Name: Ustalenie minimalnego stężenia bakteriobójczego środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek planktonowych (MBC-P) i komórek biofilmu (MBC-B) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T20:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj metodę oznaczania minimalnego stężenia bakteriobójczego dla komórek planktonowych i biofilmu w płytkach 96-dołkowych. Protokół umożliwia bezpośrednie porównanie oporności bakterii w różnych stanach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor chciałby podziękować Li Zhangowi, Xian-Zhi Li, Aaronowi Hinzowi i Claytonowi Hallowi za pomoc redakcyjną przy tym manuskrypcie. Test ten został początkowo opracowany w laboratorium George'a O'Toole'a w Geisel School of Medicine w Dartmouth. Badania w laboratorium dr Mah są wspierane przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada oraz Cystic Fibrosis Canada.

1. MBC-B
<ol>
	<li>Uprawa biofilmu (zaadaptowane z O'Toole9).
	<ol>
		<li>Hoduj kulturę interesującego gatunku dzikiego i zmutowanego szczepu przez 16 godzin w bogatym podłożu w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć nasycone kultury przez noc w stosunku 1:100 do świeżej pożywki w celu oznaczenia oporności na antybiotyki. Standardową pożywką dla P. aeruginosa jest pożywka minimalna M63 uzupełniona siarczanem magnezu i argininą (patrz Tabela 1). Pożywka ta stymuluje tworzenie bardziej wytrzymałego biofilmu.</li>
		<li>Dodać 100 μl rozcieńczenia na basenik do 96-dołkowego naczynia do mikromiareczkowania (patrz Tabela 1). Ponieważ testy te są zwykle wykonywane w trzech egzemplarzach dla każdego szczepu, powinny istnieć 24 dołki dla każdego szczepu.</li>
		<li>Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wystawienie wstępnie uformowanego biofilmu na działanie gradientu stężeń antybiotyku
	<ol>
		<li>Przygotuj serię 10-krotnych rozcieńczeń antybiotyku na 7 dołków. Przykład: dla antybiotyku tobramycyny końcowe stężenia w studzienkach wynoszą 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 i 0,006 mg/ml 5-8 . Z zapasu 25 mg/ml przygotować 10 rozcieńczeń 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 i 0,06 mg/ml. Pozostaw na lodzie.</li>
		<li>Usunąć zużyty supernatant (zawierający komórki planktonowe) za pomocą pipety wielokanałowej (patrz Tabela 1).</li>
		<li>Dodać 90 μl M63 (Mg/Arg) do wszystkich studzienek.</li>
		<li>Dodać 10 μl z każdego 10-krotnego stężenia antybiotyku, aby osiągnąć pożądane stężenia końcowe. Dodać 10 μl wody (bez kontroli antybiotyków) do końcowego dołka dla każdej kontrpróby i szczepu.</li>
		<li>Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odświeżenie podłoża i umożliwienie oderwania żywych komórek.
	<ol>
		<li>Usunąć zużyty supernatant (zawierający komórki planktonowe) za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Dodać 115 μl M63 (Mg/Arg) do wszystkich studzienek.</li>
		<li>Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test na żywe komórki.
	<ol>
		<li>Oznaczyć dwie płytki agarowe LB na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania.</li>
		<li>Wysterylizuj urządzenie wielobolcowe (patrz Tabela 1), zanurzając zęby w 100% etanolu i przepuszczając bolce przez otwarty płomień palnika Bunsena. Powtórzyć. Niech zęby lekko ostygną. Za pomocą urządzenia wielobolcowego przenieś ~ 3 μl (ilość, która jest zwykle zatrzymywana na końcach zębów) kultury planktonowej z każdej studzienki płytki mikromiareczkowej na powierzchnię płytki agarowej LB.</li>
		<li>Inkubować płytki agarowe LB przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Określ minimalne stężenie bakteriobójcze antybiotyku, identyfikując na oko punkt odcięcia dla wzrostu bakterii (ryc. 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. MBC-P 
<ol>
	<li>Przygotowanie szczepów bakteryjnych
	<ol>
		<li>Hoduj kulturę interesującego gatunku dzikiego i zmutowanego szczepu przez 16 godzin w bogatym podłożu w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć nasycone kultury przez noc w stosunku 1:100 do świeżej pożywki w celu oznaczenia oporności na antybiotyki. Standardową pożywką dla P. aeruginosa jest pożywka minimalna M63 uzupełniona siarczanem magnezu i argininą (patrz Tabela 1).</li>
		<li>Dodać 90 μl rozcieńczenia na dołek do 96-dołkowego naczynia do mikromiareczkowania (patrz tabela 1). Ponieważ testy te są zwykle wykonywane w trzech egzemplarzach dla każdego szczepu, powinny istnieć 24 dołki dla każdego szczepu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wystawienie komórek planktonowych na działanie gradientu stężeń antybiotyku
	<ol>
		<li>Przygotuj 10-krotną serię rozcieńczeń antybiotyku na 7 dołków. Przykład: dla antybiotyku tobramycyny końcowe stężenia w studzienkach wynoszą 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 i 0,0005 mg/ml. Z zapasu 25 mg/ml przygotować roztwory 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 i 0,005 mg/ml. Pozostaw na lodzie.</li>
		<li>Dodać 10 μl z każdego 10-krotnego stężenia antybiotyku, aby osiągnąć pożądane stężenia końcowe. Dodać 10 μl wody (bez kontroli antybiotyków) do końcowego dołka dla każdej kontrpróby i szczepu.</li>
		<li>Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test na żywe komórki.
	<ol>
		<li>Oznaczyć dwie płytki agarowe LB na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania.</li>
		<li>Wysterylizuj urządzenie wielobolcowe (patrz Tabela 1), zanurzając zęby w 100% etanolu i przepuszczając bolce przez otwarty płomień palnika Bunsena. Powtórzyć. Niech zęby lekko ostygną. Za pomocą urządzenia wielobolcowego przenieś ~ 3 μl (ilość, która jest zwykle zatrzymywana na końcach zębów) kultury planktonowej z każdej studzienki płytki mikromiareczkowej na powierzchnię płytki agarowej LB.</li>
		<li>Inkubować płytki agarowe LB przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Określ minimalne stężenie bakteriobójcze antybiotyku, identyfikując na oko punkt odcięcia dla rozwoju bakterii (ryc. 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Zhang, L., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Involvement+of+a+Novel+Efflux+System+in+Biofilm-Specific+Resistance+to+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics.</a> J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).</li>
<li>Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+tssC1+Links+Type+VI+Secretion+and+Biofilm-specific+Antibiotic+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance.</a> J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biofilm-Specific+Antibiotic+Resistance+Gene%2C+ndvB%2C+is+Important+for+Expression+of+Ethanol+Oxidation+Genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+tolerance+of+biofilms+and+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug tolerance of biofilms and persister cells.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).</li>
<li>Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerritt%2C+JH+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).</li>
<li>Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamey%2C+BE+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22">Curr. Protoc. Microbiol</a>. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).</li>
</ol>

Autorka oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Oporność na antybiotyki w komórkach planktonowych definiuje się jako wzrost minimalnego stężenia hamującego (MIC) antybiotyku spowodowany trwałą zmianą w komórkach (np. mutacją). Zidentyfikowane do tej pory mechanizmy odporności lub tolerancji specyficznej dla biofilmu są wynikiem ekspresji genów typu dzikiego w biofilmach. W związku z tym klasyczna definicja odporności nie ma zastosowania do biofilmów. Przedstawiono jednak inny zestaw definicji: mechanizmy oporności uniemożliwiają antybiotykowi dostęp do celu, ...

Testy odporności na antybiotyki zostały początkowo opracowane do badania odporności planktonowych (swobodnie pływających) kultur bakterii. Ponieważ wiele infekcji bakteryjnych obejmuje biofilmy (komórki przyczepione powierzchniowo), byliśmy zainteresowani opracowaniem metody oznaczania oporności na antybiotyki specyficznej dla biofilmu. Jednak większość testów oporności na antybiotyki słabo nadaje się do pomiaru oporności biofilmów. Na przykład określenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) jest złotym standardem w określaniu oporności kultur bakterii planktonowych na antybiotyki 1. Test ten polega na zmieszaniu rozcieńczonej kultury planktonowej z serią rozcieńczeń antybiotyku. Stężenie antybiotyku, które hamuje widoczny wzrost komórek planktonu, to MIC. Ponieważ test ten opiera się na hamowaniu wzrostu, z definicji nie może działać z kulturami biofilmu, co wymaga zbadania wrażliwości komórek w wyrośniętym biofilmie na antybiotyki. Zamiast mierzyć zahamowanie wzrostu, opisany tutaj test MBC-B określa stężenie antybiotyku, który zabija komórki już istniejące w biofilmie. W związku z tym test ten ma na celu naśladowanie leczenia antybiotykami ustalonych infekcji biofilmu i zapewnienie bardziej odpowiedniego obrazu oporności bakterii na antybiotyki in vivo.
Ponieważ biofilmy są na ogół bardziej odporne na antybiotyki niż kultury planktonowe 2-4 , konieczne było opracowanie metody, która bezpośrednio łączy odporność biofilmu na antybiotyki z odpornością kultury planktonowej. Kolejnym celem tej metody jest możliwość bezpośredniego porównania poziomu oporności na antybiotyki między komórkami planktonicznymi i biofilmowymi. Opisane tutaj testy MBC-P i MBC-B umożliwiają to, ponieważ komórki są hodowane w podobnych warunkach. Wykorzystaliśmy tę metodę do zbadania kilku genów, które są ważne dla oporności na antybiotyki specyficznej dla biofilmu 5-8 .

<table><tbody><tr><td> 1x&nbsp; M63 </td><td></td><td></td><td> Przygotuj się jako 5x&nbsp; Zapas M63 przez rozpuszczenie 15 g KH2PO4, 35g K2HPO4 i 10g (NH4)2SO4 w 1 l wody. Ten bulion nie musi być sterylizowany w autoklawie i może być przechowywany w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć 5x&nbsp; zapas 1:5, autoklaw, ostudzić, a następnie dodać żądane składniki. </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td> </td></tr><tr><td> K2HPO4 </td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td> </td></tr><tr><td> (NH4)2SO4 </td><td>Sigma</td><td>A5132</td><td> </td></tr><tr><td> Siarczan magnezu </td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td> Dodaj do 1 mM końcowego stężenia.&nbsp; Przygotuj jako 1 M zapas w wodzie i autoklawie. </td></tr><tr><td> Tobramycyna </td><td>Sigma</td><td></td><td> Przygotuj 50 mg/m&nbsp; skład. Aliquot i przechowuj pod adresem -20&deg;C. </td></tr><tr><td> Arginina </td><td>Sigma</td><td>A5131</td><td> Dodaj do 0,4% końcowego stężenia.&nbsp; Przygotuj jako 20% zapas w wodzie i sterylizuj filtrem.&nbsp; To alternatywne źródło węgla/energii może zastąpić glukozę i casaminokwasy </td></tr><tr><td> 96-dołkowe płytki mikromiareczkowe </td><td>Corning</td><td>3595</p</td><td>> Sterylne, płaskie dno, niskie parowanie </td></tr><tr><td> Tranferpette (pipeta wielokanałowa) </td><td>BrandTech</td><td>2703610</td><td> 8-kanałowy, 20-200 &mie.; l </td></tr><tr><td> Urządzenie wielobolcowe </td><td>Dan-Kar</td><td>MC48</td><td> 48 zębów pasuje do &frac12; 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania </td></tr></tbody></table>

ustalenie minimalnego stężenia bakteriobójczego środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek planktonowych (mbc-p) i komórek biofilmu (mbc-b)

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

Ten protokół pozwala na bezpośrednie porównanie odporności na planktonę i biofilm dla szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm in vitro. Bakterie są inokulowane do studzienek 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. W przypadku testu planktonowego do zawiesin bakteryjnych dodaje się seryjne rozcieńczenia wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. W teście biofilmu, po zaszczepieniu, bakterie pozostawia się do utworzenia biofilmu przez określony czas. Nieprzyłączone komórki są usuwane ze studzienek, pożywka jest uzupełniana i dodawane są seryjne rozcieńczenia wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. Po ekspozycji na środek przeciwdrobnoustrojowy komórki planktonu są badane pod kątem wzrostu. W przypadku testu biofilmu pożywkę odświeża się świeżą pożywką pozbawioną środka przeciwdrobnoustrojowego, a komórki biofilmu pozostawia się do regeneracji. Żywotność komórek biofilmu jest oznaczana po okresie rekonwalescencji. MBC-P dla środka przeciwdrobnoustrojowego definiuje się jako najniższe stężenie leku, który zabija komórki w kulturze planktonowej. Natomiast MBC-B dla szczepu określa się poprzez wystawienie wstępnie uformowanych biofilmów na rosnące stężenia środka przeciwdrobnoustrojowego przez 24 godziny. MBC-B definiuje się jako najniższe stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego, który zabija komórki w biofilmie.

Przeprowadzono testy MBC-P i MBC-B, porównując wrażliwość szczepu PA14 typu dzikiego oraz PA14 ∆ndvB. Jako antybiotyk zastosowano tobramycynę. Przedstawiono wyniki odpowiadające krokowi 1.4.4 (Rysunek 1) oraz krokowi 2.3.4 (Rysunek 2). PA14 i ∆ndvB zaszczepiono do testów MBC-P i MBC-B w trzech powtórzeniach. Po wykonaniu kroków 1.0-1.4 protokołu MBC-B oraz kroków 2.0-2.3 protokołu MBC-P, żywe komórki wysiano na płytki z agarem LB. Stężenia tobramycyny (<span style="font...

Ten protokół pozwala na bezpośrednie porównanie odporności na planktonę i biofilm dla szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm in vitro przy użyciu 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej. Bakterie planktonowe lub biofilm są narażone na seryjne rozcieńczenia wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. Żywotność określa się na podstawie wzrostu na płytkach agarowych.

Ustalenie minimalnego stężenia bakteriobójczego środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek planktonowych (MBC-P) i komórek biofilmu (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Procedura ta bezpośrednio porównuje odporność na plankton i biofilm szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm. Najpierw utwórz biofilm, uzupełnij pożywkę i zastosuj seryjne rozcieńczanie wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. Następnie pozwól komórkom zregenerować się na świeżym, pożywce.Teraz oznacz żywotność komórek przez posiew na ślimaku LB. Ostatecznie określa się minimalne stężenie bakteriobójcze komórek planktonu i biofilmu, aby wykazać wzrost odporności wynikający ze wzrostu biofilmu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ zanieczyszczają sąsiednie studnie lub nie pozwalają zębom wielozębnego urządzenia ostygnąć na tyle, aby nie zabiły bakterii.Hodowla, dziki typ i zmutowany szczep bakterii przez 16 godzin w bogatej pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozcieńczyć nasycone kultury przez noc do świeżej pożywki, takiej jak M 63, minimalnej pożywki, uzupełnionej magnezem, siarczanem i argininą. Potem Eloqua. 100 mikrolitrów na studzienkę.Przydzielając 24 dołki dla każdego szczepu, inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotować 10 x roztwory podstawowe serii rozcieńczeń antybiotyku dla siedmiu studzienek i przechowywać na lodzie. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń zużyty supernatant zawierający komórki planktonowe.Następnie dodaj 90 mikrolitrów M 63 do wszystkich studzienek i dodaj 10 mikrolitrów odpowiedniego roztworu podstawowego antybiotyku do kontroli bez antybiotyku. Cóż, do każdej repliki i szczepu dodaj 10 mikrolitrów wody. Inkubować mikropłytkę mianeczkową przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Za pomocą pipety wielokanałowej usuń zużyty supernatant zawierający komórki planktonowe. Dodaj 115 mikrolitrów M 63 do wszystkich studzienek i kontynuuj wzrost kultur przez 24 godziny. W 37 stopniach Celsjusza.Oznacz jedną płytę ślimaka funta na połowę 96. Dobrze płytka do mikromiareczkowania do sterylizacji wielozębnego urządzenia, zanurz je w 100% etanolu i przełóż zęby przez otwarty płomień palnika Bunsena. Niech zęby lekko ostygną.Za pomocą końcówek zębów. Przenieść kulturę planktonu z każdego dołka płytki do mikromiareczkowania na powierzchnię płytki ślimakowej LB. Umieść płytki ślimaka LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 16 godzin.Następnie wizualnie określ granicę wzrostu bakterii jako minimalne stężenie bakteriobójcze kultury antybiotyków, dzikiego typu i zmutowanego szczepu bakterii przez 16 godzin w bogatej pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozcieńcz nasycone kultury nocne od jednego do 100 na świeżej pożywce w celu oznaczeń oporności na antybiotyki do każdej studzienki 96-dołkowej płytki mikromianowej. Dodać 90 mikrolitrów rozcieńczenia bakteryjnego. Teraz należy wystawić komórki planktonu na działanie gradientu stężeń antybiotyku.Zacznij od 10 x roztwory podstawowe serii rozcieńczeń antybiotyku, takiego jak tobramycyna mycyna. Dodaj 10 mikrolitrów łodyg antybiotyku zgodnie z projektem eksperymentalnym. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wody do studzienek kontrolnych bez antybiotyków dla każdej kontrpróby i szczepu.Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu oznaczenia żywych komórek. Zacznij od oznaczenia jednej płytki ślimakowej LB na każdą połówkę 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Wysterylizuj wielozębne urządzenie przez płomienie ze 100% etanolem.Powtórz raz. Następnie za pomocą urządzenia wielobolcowego przenieś około trzech mikrolitrów kultury planktonowej z każdej studzienki płytki mikromiareczkowej na powierzchnię płytki ślimakowej LB. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin.Następnie określ minimalne stężenie bakteriobójcze antybiotyku, identyfikując na oko punkt odcięcia dla rozwoju bakterii. W tym eksperymencie wykorzystano dwa różne testy minimalnego stężenia bakteriobójczego w celu porównania wrażliwości dzikiego typu PA 14 ze zmutowanym szczepem, który nie ma oporności na antybiotyki. Gen NDVB.W tym przypadku zmierzono minimalne stężenia bakteriobójcze antybiotyku tobramycyny dla biofilmu. MBCB dla PA 14 wynosi 100 mikrogramów na mililitr w porównaniu do 12,5 mikrogramów na mililitr dla mutanta. W przeciwieństwie do tego, minimalne bakteriobójcze stężenia tobramycyny dla komórek planktonowych wynosiły osiem mikrogramów na mililitr zarówno dla PA 14 typu dzikiego, jak i zmutowanego.Po opanowaniu NBCB można to zrobić w około godzinę, podzieloną na pięć dni.

establishing-minimal-bactericidal-concentration-an-antimicrobial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Ten film demonstruje metodę opartą na płytkach mikromiareczkowych do określania minimalnego stężenia hamującego (MIC) testowych antybiotyków przeciwko bakteriom. Po dodaniu zawiesiny patogenu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa do płytki mikromiareczkowej zawierającej seryjne rozcieńczenia badanego antybiotyku i inhibitora wytwarzania pyomelaniny przez bakterie, mierzy się gęstość optyczną studzienek w celu obliczenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyku oraz wpływu inhibitora produkcji...

Metoda mikromiareczkowania na płytkach do oceny minimalnego stężenia hamującego antybiotyku

Bakteryjna produkcja pyomelaniny powoduje zwiększoną odporność na stres oksydacyjny i zjadliwość. Przedstawiamy techniki, które można wykorzystać do określenia zahamowania produkcji pyomelaniny i oznaczenia wynikającego z tego wzrostu wrażliwości na stres oksydacyjny u bakterii, a także określenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyk (MIC).

Metody hamowania produkcji pyomelaniny bakteryjnej i określania odpowiedniego wzrostu wrażliwości na stres oksydacyjny

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Ten protokół opisuje podejście łączące metody statyczne i dynamiczne do oceny skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmów w przemyśle mleczarskim. Podejście to może być również wykorzystane do testowania skuteczności nowych preparatów biologicznych lub chemicznych w zwalczaniu biofilmów.

Ocena skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmu mlecznego przy użyciu podejścia łączącego metody statyczne i dynamiczne

Wprowadzamy cztery metody oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząsteczek i powierzchni nanostrukturalnych za pomocą technik in vitro. Metody te można zaadaptować do badania interakcji różnych nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych z szeroką gamą gatunków drobnoustrojów.

Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej nanocząstek i powierzchni nanostrukturalnych in vitro

Ten protokół opisuje solidną metodę tworzenia biofilmu błonki. Metoda jest skalowalna do różnych objętości hodowli, co pozwala na łatwe zastosowanie do różnych celów eksperymentalnych. Konstrukcja metody umożliwia jakościową lub ilościową ocenę potencjału biofilmotwórczego kilku gatunków prątków.

Hodowla biofilmu prątków jako model do badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Protokół ten zapewnia systematyczne ramy do oceny, w jaki sposób fitochemikalia mogą wzmacniać bakteriobójcze efekty tradycyjnych biocydów, wykorzystując modelowanie aktywności bakteriobójczej oraz testy interakcji kombinatorycznych, które mają na celu identyfikację synergicznych mieszanin poprawiających kontrolę mikroorganizmów i ograniczających ogólne zużycie biocydów.

In vitro Ocena wzmacniających efektów cząsteczek pochodzenia roślinnego na konwencjonalne biocydy

Poznaj metodę oznaczania minimalnego stężenia bakteriobójczego dla komórek planktonowych i biofilmu w płytkach 96-dołkowych. Protokół umożliwia bezpośrednie porównanie oporności bakterii w różnych stanach fizjologicznych.

Ustalenie minimalnego stężenia bakteriobójczego środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek planktonowych (MBC-P) i komórek biofilmu (MBC-B) (Wideo) | JoVE Journal

Ustalenie minimalnego stężenia bakteriobójczego środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek planktonowych (MBC-P) i komórek biofilmu (MBC-B)

Przeglądaj więcej filmów