Ustalenie minimalnego stężenia bakteriobójczego środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek planktonowych (MBC-P) i komórek biofilmu (MBC-B)
January 2nd, 2014
Ten protokół pozwala na bezpośrednie porównanie odporności na planktonę i biofilm dla szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm in vitro przy użyciu 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej. Bakterie planktonowe lub biofilm są narażone na seryjne rozcieńczenia wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. Żywotność określa się na podstawie wzrostu na płytkach agarowych.
Procedura ta bezpośrednio porównuje odporność na plankton i biofilm szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm. Najpierw utwórz biofilm, uzupełnij pożywkę i zastosuj seryjne rozcieńczanie wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. Następnie pozwól komórkom zregenerować się na świeżym, pożywce.
Teraz oznacz żywotność komórek przez posiew na ślimaku LB. Ostatecznie określa się minimalne stężenie bakteriobójcze komórek planktonu i biofilmu, aby wykazać wzrost odporności wynikający ze wzrostu biofilmu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ zanieczyszczają sąsiednie studnie lub nie pozwalają zębom wielozębnego urządzenia ostygnąć na tyle, aby nie zabiły bakterii.
Hodowla, dziki typ i zmutowany szczep bakterii przez 16 godzin w bogatej pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozcieńczyć nasycone kultury przez noc do świeżej pożywki, takiej jak M 63, minimalnej pożywki, uzupełnionej magnezem, siarczanem i argininą. Potem Eloqua. 100 mikrolitrów na studzienkę.
Przydzielając 24 dołki dla każdego szczepu, inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotować 10 x roztwory podstawowe serii rozcieńczeń antybiotyku dla siedmiu studzienek i przechowywać na lodzie. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń zużyty supernatant zawierający komórki planktonowe.
Następnie dodaj 90 mikrolitrów M 63 do wszystkich studzienek i dodaj 10 mikrolitrów odpowiedniego roztworu podstawowego antybiotyku do kontroli bez antybiotyku. Cóż, do każdej repliki i szczepu dodaj 10 mikrolitrów wody. Inkubować mikropłytkę mianeczkową przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Za pomocą pipety wielokanałowej usuń zużyty supernatant zawierający komórki planktonowe. Dodaj 115 mikrolitrów M 63 do wszystkich studzienek i kontynuuj wzrost kultur przez 24 godziny. W 37 stopniach Celsjusza.
Oznacz jedną płytę ślimaka funta na połowę 96. Dobrze płytka do mikromiareczkowania do sterylizacji wielozębnego urządzenia, zanurz je w 100% etanolu i przełóż zęby przez otwarty płomień palnika Bunsena. Niech zęby lekko ostygną.
Za pomocą końcówek zębów. Przenieść kulturę planktonu z każdego dołka płytki do mikromiareczkowania na powierzchnię płytki ślimakowej LB. Umieść płytki ślimaka LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 16 godzin.
Następnie wizualnie określ granicę wzrostu bakterii jako minimalne stężenie bakteriobójcze kultury antybiotyków, dzikiego typu i zmutowanego szczepu bakterii przez 16 godzin w bogatej pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozcieńcz nasycone kultury nocne od jednego do 100 na świeżej pożywce w celu oznaczeń oporności na antybiotyki do każdej studzienki 96-dołkowej płytki mikromianowej. Dodać 90 mikrolitrów rozcieńczenia bakteryjnego. Teraz należy wystawić komórki planktonu na działanie gradientu stężeń antybiotyku.
Zacznij od 10 x roztwory podstawowe serii rozcieńczeń antybiotyku, takiego jak tobramycyna mycyna. Dodaj 10 mikrolitrów łodyg antybiotyku zgodnie z projektem eksperymentalnym. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wody do studzienek kontrolnych bez antybiotyków dla każdej kontrpróby i szczepu.
Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu oznaczenia żywych komórek. Zacznij od oznaczenia jednej płytki ślimakowej LB na każdą połówkę 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Wysterylizuj wielozębne urządzenie przez płomienie ze 100% etanolem.
Powtórz raz. Następnie za pomocą urządzenia wielobolcowego przenieś około trzech mikrolitrów kultury planktonowej z każdej studzienki płytki mikromiareczkowej na powierzchnię płytki ślimakowej LB. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin.
Następnie określ minimalne stężenie bakteriobójcze antybiotyku, identyfikując na oko punkt odcięcia dla rozwoju bakterii. W tym eksperymencie wykorzystano dwa różne testy minimalnego stężenia bakteriobójczego w celu porównania wrażliwości dzikiego typu PA 14 ze zmutowanym szczepem, który nie ma oporności na antybiotyki. Gen NDVB.
W tym przypadku zmierzono minimalne stężenia bakteriobójcze antybiotyku tobramycyny dla biofilmu. MBCB dla PA 14 wynosi 100 mikrogramów na mililitr w porównaniu do 12,5 mikrogramów na mililitr dla mutanta. W przeciwieństwie do tego, minimalne bakteriobójcze stężenia tobramycyny dla komórek planktonowych wynosiły osiem mikrogramów na mililitr zarówno dla PA 14 typu dzikiego, jak i zmutowanego.
Po opanowaniu NBCB można to zrobić w około godzinę, podzieloną na pięć dni.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół umożliwia bezpośrednie porównanie oporności planktonowej i biofilmu dla szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm in vitro, wykorzystując 96-dołową płytę mikrotiterową. Żywotność bakterii planktonowych lub biofilmu jest oceniana po ekspozycji na szereg rozcieńczeń środka przeciwmikrobowego.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Mikrobiologia
- Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe
- Badania nad biofilmami
Wprowadzenie
- Biofilmy to społeczności bakterii, które wykazują zwiększoną oporność na środki przeciwmikrobowe.
- Zrozumienie różnic w oporności między stanami planktonicznym a biofilmem jest kluczowe dla skutecznych strategii leczenia.
- W tym badaniu wykorzystuje się 96-dołową płytę mikrotiterową w celu wydajnego porównania.
- Zanieczyszczenie i błędy proceduralne są częstymi wyzwaniami dla nowych naukowców w tej dziedzinie.
Cel Badania
- Porównanie oporności bakterii planktonowych i biofilmu na środki przeciwmikrobowe.
- Określenie minimalnego stężenia bakteriobójczego dla obu stanów.
- Podkreślenie zwiększonej oporności nadanej przez wzrost biofilmu.
Metody Użyte
- Utworzenie biofilmu w 96-dołowej płycie mikrotiterowej.
- Zastosowanie szeregu rozcieńczeń środka przeciwmikrobowego.
- Odzyskiwanie komórek w świeżym podłożu po leczeniu.
- Ocena żywotności poprzez posiew na agar LB.
Główne Wyniki
- Wykaźano różnice w poziomach oporności między bakteriami planktonicznymi a biofilmem.
- Zidentyfikowano minimalne stężenie bakteriobójcze dla obu stanów bakteryjnych.
- Dostarczono wgląd w mechanizmy oporności związanej z biofilmem.
Wnioski
- Wzrost biofilmu znacząco zwiększa oporność bakterii na środki przeciwmikrobowe.
- Zrozumienie tych różnic jest niezbędne do opracowywania skutecznych strategii leczenia.
- Przyszłe badania powinny skupić się na pokonywaniu oporności związanej z biofilmem.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Direct quantification of minimal bactericidal concentrations for both planktonic and biofilm bacterial states enables mechanistic de-risking in antimicrobial discovery. This approach clarifies resistance profiles at a critical inflection point, supporting predictive confidence in early-stage anti-infective portfolios. Comparative MBC-P and MBC-B data inform target validation and guide compound prioritization for biofilm-associated infections.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of antimicrobial efficacy against distinct bacterial phenotypes.
- Supports functional target validation by quantifying resistance shifts between planktonic and biofilm states.
- Facilitates mechanistic de-risking for anti-biofilm drug candidates.
- Provides actionable data for portfolio triage based on resistance thresholds.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, reproducible microtiter-based assays for both planktonic and biofilm forms.
- Delivers quantitative MBC outputs suitable for high-throughput screening workflows.
- Enables standardization of antimicrobial testing across compound libraries.
- Supports reliable evaluation of compound potency in disease-relevant bacterial models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro resistance data with translational models of biofilm-associated infection.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of anti-biofilm agents.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for compounds targeting persistent infections.
- Strengthens predictive value for clinical translation in biofilm-related disease contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging hypothesis-driven target validation with quantitative screening outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on resistance mechanisms and biofilm-mediated protection.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative MBC data for both bacterial states, enabling robust compound ranking.
- Analytics: Provides clear readouts for statistical comparison of antimicrobial efficacy across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro resistance profiles to preclinical models of persistent infection.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable assay platform for ongoing anti-infective R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antimicrobial development.
- Operational Value: Enables assay standardization, reproducibility, and scalability across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation for anti-biofilm candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of compounds with differentiated resistance profiles.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in sterile technique and microtiter-based assays.
- Demands access to standard microbiology instrumentation and analytical infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to minimize contamination and procedural errors.
- Adaptable to diverse bacterial strains capable of in vitro biofilm formation.
- Dependent on careful handling to avoid cross-well contamination and ensure assay fidelity.
