Testy polimeryzacji FtsZ: proste protokoły i rozważania

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie odpowiednich warunków do badania FTSZ, polimeryzacji i aktywności przy użyciu prostych testów i sprzętu. Osiąga się to poprzez wykonywanie testów sedymentacji polimerów FDSC w różnych warunkach, aby znaleźć odpowiednie warunki, w których FDSZ polimeryzuje. W drugim kroku przeprowadzamy testy rozpraszania światła, aby zbadać polimeryzację FDSZ w czasie rzeczywistym.

Następnie przeprowadzamy testy hydrolizy GTP w celu określenia związanej z polimeryzacją aktywności g gtpa FT SC. Uzyskano wyniki, które pokazują, jakie warunki są najlepiej odpowiednie do badania FTSC określonego źródła bakterii w oparciu o sedymentację, rozpraszanie światła i hydrolizę GTP. Pokazana tutaj technika jest łatwa do wykonania w każdym laboratorium i zapewni szybkie wyobrażenie o możliwościach polimeryzacji określonych FT a z. Okazuje się, że wybór odpowiedniego buforu jest szczególnie ważny podczas pracy z FTAZ w obecności innych białek demonstrujących tę technikę będzie EVA crawl, doktorantem z mojego laboratorium.

Na początek dodaj pięć mikrolitrów 100-milimolowego chlorku magnezu i 12 mikromolowych białek bakteryjnych, FDSC i / lub SEP F do jednego z wybranych polimeryzacyjnych, które mają różne wartości pH i skład, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie umieść probówki w inkubatorze z funkcją wytrząsania i inkubuj próbki przez dwie minuty w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 300 obr./min. Po dokładnym wymieszaniu probówek rozpocznij polimeryzację, dodając jeden mikrolitr mieszaniny GTP lub GDP ze 100-milimolowego roztworu podstawowego, tak aby końcowe stężenie wynosiło dwa milimolowe.

Następnie umieścić próbki z powrotem w inkubatorze z wytrząsaniem na dodatkowe 20 minut. Następnie wiruj rurki w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy 20 000 obr./min za pomocą wirnika TLA 55 lub równoważnego 24 600 G, jeśli używasz czegoś innego. Po zakończeniu wirówki przenieś supernatanty do czystych probówek i zachowaj granulki na później.

Pobrać 20 mikrolitrów przeniesionych supernatantów i wymieszać je w osobnej probówce z 20 mikrolitrami dwukrotnie stężonego buforu do próbek. Zabezpiecz nakrętki i gotuj próbki przez 10 minut w temperaturze 98 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 50 mikrolitrów dwukrotnie stężonego buforu do każdej frakcji granulek, która została wcześniej odłożona na bok i zawiesić polimery, gotując próbki przez 10 minut w temperaturze 98 stopni Celsjusza.

Gdy próbki zakończą gotowanie, dodaj dodatkowe 50 mikrolitrów wody demineralizowanej do probówek zawierających granulki. Następnie załaduj 10 mikrolitrów zarówno supernatantów, jak i granulek z każdej próbki obok siebie na 10% żel stronicowy SDS i uruchom żel pod napięciem 150 woltów. Gdy żel jest gotowy, usuń żel i poplam go błękitem brylantowym kumasi G two 50.

Następnie zobrazuj żel i oznacz ilościowo białko za pomocą cytometrii, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Najpierw włącz spektrometr fluorescencyjny i pozwól lampie rozgrzać się przez kilka minut, aby uniknąć wahań temperatury. Włącz również łaźnię z wodą obiegową i ustaw temperaturę wody na 30 stopni Celsjusza, aby utrzymać komorę vete w stałej temperaturze.

W miarę nagrzewania się systemu zdefiniuj parametry pracy spektrometru. Ustaw wysokie napięcie detektora na 300 woltów, a długości fal emisji i wzbudzenia na 350 nanometrów przy szerokości szczeliny czterech nanometrów. Następnie zaprogramuj protokół akwizycji danych, wybierając akwizycję opartą na czasie trwania 3 600 sekund.

Ostrożnie wyczyść 200-mikrolitrowy fluorescencyjny vete o długości jednego centymetra, zanurzając go w roztworze czyszczącym w łaźni wodnej przez pięć minut. Następnie przygotuj 294 mikrolitry mieszanki wzorcowej dla każdego z dziewięciu polimeryzacyjnych opisanych w dołączonym protokole tekstowym, każdy z 10 milimolowym chlorkiem magnezu i 12 mikromolowymi FDSE jako końcowe stężenia obliczone dla 300 mikrolitrów. Następnie krótko zwirować mieszaniny, przenieść 196 mikrolitrów pierwszego buforu polimeryzacyjnego do weterynarza.

Umieść go w spektrometrze i inkubuj przez dwie minuty, aby doprowadzić temperaturę próbki do 30 stopni Celsjusza. Po dwóch minutach rozpocznij akwizycję danych i odczekaj 90 sekund, aby sprawdzić, czy sygnał jest stabilny. Następnie dodaj cztery mikrolitry 100 milimolowych GTP lub GDP.

Wymieszaj próbkę i kontynuuj akwizycję danych przez pełną godzinę. Powtórz te kroki dla każdego wymienionego bufora. Przygotuj 1,5 mililitra dwumilimolowego GTP w wybranym buforze polimeryzacyjnym.

Przygotować również rozcieńczenie wzorca fosforanowego w zakresie od 0 do 40 mikromoli w tym samym buforze. Następnie przygotuj odczynnik roboczy w kolorze zielonym malachitowym zgodnie z opisem w zestawie testów biologicznych. Następnie przygotuj cztery mieszanki wzorcowe o całkowitej objętości każdy, z których każda wynosi 360 mikrolitrów, mieszanka główna zawiera FDSZ pochodzącą z subtilis B, a mieszanka główna druga zawiera FDSE pochodzącą z e coli.

Mieszanki główne trzy i cztery są używane jako kontrole i zawierają EDTA zamiast chlorku magnezu. Następnie odpipetować 20 mikrolitrów porcji mieszanin wzorcowych i fosforanów. W A-Q-P-C-R 96 dołków tak, aby było 16 dołków dla każdej mieszanki głównej i wzorców fosforanowych ułożonych tak, jak pokazano tutaj.

Odpipetować 180 mikrolitrów dwumilimolowego zapasu GTP do ostatniego pasa płytki. Następnie umieść płytkę w maszynie do PCR. Uruchom program z pojedynczym cyklem ustawionym na 30 stopni Celsjusza przez 40 minut.

W drugiej 96-dołkowej pipecie płytkowej wlej 20 mikrolitrów odczynnika roboczego malachitowej zieleni do studzienek, od jednego do H 10. Następnie przy 60 mikrolitrach buforu polimeryzacyjnego z eksperymentu twierdzi od A od jednego do H ośmiu, a następnie przy 20 mikrolitrach dwumilimolowego roztworu GTP do studzienek na każdym torze płytki. Jeden w określonych odstępach czasu, jak pokazano tutaj, aby zbadać reakcję w różnych punktach czasowych.

Przecierać mieszaniny rurą w górę i w dół, aby wymieszać je po 30 minutach, zaczynając od pierwszego pasa na pierwszej płytce pierwszej, przenieść 20 mikrolitrów z pierwszego toru pierwszej płytki na pierwszy tor drugiej płytki i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Jest to punkt wyjścia do rozwoju zielonego koloru malachitu dla 30-minutowej reakcji po 30 i pół minutach, przenieś 20 mikrolitrów z drugiego pasa płytki pierwszej na drugi tor drugiej płytki i wymieszaj. Jest to punkt wyjścia do rozwoju zielonego koloru malachitu dla 20-minutowej reakcji.

Powtórz te kroki z pozostałymi pasami od trzeciego do siódmego w 32. odstępach po 33 i pół minuty przy 20 mikrolitrach GTP do ósmego pasa na pierwszej płytce i wymieszaj. Następnie przenieś 20 mikrolitrów na ósmą linię na drugiej płytce i wymieszaj. Reprezentuje to reakcję zerowej minuty i jest punktem wyjścia dla rozwoju zielonego koloru malachitu.

Po 34 minutach dodać 80 mikrolitrów z toru dziewiątego płytki pierwszej zawierającej wzorzec fosforanowy do toru dziewiątego płytki drugiej i wymieszać po 34 i pół minutach, przenieść 80 mikrolitrów z drugiego wzorca fosforanowego na tor 10 pierwszej płytki do toru 10 na talerzu drugim i wymieszać. Następnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z próbek i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez kolejne 25 i pół minuty. Po inkubacji.

Umieścić płytkę w 96-dołkowym czytniku płytek, zaczynając od 60 minut od rozpoczęcia eksperymentu. Mierz płytkę przy 630 nanometrach co 30 sekund przez pięć minut, tak aby uzyskać 10 punktów czasowych. Pierwszy pomiar płyty będzie odpowiadał pierwszemu pasowi, drugi drugiemu pasowi drugiemu, a więc każdy pas miał dokładnie tyle samo czasu na rozwinięcie się malachitowego zielonego koloru.

Następnie oblicz wolny fosforan w każdej próbce, korzystając z krzywej kalibracyjnej wzorca fosforanowego i wykreśl dane jako uwalnianie fosforanów w czasie. Następnie oblicz aktywność hydrolizy F-D-S-Z-G-T-P z liniowego zakresu krzywej. Pokazano tutaj procentową zawartość SEP F i FDSZ w granulkach próbek.

FDSZ został odzyskany w osadzie powyżej poziomów tła tylko wtedy, gdy zarówno SEP F, jak i GTP były również obecne w próbce. Dokładna stechiometria SEPPE i FDSZ w tych kanalikach nie jest znana, ale wyniki te sugerują, że występuje więcej seppe niż FDSZ. Pokazano tutaj rozpraszanie światła FDSZ z B subtilis i E coli, złożone w obecności dwóch milimolowych GTP w 50-milimolowym buforze chlorku potasu.

F-D-S-E-B-S daje od 20 do 40 razy większy sygnał rozpraszania światła niż FDSC EC, w zależności od pH bufora. Co ciekawe, zwiększenie stężenia chlorku potasu w buforze nie wpłynęło znacząco na sygnał rozpraszania światła F-D-S-Z-E-C, ale sygnał F-T-S-Z-B-S zmniejszył się około 80-krotnie przy pH 7,5, 30-krotnie przy pH 6,8 i 45-krotnie przy pH 6,5 w 300 milimolowym chlorku potasu w porównaniu z z 50-milimolowym chlorkiem potasu. Aktywność hydrolizy GTP FDSZ mierzono w różnych warunkach buforowych przy użyciu testu kolorymetrycznego dla wolnego fosforanu.

Stwierdzono, że aktywność GTPS FT SZ wzrasta wraz ze wzrostem stężenia chlorku potasu w każdym z różnych warunków pH. Przy 50 milimolach chlorku potasu aktywność gtpa została zmniejszona z powodu wiązania włókien F-D-S-Z-B-S przy 50 milimolach. Chlorek potasu FDSZ EEC miał od trzech do sześciu razy wyższą aktywność GTPS niż F-D-S-Z-B-S ze względu na szybszy demontaż polimerów FDSC EEC.

Wreszcie, różnica w aktywności hydrolizy GTP między F-D-S-Z-B-S i F-D-S-Z-E-C została zmniejszona przy 300 milimolowym chlorku potasu, prawdopodobnie z powodu zmniejszonego wiązania włókien F-D-S-Z-B-S. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne badania metali, takie jak elektromikroskopia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące struktury polimerów fts w próbce.