Name: Wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Odkryj analizę przepływu cytoplazmy podczas gojenia ran w Stentor coeruleus przy użyciu mikroskopii wysokiej rozdzielczości i oprogramowania PIV. Ta metoda pozwala badać mechanizmy regeneracji komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH R01 GM090305 (WFM). Opisana tutaj procedura została opracowana na Kursie Fizjologii w Morskim Laboratorium Biologicznym latem 2012 roku i dziękujemy studentom, instruktorom i kierownikom kursów za wiele pomocnych i stymulujących dyskusji.

1. Hodowla i kolekcja komórkowa
<ol>
	<li>Komórki Stentor coeruleus należy pozyskać albo z naturalnych stawów, jak opisano w Tartar7, albo od komercyjnego dostawcy (patrz Odczynniki).</li>
	<li>Utrzymuj kultury, rosnąc w ciemności w temperaturze 20 ºC w zmodyfikowanym podłożu stentorowym (MSM), które jest dostosowane do receptur opisanych przez Tartar7 i De Terra12 zawierających 0,75 mM Na2CO3, 0,15 mM KHCO3, 0,15 mM NaNO3, 0,15 mM KH2PO4, 0,15 mM MgSO4, 0,5 mM CaCl2, i 1,47 mM NaCl.</li>
	<li>Uzupełnij pożywkę MSM źródłem węgla, dodając do niej żywą zdobycz. Hoduj kultury pożywki Chlamydomonas reinhardtii TAP przy użyciu standardowych metod hodowli13. Przed karmieniem umyj komórki Chlamydomonas w MSM. Nakarm 300 ml kultur Stentor ~ 3 x 107 komórek Chlamydomonas 2-3 razy w tygodniu.</li>
	<li>Zbierz komórki Stentora do operacji za pomocą pipety. Stentor ma tendencję do zakotwiczania się na dnie i bokach naczynia hodowlanego, a więc, aby zebrać komórki, mieszaj kulturę, bulgocząc powietrzem przez końcówkę pipety, aż komórki zaczną się odłączać i swobodnie pływać.</li>
	<li>Chwyć pływające komórki za pomocą pipety wyposażonej w końcówkę o szerokim otworze, aby uniknąć ścinania komórek.</li>
	<li>Umyj zebrane komórki w świeżym MSM.</li>
</ol>
2. Przygotowanie narzędzi do mikrochirurgii
<ol>
	<li>Trzymaj dwa szklane pręty mieszające nad palnikiem Bunsena lub innym płomieniem, aż końce zaczną się topić.</li>
	<li>Zetknij ze sobą końce dwóch prętów, aby stopione szkło się połączyło.</li>
	<li>Po utworzeniu małej kropelki stopionego szkła między dwoma prętami, usuń je z płomienia, pozostaw do ostygnięcia na 1-2 sekundy, a następnie rozsuń je, aby uzyskać czystą przerwę. Idealnie byłoby, gdyby szkło wyciągało się w cienkie sznurki i gładko pękało, gdy szkło ostygnie, w wyniku czego powstanie igła o długości około 1-2 cm z cienkim końcem na końcu (ryc. 2).</li>
	<li>Jeśli uzyskana igła nie jest optymalna, końcówki mogą zostać rozbite na odpady szklane, a pręty mogą być ponownie użyte.</li>
</ol>
3. Montaż komórek do mikrochirurgii i obserwacji (normalna chirurgia)
<ol>
	<li>Przygotuj kwadratową komorę o ściankach wazeliny za pomocą kwadratowego stempla gumowego pokrytego wazeliną i dociśniętego do szklanego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Dodaj MSM zawierający 2% metylocelulozy do kwadratu wazeliny.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe w plastikowym adapterze, który umożliwia umieszczenie szkiełka nakrywkowego na mikroskopie ze standardowym uchwytem do szkiełek podstawowych (Rysunek 3).</li>
	<li>Dodaj umyte komórki z kroku 1.6 do MSM wraz z metylocelulozą, aby utrudnić ruchliwość komórek Stentora, tak aby pozostały na miejscu podczas operacji.</li>
	<li>Ułóż komórki w metylocelulozie tak, aby były równomiernie rozmieszczone i były dociśnięte wystarczająco blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby były ostre podczas obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie gojenia się ran w wysokiej rozdzielczości w żywym stentorze
Aby jednocześnie zobrazować komórkę Stentora w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie wycinając ją chirurgicznie pod małym powiększeniem, zbuduj mikroskop "dwupokładowy" z lunetą sekcyjną przymocowaną do głowicy okularu odwróconej lunety, tak aby była skupiona na górze szkiełka, podczas gdy odwrócona luneta jest skupiona od spodu szkiełka.
<ol>
	<li>Umieść suwak na odwróconej lunecie (użyj Zeiss Axiovert 200M lub Olympus IX80).</li>
	<li>Zdejmij korpus mikroskopu preparacyjnego ze stojaka i określ przybliżoną pozycję nad odwróconym okularem mikroskopu, aby umieścić lunetę sekcyjną, aby umożliwić wizualizację szkiełka w małym powiększeniu.</li>
	<li>Zmodyfikuj kartonowe pudełko tak, aby miało taką samą grubość, jak pożądany odstęp między odwróconą głowicą okularu lunety a lunetą sekcyjną, a następnie przyklej do odwróconego teleskopu za pomocą taśmy laboratoryjnej, którą można łatwo usunąć po zakończeniu eksperymentu. Dostosuj grubość pudełka zgodnie z dokładną konfiguracją głowicy okularu mikroskopu odwróconego oraz wielkością mikroskopu preparacyjnego tak, aby próbka znajdowała się w polu view bez konieczności przesuwania lunety sekcyjnej po jej zamocowaniu.</li>
	<li>Trzymając lunetę sekcyjną przy pudełku, przesuwaj ją, aż szkiełko będzie ostre, a następnie ponownie przyklej do pudełka za pomocą taśmy laboratoryjnej. Ostateczna konfiguracja jest pokazana na rysunku 4.</li>
	<li>Obrazy komórek przez odwróconą lunetę przy użyciu optyki DIC i soczewki obiektywu pneumatycznego 20X. Użyj kondensatora DIC o dużej odległości roboczej, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca do wykonania mikrochirurgii od góry.</li>
	<li>Rejestruj obrazy z szybkością 2 obrazów/s za pomocą kamery CCD o rozdzielczości 512 x 512.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję przed rozpoczęciem cięcia komórek, aby uchwycić początkowy wzorzec przepływu cytoplazmatycznego i obserwować wszystkie etapy procesu zranienia i gojenia się ran.</li>
	<li>Zakończ akwizycję, gdy komórka wznowi normalny wygląd i/lub aktywną ruchliwość, w celu wizualizacji i pomiaru ruchów cytoplazmatycznych w całym procesie regeneracji.</li>
</ol>
5. Analiza przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran
Zmierz przepływ cytoplazmatyczny za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV). Technika ta jest rutynowa w badaniach dynamiki płynów i może generować pola przepływu przy braku indywidualnie śledzonych cząstek w płynie. PIV został wykorzystany do pomiaru przepływów cytoplazmy w oparciu o obrazowanie pęcherzyków subkomórkowych i innych cech widocznych w cytoplazmie za pomocą mikroskopii światła przechodzącego14.
<ol>
	<li>Pobierz PIVLab, pakiet MATLAB dla PIV, ze strony internetowej <a href="http://pivlab.blogspot.com/">http://pivlab.blogspot.com/</a>.</li>
	<li>Załaduj stos obrazów tiff dla każdej sekwencji wideo do programu PIV w programie MATLAB.</li>
	<li>Ręcznie wygeneruj maskę dla każdego stosu obrazów, aby zamaskować obszary nieprzetworzonych danych poza ciałem Stentora.</li>
	<li>Ustaw PIVLab tak, aby używał ustawienia szybkiej transformaty Fouriera i rozmiaru kosza 64 x 64 pikseli, co spowoduje koszowanie pikseli w każdej klatce na większe piksele kwadratowe.</li>
	<li>Uruchom PIVLab, aby obliczyć korelacje krzyżowe między pikselami w każdej klatce a pobliskimi pikselami w następnej klatce, aby uzyskać zależny od czasu wektor przepływu wyśrodkowany na każdym pikselu w binacji, który ma taką samą rozdzielczość czasową jak nasze surowe dane.</li>
	<li>Oblicz średnie czasowe wynikowego pola wektorowego, aby wygenerować linie strumieniowe do porównania danych pobranych za pomocą stentora przed cięciem i podczas gojenia się rany, a także oblicz histogramy prędkości przepływu (w celu zbadania siły przepływu) i zmiany prędkości w danym pikselu w czasie (w celu zbadania wahań przepływu).</li>
	<li>W przypadku sekwencji obrazów z Stentorem rozszczepionym na pół i cytoplazmą widocznie przeciekającą do otaczającego bufora, oblicz całkowity strumień cytoplazmy z powrotem do ciała komórki, mnożąc średnią prędkość przepływu przez pole przekroju poprzecznego podstawy zewnątrzkomórkowego pęcherzyka cytoplazmy.</li>
</ol>

<ol><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 237-264 (2011).</li>
<li>Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-way+traffic+on+the+road+to+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-way traffic on the road to plasma membrane repair.</a> Trends Cell Biol. 18 (11), 552-559 (2008).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li>
<li>Foissner, I., Wastenays, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characean+internodal+cell+as+a+model+system+for+studying+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The characean internodal cell as a model system for studying wound healing.</a> J. Microsc. 247 (1), 10-12 (2012).</li>
<li>Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-induced+assembly+and+closure+of+an+actomyosin+purse+string+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes.</a> Curr. Biol. 9 (11), 579-587 (1999).</li>
<li>Kim, H. G., Klotchkova, T. A., Kang, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+without+a+cell+membrane%3A+regeneration+of+protoplasts+from+disintegrated+cells+of+the+marine+green+alga+Bryopsis+plumosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Life without a cell membrane: regeneration of protoplasts from disintegrated cells of the marine green alga Bryopsis plumosa.</a> J. Cell Sci. 114 (11), 2009-2014 (2001).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTartar%2C+V+%22The+Biology+of+Stentor%22">The Biology of Stentor</a>. , Pergamon Press. 434 (1961).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> Biol. Bull. 2 (6), 311-328 (1901).</li>
<li>Heidemann, S. R., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+regional+approach+to+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a regional approach to cell mechanics.</a> Trends Cell Biol. 14 (4), 160-166 (2004).</li>
<li>Kasza, K. E., Rowat, A. C., Liu, J., Angelini, T. E., Brangwynne, C. P., Koenderinck, G. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+material%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell as a material.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 19 (1), 101-107 (2007).</li>
<li>Mitchison, T. J., Charras, G. T., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+a+poroelastic+cytoplasm+for+the+dynamics+of+animal+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Implications of a poroelastic cytoplasm for the dynamics of animal cell shape.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 19 (3), 215-223 (2008).</li>
<li>De Terra, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Stentor+coeruleus+on+Colpidium+campylum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eukar.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Culture of Stentor coeruleus on Colpidium campylum.</a> J. Eukar. Microbiol. 13 (3), 491-492 (1966).</li>
<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+Sourcebok%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas Sourcebok.</a> 1, (2009).</li>
<li>Vallotton, P., Ponti, A., Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery%2C+visualization%2C+and+analysis+of+actin+and+tubulin+polymer+flow+in+live+cells%3A+a+fluorescent+speckle+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Recovery, visualization, and analysis of actin and tubulin polymer flow in live cells: a fluorescent speckle microscopy study.</a> Biophys. J. 85 (2), 1289-1306 (2003).</li>
<li>Miyake, A., Harumoto, T., Iio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defence+function+of+pigment+granules+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Protistol%22%5BJournal%5D)">Defence function of pigment granules in Stentor coeruleus.</a> Eur. J. Protistol. 37 (1), 7-88 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najważniejszym zastosowaniem tej metody będzie wykorzystanie jej do wyznaczenia szlaków molekularnych regulujących przepływ cytoplazmatyczny podczas gojenia się ran w Stentorze. Dostępna jest szeroka gama inhibitorów chemicznych, które działają na białka motoryczne, a także składniki cytoszkieletu. Inhibitory sygnalizacji wapniowej również byłyby prawdopodobnymi kandydatami. Interesujące byłoby również usunięcie lub zmniejszenie granulek pigmentu (ekstrusomów) zawierających niebieski pigment Stentorin, którego uwalnianie z komórki jest wyzwalane pod wpływem stresu, oraz pytanie, w jaki sposób egzocytotyczne uwalnianie Stentoryny może wpływać na przepływ pobliskiej cytoplazmy. Pigment można usunąć za pomocą prostego zabiegu wybielania15 , który można wykonać tuż przed cięciem. Wydaje się, że nie ma prostego sposobu na przeprowadzenie testu gojenia się ran w sposób równoległy, ponieważ komórki muszą być cięte i obrazowane pojedynczo. W ten sposób przy użyciu jednego mikroskopu możliwe byłoby operowanie i mierzenie komórek z szybkością około 1 na 0,5 godziny, tak że w ciągu jednego dnia pracy powinno być możliwe uzyskanie wystarczającej liczby punktów danych dla pojedynczego związku, aby określić, czy ma on statystycznie istotny wpływ na proces. Chociaż metoda ta nie jest w żadnym sensie wysokoprzepustowa, absolutnie wykonalne będzie przeprowadzenie badań przesiewowych za pomocą wybranego zestawu związków kandydujących specyficznych dla kilku starannie wybranych ścieżek docelowych.
Głównym ograniczeniem obecnego podejścia jest stosunkowo prymitywna metoda montażu mikroskopu piętrowego. Zakładając, że mikroskop odwrócony używany do obrazowania jest instrumentem ogólnego użytku, którego inni pracownicy muszą używać do innych celów, ważną kwestią jest łatwość, z jaką aparat można zdemontować i ponownie złożyć. O ile obecna metoda z wykorzystaniem taśmy laboratoryjnej jest rzeczywiście szybka i łatwa do zdemontowania, o tyle za każdym razem wymaga starannego wyrównania przez użytkownika podczas montażu. Istotną modyfikacją byłoby zatem skonstruowanie niestandardowego wymiennego uchwytu z otworami na głowicę okularu odwróconej lunety i korpus lunety sekcyjnej. Powinno to być łatwe do wyprodukowania przy użyciu nowoczesnej technologii drukarki 3D.
Drugim ograniczeniem tego podejścia jest poleganie na obrazowaniu DIC organelli wewnątrzkomórkowych jako markerów przepływu. Ponieważ tożsamość tych organelli obserwowanych w mikroskopie nie jest obecnie znana, nie jest możliwe poznanie ich wielkości ani potencjalnych interakcji z innymi składnikami komórkowymi. W związku z tym korzystne może być wstrzyknięcie zewnętrznych znaczników, takich jak kulki fluorescencyjne, i wykorzystanie ich do śledzenia przepływu. Wymagałoby to jednak dodatkowego etapu - mikroiniekcji - zanim eksperyment mógłby zostać przeprowadzony, co jeszcze bardziej spowolniłoby test.
Ostatnim kluczowym ograniczeniem jest poleganie na pojedynczej płaszczyźnie obrazu do pozyskiwania danych. Podstawowe znaczenie tego testu polega na tym, że wykracza on poza zwykłe pytanie, czy rana się goi, czy nie, i pozwala na uzyskanie szczegółowej analizy wzorca przepływu. W związku z tym niezwykle ważne będzie rozszerzenie obrazowania o obrazowanie trójwymiarowe. Obecna metoda obrazuje pojedynczą płaszczyznę ogniskową, a zatem po przeprowadzeniu analizy PIV wynikiem jest przekrój przez pełne trójwymiarowe pole przepływu. Jest to pouczające, ale niekompletne. Poprzez pozyskiwanie obrazów 3D na każdym kroku czasowym, powinno być możliwe uzyskanie w pełni trójwymiarowego pola przepływu. Będzie to szczególnie ważne dla dokładnej obserwacji, jak cytoplazma porusza się w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca rany.

Regeneracja i gojenie się ran są ważnymi procesami biologicznymi, których mechanizmy pozostają obszarami aktywnych badań. Rzeczywiście, zdolność do leczenia ran i regeneracji uszkodzonych części jest jedną z cech, która odróżnia żywe istoty od obiektów nieożywionych. Zwykle uważa się, że regeneracja odbywa się za pośrednictwem różnicowania komórek macierzystych w różne typy komórek potrzebnych do odbudowy uszkodzonej lub odciętej części zwierzęcia, podczas gdy gojenie się ran jest postrzegane w kategoriach nowych komórek atakujących ranę w celu odbudowy nienaruszonego nabłonka. Tak więc oba procesy wydają się być zapośredniczone przez kolektywy pojedynczych komórek, a zatem wydają się być kwintesencją procesów wielokomórkowych. Jest zatem potencjalnie zaskakujące, że pojedyncze komórki są w niektórych przypadkach zdolne do naprawy ran i regeneracji utraconych składników1. Gojenie się ran w pojedynczych komórkach może obejmować wiele ścieżek, w tym skurcz sznurka torebki aktynowo-miozynowej wokół rany i łatanie błony przez szybkie połączenie pęcherzyków egzocytotycznych1-3. Chociaż wiele typów komórek jest zdolnych do pewnego stopnia gojenia się ran4-6, być może najbardziej dramatycznym przykładem jest gigantyczny orzęsek Stentor coeruelus7, pokazany na rycinie 1. Poszczególne komórki Stentora mają długość 1 mm i są pokryte rzędami rzęsek. Komórki stentorowe mają kształt stożka z aparatem ustnym, składającym się z tysięcy rzęsek na jednym końcu i wąskiej struktury mocnej na drugim końcu. Stentor był klasycznym organizmem modelowym do badania regeneracji, ponieważ jeśli jakakolwiek część komórki została odcięta, mogła sięzregenerować7. Na przykład, w klasycznej serii eksperymentów, Thomas Hunt Morgan8 wykazał, że komórka Stentora może zostać przecięta na pół, a każda połówka zregeneruje komórkę o normalnych proporcjach wciągu kilku godzin. Szlaki molekularne odpowiedzialne za regenerację w Stetorze pozostają całkowicie nieznane.
Zdolność komórek Stentora do pełnienia funkcji modelu regeneracji zależy od niesamowitej zdolności tych komórek do samoleczenia po przecięciu. Dlaczego cytoplazma komórki Stentor nie wycieka, gdy komórka jest cięta? Gojenie się ran nie jest spowodowane natychmiastowym skurczem kory komórkowej, ponieważ możliwe jest pobranie dwóch komórek Stentora, przecięcie ich, a następnie połączenie dwóch przeciętych komórek w różnych konfiguracjach7. Podczas takich eksperymentów ze szczepieniem cytoplazma dwóch komórek musi pozostać odsłonięta, ponieważ łączy się, gdy komórki są do siebie dociskane. W jakiś sposób cytoplazma jest wystarczająco wystawiona na otaczające media, aby umożliwić szczepienie, ale mimo to nie wypływa z komórki. Czy cytoplazma Stentora jest na tyle elastyczna, że po prostu nie może wypłynąć nawet wtedy, gdy w błonie plazmatycznej zostanie zrobiona duża? Czy komórki zwiększają lepkość cytoplazmy lokalnie wokół rany, aby zapobiec wypływaniu cytoplazmy? Cytoplazma jest wysoce złożonym materiałem aktywnym9-11, a odpowiedź na gojenie się ran Stentor stanowi wyjątkową okazję do badania przepływów cytoplazmatycznych i mechaniki podczas gojenia się ran jednokomórkowych. Jednak zastosowanie metod chirurgicznych w celu wywołania zranienia u Stentora stanowi wyzwanie techniczne. Aby wyciąć komórkę o długości 1 mm za pomocą szklanych igieł, co jest konwencjonalnym paradygmatem chirurgicznym, konieczne jest działanie w małym powiększeniu przy dużej odległości roboczej. W tych warunkach obrazowania nie jest możliwe śledzenie przepływu cytoplazmy, a jedyne, co można określić, to to, czy cytoplazma pozostaje wewnątrz komórki, czy nie. Prawdziwym pytaniem, które chcielibyśmy zadać, jest to, jak ruch i lepkość cytoplazmy mogą się zmieniać podczas cięcia i gojenia. Wymaga to obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Tutaj przedstawiamy adaptację protokołu Tatara do cięcia Stentor7, która pozwala na wykonanie cięcia pod optyką o mniejszym powiększeniu, aby zobaczyć całą komórkę, jednocześnie obserwując przepływ cytoplazmy w wysokiej rozdzielczości, co pozwala na wykorzystanie tego systemu jako platformy do badania mechanizmów gojenia się ran jednokomórkowych.

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus żywa kultura</td><td>kultury Carolina Biological</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza, 1,500 cP</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SPRZĘT:</td></tr> <tr><td>Nazwa materiału</td> Numer <td>katalogowy</td><td></td><td>firmy</td></tr><tr><td>Mieszadło z miękkiego szkła 5 cali długości</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-380A</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli bakterii 4,5 w 250 ml&nbsp; szkło</td><td>Carolina Biological</td><td>741004</td><td></td></tr><tr><td>IX81 mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M mikroskop odwrócony</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 512 x 512 EMCCD</td><td>Fotometria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 20X obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Chociaż gojenie ran jest często omawiane na poziomie całych tkanek, w wielu przypadkach pojedyncze komórki są w stanie leczyć rany w sobie, naprawiając uszkodzoną błonę komórkową zanim zawartość komórkowa wycieknie. Gigantyczny jednokomórkowy organizm Stentor coeruleus, w którym komórki mogą mieć wielkość większą niż jeden milimetr, był klasycznym organizmem modelowym do badania gojenia się ran w pojedynczych komórkach. Komórki stentorowe można przeciąć na pół bez utraty żywotności, a nawet można je ciąć i szczepić razem. Ale ta wysoka tolerancja na cięcie rodzi pytanie, dlaczego cytoplazma nie wypływa po prostu z rozmiaru cięcia. W tym miejscu przedstawiamy metodę cięcia komórek Stentor przy jednoczesnym obrazowaniu ruchu cytoplazmy w pobliżu cięcia w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Kluczem do naszej metody jest użycie konfiguracji mikroskopu "dwupoziomowego", w której operacja jest wykonywana pod mikroskopem preparacyjnym skoncentrowanym na komorze, która jest jednocześnie oglądana od dołu w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopu odwróconego z soczewką o wysokim NA. Taka konfiguracja pozwala na wysoki poziom kontroli nad procedurą chirurgiczną, jednocześnie umożliwiając śledzenie cytoplazmy w wysokiej rozdzielczości.

Stosując opisane powyżej protokoły, stwierdzono, że cytoplazma Stentora jest niezwykle dynamiczna, zarówno przed, jak i po przecięciu. Wideo 1 przedstawia intensywny przepływ cytoplazmy występujący w nieprzeciętych komórkach. Mimo naszych pierwotnych oczekiwań, że zdolność Stentora do przetrwania przecięcia będzie wiązać się ze sztywnieniem lub żelowaniem cytoplazmy, w rzeczywistości, gdy komórki Stentora zostaną przecięte z siłą wystarczającą do wypłynięcia cytoplazmy poza komórkę, pozostaje ona wysoce dynamiczna i zdoła wpłynąć z powrotem do wnętrza komórki w sposób bardzo ukierunkowany (Wideo 2).
Oprócz wykazania wcześniej nieprzewidzianego stopnia ruchu cytoplazmatycznego podczas gojenia ran, wysoka rozdzielczość obrazowania w tym teście może zostać wykorzystana do ilościowego oznaczenia prędkości przepływu za pomocą welocymetrii obrazowej cząstek (PIV). Zdolność do przeprowadzania takich pomiarów pozwoli na rygorystyczne przetestowanie wpływu inhibitorów chemicznych.
<img alt="Mikroskopowy obraz fitoplanktonu przedstawiający zieloną strukturę komórkową, badania biologii morskiej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Morfologia żywej komórki Stentor. Obraz w ciemnym polu żywej komórki Stentor, która została karmiona Chlamydomonas zgodnie z opisem w Procedurze 1.3; pokarm widoczny jest jako zielony materiał wewnątrz wakuol pokarmowych. Aparat gębowy, przez który komórka pobiera pokarm, jest widoczny jako wieniec rzęsek w górnej części obrazu.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Mikroskopia końcówki mikropipety; precyzyjna mikrofabrykacja; pasek skali 500μm; badania optyki." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przygotowanie szklanej igły do zabiegu chirurgicznego. (A) Igła jest wyciągana z końca litego pręta szklanego. (B) Widok przy dużym powiększeniu końcówki igły, wskazujący długość i ostrość niezbędną do wykonania zabiegu.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Uchwyt do szkiełek przedmiotowych dla wzbudzenia optycznego w eksperymentach spektroskopowych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Dedykowany uchwyt do szkiełek nakrywkowych do mikrochirurgii. Aby zapewnić otwarty dostęp do operacji przy jednoczesnym zachowaniu optymalnych warunków obrazowania, komórki mocuje się na szkiełku nakrywkowym zamiast na grubym szkiełku przedmiotowym. Aby szkiełko nakrywkowe pasowało do stolika mikroskopu, można wykonać plastikowy uchwyt za pomocą drukarki 3D. Uchwyt ma takie same wymiary jak standardowe szkiełko przedmiotowe, natomiast wgłębienie w środku odpowiada wymiarom szkiełka nakrywkowego. Otwór w jednym z rogów umożliwia łatwe wyjęcie szkiełka nakrywkowego z uchwytu.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Układ mikroskopu konfokalnego; obrazowanie fluorescencyjne; wzbudzenie optyczne; sprzęt mikroskopowy." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50848/50848fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50848/50848fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Konfiguracja mikroskopu dwupoziomowego. Głowica mikroskopu stereoskopowego została zamontowana na głowicy z okularami mikroskopu odwróconego. Taśma laboratoryjna umożliwia szybki montaż i demontaż aparatury po zakończeniu eksperymentu.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50848/50848fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
Wideo 1. Przykład przepływu cytoplazmy zaobserwowanego w żywej komórce Stentor. Komórka obrazowana przy użyciu obiektywu 10X z optyką ciemnego pola z częstotliwością 2 klatek/s.
Wideo 2. JaObrazowanie Stentor komórka w momencie cięcia i uszkodzenia za pomocą szklanej igły. Po przecięciu znaczna ilość cytoplazmy zostaje wyciągnięta z głównego ciała komórki, lecz następnie szybko przepływa z powrotem do wnętrza komórki.

Gigantyczny orzęsek Stentor coeruleus to klasyczny system do badania regeneracji i gojenia się ran w pojedynczych komórkach. Poprzez obrazowanie komórek Stentora jednocześnie przy małym i dużym powiększeniu, można mierzyć przepływy cytoplazmatyczne przed, w trakcie i po zranieniu.

Wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar przepływu cytoplazmy podczas gojenia się ran w pojedynczej komórce. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie żywych komórek stentu lub SEIU w celu wykorzystania jako systemu modelowego do zranień komórkowych. Drugim krokiem jest przygotowanie szklanych narzędzi do cięcia komórek.Następnie komórki stentu sariusa są rozcinane na dostosowanej konfiguracji mikroskopu, która pozwala na jednoczesną operację w małym powiększeniu i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie analizy obliczeniowej przepływu cytoplazmatycznego przy użyciu oprogramowania do symetrii prędkości obrazu cząstek. Ostatecznie obrazowanie cytoplazmy w wysokiej rozdzielczości służy do pokazania aktywnej odpowiedzi komórek podczas gojenia się ran.Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące komórkowego gojenia się ran, takie jak to, czy cytoplazma staje się żelowa wokół obszaru cięcia, aby zapobiec wyciekowi do otaczającego środowiska. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania i cięcia narzędzi do obsługi komórek są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają zręczności manualnej. Aby rozpocząć pozyskiwanie stentu lub komórek Syriusza z naturalnego mostu, zgodnie z opisem w kamieniu nazębnym, lub od komercyjnego dostawcy, dodaj 300 mililitrów zmodyfikowanego stentu lub pożywki dostosowanej do receptur przez kamień nazębny i odstrasz, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.Utrzymuj kultury, uprawiając je w ciemności w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dorastaj w kulturach chlamydomonas Rhine Hardy alg w pożywce fosforanowej tris octanowej. Stosując standardowe metody hodowli przed karmieniem, umyj komórki chlamydomony, delikatnie je obracając, usuwając supernatant i zawieszając je w zmodyfikowanym stencie lub pożywce.W razie potrzeby nakarm 300 mililitrów stentów lub kultur sariusa około 30 milionami komórek chm dwa lub trzy razy w tygodniu. Zbierz stent lub komórki do operacji. Na początek delikatnie porusz kulturę, bulgocząc powietrzem przez końcówkę pipety, aż komórki zaczną się odłączać i swobodnie pływać.Następnie uchwyć pływające komórki za pomocą jednomililitrowej pipety wyposażonej w końcówkę o szerokim otworze, aby uniknąć ścinania komórek. Po zebraniu pozwól komórkom się uspokoić. Następnie powoli odpipetuj pożywkę znajdującą się nad nimi i dodaj świeży zmodyfikowany stent lub pożywkę.Przygotuj szklane igły używane do cięcia komórek stentu, trzymając dwa szklane pręty mieszające nad dużą ilością i palnika, aż końce zaczną się topić. Następnie zetknij ze sobą końce dwóch prętów, aż stopione szkło się połączy. Gdy się połączą, wyjmij je z płomienia i pozwól im ostygnąć przez jedną do dwóch sekund.Następnie powoli rozsuń je, aby zrobić czystą przerwę. Idealnie byłoby w ten sposób wytworzyć igłę o długości około jednego do dwóch centymetrów z cienkim końcem na końcu. Jeśli uzyskana igła nie jest optymalna, wbij końcówkę w szklaną talię i ponownie użyj prętów.Następnie użyj kwadratowego stempla gumowego pokrytego wazeliną, aby przygotować kwadratową komorę o ściankach z wazeliny, wciskając ją w szklane szkiełko nakrywkowe. Następnie dodaj 100 mikrolitrów zmodyfikowanego stentu lub pożywki zawierającej 2% metylocelulozy do kwadratu wazeliny. Umieść przygotowane szkiełko nakrywkowe w plastikowym adapterze, a następnie dodaj umyte komórki stentu do szkiełka nakrywkowego.Na koniec ułóż komórki w metylocelulozie tak, aby były równomiernie rozmieszczone i były dociśnięte wystarczająco blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby były ostre podczas obrazowania. Aby rozpocząć, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu odwróconego. Następnie zdejmij korpus mikroskopu preparacyjnego ze stojaka i określ przybliżoną pozycję, w której będzie musiał zostać umieszczony, aby uwidocznić szkiełko w małym powiększeniu od góry.Następnie skonstruuj mikroskop dwupoziomowy, dodając kartonowe pudełko z pożądanym odstępem między okularem mikroskopu odwróconego a lunetą sekcyjną. Przyklej pudełko taśmą za pomocą taśmy laboratoryjnej, aby można je było łatwo usunąć Po zakończeniu eksperymentu upewnij się, że próbka będzie w polu view i w ostrości bez konieczności przesuwania lunety sekcyjnej Po przymocowaniu przytrzymaj lunetę sekcyjną do pudełka i przyklej ją do pudełka za pomocą taśmy laboratoryjnej. Następnie ustaw odwrócony mikroskop za pomocą optyki DIC, umieszczając na miejscu obiektyw pneumatyczny o powiększeniu 20 razy.Upewnij się również, że używasz kondensatora DIC o dużej odległości roboczej, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca do wykonania mikrochirurgii od góry. Następnie ustaw ostrość komórek za pomocą odwróconego mikroskopu, mając wszystko przygotowane i ustawione na ostrości z obu stron. Rozpocznij rejestrowanie obrazów z szybkością dwóch klatek na sekundę za pomocą kamery CCD o wymiarach 12 na pięć.Następnie przetnij komórkę za pomocą szklanej igły. Uchwyć początkowy wzorzec przepływu cytoplazmatycznego i obserwuj wszystkie etapy procesu zranienia i gojenia się ran. Zakończ akwizycję, gdy komórka wznowi normalny wygląd lub ponownie rozpocznie aktywną ruchliwość.Aby rozpocząć, pobierz PIV lab, pakiet MATLAB do pomiaru przepływu cytoplazmatycznego przy użyciu symetrii prędkości obrazu cząstek. Następnie załaduj stos obrazów TIFF dla każdej sekwencji wideo do programu symetrii prędkości obrazu cząstek w podręczniku MATLAB. Ręcznie wygeneruj maskę dla każdego stosu obrazów, aby zamaskować obszary nieprzetworzonych danych poza treścią stentu.Następnie ustaw PIV lab tak, aby używał ustawienia szybkiej transformaty Fouriera i rozmiaru kosza 64 na 64 piksele, co spowoduje koszowanie pikseli w każdej klatce na większe piksele kwadratowe. Następnie uruchom PIV lab, aby obliczyć korelacje krzyżowe między pikselami w każdej klatce a pobliskimi pikselami. W następnej klatce otrzymamy zależny od czasu wektor przepływu wyśrodkowany na każdym pikselu zgięcia, który ma taką samą rozdzielczość czasową jak dane surowe.Następnie należy obliczyć średnie czasowe wynikowych danych wyjściowych pola wektorowego, aby porównać dane pobrane za pomocą stentu przed cięciem i podczas gojenia się rany. Oblicz również histogramy prędkości przepływu, aby zbadać siłę przepływu i zmianę prędkości w danym pikselu w czasie, aby zbadać wahania przepływu. Podczas sekwencji obrazowania ze stentem lub komórką przeciętą na pół, oblicz całkowity strumień cytoplazmy z powrotem do ciała komórki, mnożąc średnią prędkość przepływu przez pole przekroju poprzecznego zewnątrzkomórkowej podstawy pęcherzykowej cytoplazmy.Pokazano tutaj obrazowanie na żywo stentu lub komórki, gdy jest ona cięta i przerywana szklaną igłą. Po przecięciu znaczna ilość cytoplazmy została wyciągnięta z głównego korpusu komórki, ale szybko spływa z powrotem do komórki. Po tej procedurze można dodać inhibitory chemiczne w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie składniki cytoszkieletu mogą przyczyniać się do ruchu cytoplazmatycznego podczas gojenia się stentu lub rany.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować narzędzia do cięcia stentu do naszych komórek i jak obrazować przepływ cytoplazmatyczny podczas procesu cięcia i gojenia się ran w pojedynczej komórce olbrzyma.

visualizing-cytoplasmic-flow-during-single-cell-wound-healing-stentor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Przedstawiamy sposób przygotowania modelu niedokrwienia/reperfuzji in vitro oraz metodę oceny wpływu terapii komórkami macierzystymi na komórki serca po niedokrwieniu.

Transplantacja komórek macierzystych w modelu symulowanego niedokrwienia/reperfuzji in vitro

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania ran na żywo i związanej z tym reakcji zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej in vivo. Metoda ta wykorzystuje stadium poczwarki rozwoju Drosophila, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie i śledzenie określonych populacji komórek w czasie i jest kompatybilna z wydajną inaktywacją genów za pośrednictwem RNAi.

Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila

Tutaj opisujemy protokoły do wykonywania obrazowania na żywo i analizy ilościowej dynamiki receptorów chemoatraktantu u neutrofili danio...

Obrazowanie na żywo receptorów chemokiny w neutrofilach danio pręgowanego podczas reakcji na ranę

Przedstawiamy protokół charakteryzacji ruchliwości i zachowania populacji komórek o rozmiarach stu mikronów do milimetrów za pomocą mikroskopii jasnego pola i śledzenia komórek. Ten test ujawnia, że Stentor coeruleus przechodzi przez cztery behawioralnie odrębne fazy podczas regeneracji utraconego aparatu ustnego.

Analiza wzorców ruchliwości stentora w trakcie i po regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórek

Ten artykuł opisuje metodę tworzenia ran w nabłonku żywej Clytia hemisphaerica medusa i obrazowania gojenia ran w wysokiej rozdzielczości in vivo. Dodatkowo przedstawiono technikę wprowadzania barwników i leków w celu zakłócenia procesów sygnalizacyjnych w komórkach nabłonka i macierzy zewnątrzkomórkowej podczas gojenia się ran.

Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica

Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.

System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii

Odkryj analizę przepływu cytoplazmy podczas gojenia ran w Stentor coeruleus przy użyciu mikroskopii wysokiej rozdzielczości i oprogramowania PIV. Ta metoda pozwala badać mechanizmy regeneracji komórkowej.

Wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym

Przeglądaj więcej filmów