Wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar przepływu cytoplazmy podczas gojenia się ran w pojedynczej komórce. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie żywych komórek stentu lub SEIU w celu wykorzystania jako systemu modelowego do zranień komórkowych. Drugim krokiem jest przygotowanie szklanych narzędzi do cięcia komórek.

Następnie komórki stentu sariusa są rozcinane na dostosowanej konfiguracji mikroskopu, która pozwala na jednoczesną operację w małym powiększeniu i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie analizy obliczeniowej przepływu cytoplazmatycznego przy użyciu oprogramowania do symetrii prędkości obrazu cząstek. Ostatecznie obrazowanie cytoplazmy w wysokiej rozdzielczości służy do pokazania aktywnej odpowiedzi komórek podczas gojenia się ran.

Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące komórkowego gojenia się ran, takie jak to, czy cytoplazma staje się żelowa wokół obszaru cięcia, aby zapobiec wyciekowi do otaczającego środowiska. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania i cięcia narzędzi do obsługi komórek są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają zręczności manualnej. Aby rozpocząć pozyskiwanie stentu lub komórek Syriusza z naturalnego mostu, zgodnie z opisem w kamieniu nazębnym, lub od komercyjnego dostawcy, dodaj 300 mililitrów zmodyfikowanego stentu lub pożywki dostosowanej do receptur przez kamień nazębny i odstrasz, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.

Utrzymuj kultury, uprawiając je w ciemności w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dorastaj w kulturach chlamydomonas Rhine Hardy alg w pożywce fosforanowej tris octanowej. Stosując standardowe metody hodowli przed karmieniem, umyj komórki chlamydomony, delikatnie je obracając, usuwając supernatant i zawieszając je w zmodyfikowanym stencie lub pożywce.

W razie potrzeby nakarm 300 mililitrów stentów lub kultur sariusa około 30 milionami komórek chm dwa lub trzy razy w tygodniu. Zbierz stent lub komórki do operacji. Na początek delikatnie porusz kulturę, bulgocząc powietrzem przez końcówkę pipety, aż komórki zaczną się odłączać i swobodnie pływać.

Następnie uchwyć pływające komórki za pomocą jednomililitrowej pipety wyposażonej w końcówkę o szerokim otworze, aby uniknąć ścinania komórek. Po zebraniu pozwól komórkom się uspokoić. Następnie powoli odpipetuj pożywkę znajdującą się nad nimi i dodaj świeży zmodyfikowany stent lub pożywkę.

Przygotuj szklane igły używane do cięcia komórek stentu, trzymając dwa szklane pręty mieszające nad dużą ilością i palnika, aż końce zaczną się topić. Następnie zetknij ze sobą końce dwóch prętów, aż stopione szkło się połączy. Gdy się połączą, wyjmij je z płomienia i pozwól im ostygnąć przez jedną do dwóch sekund.

Następnie powoli rozsuń je, aby zrobić czystą przerwę. Idealnie byłoby w ten sposób wytworzyć igłę o długości około jednego do dwóch centymetrów z cienkim końcem na końcu. Jeśli uzyskana igła nie jest optymalna, wbij końcówkę w szklaną talię i ponownie użyj prętów.

Następnie użyj kwadratowego stempla gumowego pokrytego wazeliną, aby przygotować kwadratową komorę o ściankach z wazeliny, wciskając ją w szklane szkiełko nakrywkowe. Następnie dodaj 100 mikrolitrów zmodyfikowanego stentu lub pożywki zawierającej 2% metylocelulozy do kwadratu wazeliny. Umieść przygotowane szkiełko nakrywkowe w plastikowym adapterze, a następnie dodaj umyte komórki stentu do szkiełka nakrywkowego.

Na koniec ułóż komórki w metylocelulozie tak, aby były równomiernie rozmieszczone i były dociśnięte wystarczająco blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby były ostre podczas obrazowania. Aby rozpocząć, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu odwróconego. Następnie zdejmij korpus mikroskopu preparacyjnego ze stojaka i określ przybliżoną pozycję, w której będzie musiał zostać umieszczony, aby uwidocznić szkiełko w małym powiększeniu od góry.

Następnie skonstruuj mikroskop dwupoziomowy, dodając kartonowe pudełko z pożądanym odstępem między okularem mikroskopu odwróconego a lunetą sekcyjną. Przyklej pudełko taśmą za pomocą taśmy laboratoryjnej, aby można je było łatwo usunąć Po zakończeniu eksperymentu upewnij się, że próbka będzie w polu view i w ostrości bez konieczności przesuwania lunety sekcyjnej Po przymocowaniu przytrzymaj lunetę sekcyjną do pudełka i przyklej ją do pudełka za pomocą taśmy laboratoryjnej. Następnie ustaw odwrócony mikroskop za pomocą optyki DIC, umieszczając na miejscu obiektyw pneumatyczny o powiększeniu 20 razy.

Upewnij się również, że używasz kondensatora DIC o dużej odległości roboczej, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca do wykonania mikrochirurgii od góry. Następnie ustaw ostrość komórek za pomocą odwróconego mikroskopu, mając wszystko przygotowane i ustawione na ostrości z obu stron. Rozpocznij rejestrowanie obrazów z szybkością dwóch klatek na sekundę za pomocą kamery CCD o wymiarach 12 na pięć.

Następnie przetnij komórkę za pomocą szklanej igły. Uchwyć początkowy wzorzec przepływu cytoplazmatycznego i obserwuj wszystkie etapy procesu zranienia i gojenia się ran. Zakończ akwizycję, gdy komórka wznowi normalny wygląd lub ponownie rozpocznie aktywną ruchliwość.

Aby rozpocząć, pobierz PIV lab, pakiet MATLAB do pomiaru przepływu cytoplazmatycznego przy użyciu symetrii prędkości obrazu cząstek. Następnie załaduj stos obrazów TIFF dla każdej sekwencji wideo do programu symetrii prędkości obrazu cząstek w podręczniku MATLAB. Ręcznie wygeneruj maskę dla każdego stosu obrazów, aby zamaskować obszary nieprzetworzonych danych poza treścią stentu.

Następnie ustaw PIV lab tak, aby używał ustawienia szybkiej transformaty Fouriera i rozmiaru kosza 64 na 64 piksele, co spowoduje koszowanie pikseli w każdej klatce na większe piksele kwadratowe. Następnie uruchom PIV lab, aby obliczyć korelacje krzyżowe między pikselami w każdej klatce a pobliskimi pikselami. W następnej klatce otrzymamy zależny od czasu wektor przepływu wyśrodkowany na każdym pikselu zgięcia, który ma taką samą rozdzielczość czasową jak dane surowe.

Następnie należy obliczyć średnie czasowe wynikowych danych wyjściowych pola wektorowego, aby porównać dane pobrane za pomocą stentu przed cięciem i podczas gojenia się rany. Oblicz również histogramy prędkości przepływu, aby zbadać siłę przepływu i zmianę prędkości w danym pikselu w czasie, aby zbadać wahania przepływu. Podczas sekwencji obrazowania ze stentem lub komórką przeciętą na pół, oblicz całkowity strumień cytoplazmy z powrotem do ciała komórki, mnożąc średnią prędkość przepływu przez pole przekroju poprzecznego zewnątrzkomórkowej podstawy pęcherzykowej cytoplazmy.

Pokazano tutaj obrazowanie na żywo stentu lub komórki, gdy jest ona cięta i przerywana szklaną igłą. Po przecięciu znaczna ilość cytoplazmy została wyciągnięta z głównego korpusu komórki, ale szybko spływa z powrotem do komórki. Po tej procedurze można dodać inhibitory chemiczne w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie składniki cytoszkieletu mogą przyczyniać się do ruchu cytoplazmatycznego podczas gojenia się stentu lub rany.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować narzędzia do cięcia stentu do naszych komórek i jak obrazować przepływ cytoplazmatyczny podczas procesu cięcia i gojenia się ran w pojedynczej komórce olbrzyma.