnie dodać równą objętość dwóch x roztworu do lizy robaków i inkubować próbkę na lodzie przez 15 minut. Następnie usuń zanieczyszczenia w schłodzonym cyklu wirowania i przenieś supernatant do czystej probówki z mikro fuge. Po teście Bradforda rozcieńczyć próbkę do trzech do 3,5 miligrama białka na mililitr.

Następnie dodaj świeżo przygotowany schłodzony roztwór trypsyny kamuflażowej w proporcji jeden do 1200. W tym momencie ustaw próbkę do inkubacji przez godzinę. Podczas inkubacji okresowo pobieraj 20 mikrolitrów podwielokrotności i natychmiast mieszaj je z buforem SDS, a następnie przez pięć minut w temperaturze 96 stopni Celsjusza.

Uruchom próbki i przeprowadź analizę krwi zachodniej, aby określić względną stabilność białka. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie dodawać koktajlu inhibitorów proteazy do próbki trawiennej, a zamiast tego szybko i przetrzymujemy próbki na lodzie. Mutacja E 781 K ts w mięśniu opiekuńczym na 45 silnie wpływa na fałdowanie i składanie miozyny, a tym samym wpływa na ruchliwość zwierząt.

Kiedy te mutanty były hodowane w temperaturach powyżej 20 stopni Celsjusza, były całkowicie sparaliżowane, ale nie w temperaturze 15 stopni Celsjusza. Kiedy zwierzęta typu dzikiego hodowane w temperaturze 25 stopni Celsjusza zostały poddane długotrwałemu szokowi cieplnemu, większość z nich przeżyła. Podczas gdy tylko 30% przeżyło, jeśli podniesiono temperaturę od 15 do 20 stopni Celsjusza, aby monitorować skuteczne modyfikatory reakcji na szok cieplny, warunki stresu kontrolnego zostały podwyższone do 70% wskaźnika przeżycia dla zwierząt typu dzikiego.

Zwierzęta były wystawione na szok cieplny o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. W pierwszym dniu dorosłości przeżywalność oceniano za pomocą testu wychwytu pomarańczy cyt. Martwe zwierzęta są oznaczone białymi strzałkami, a żywe zwierzęta żółtymi strzałkami.

Lokalizacja kilku metastabilnych białek została zwizualizowana przy użyciu specyficznych przeciwciał. Na przykład paraminty są zlokalizowane w zespołach polikrystalicznych zamiast w sarkomerze mięśniowym w restrykcyjnych warunkach. Podobnie, miozyna TS tworzy zdezorganizowane włókna zamiast wysoce uporządkowanych struktur nitkowatych w restrykcyjnej temperaturze.

Zwierzęta wykazujące ekspresję różnych zmutowanych białek TS ulegających koekspresji z myo three. GFP wykazał szybkie pogorszenie organizacji włókien mio, co wykryto poprzez monitorowanie GFP, zmiany w potwierdzeniu miozyny mogą odzwierciedlać zmiany w zdolności fałdowania komórek mięśniowych. Wzorzec fragmentacji proteolitycznej łańcucha ciężkiego miozyny, współwyrażany z UNC 45 Ts, wykazuje wyraźne cechy w porównaniu z profilem trawienia miozyny od zwierząt typu dzikiego, co potwierdza twierdzenie, że UNC 45 wpływa na fałdowanie miozyny.

Utrata funkcji. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji proteostazy w elegancji morskiej, może być również stosowana w innych systemach, takich jak różne organizmy modelowe.