Ustalenie minimalnego stężenia bakteriobójczego środka przeciwdrobnoustrojowego dla komórek planktonowych (MBC-P) i komórek biofilmu (MBC-B)
2 stycznia 2014
Ten protokół pozwala na bezpośrednie porównanie odporności na planktonę i biofilm dla szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm in vitro przy użyciu 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej. Bakterie planktonowe lub biofilm są narażone na seryjne rozcieńczenia wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. Żywotność określa się na podstawie wzrostu na płytkach agarowych.
Procedura ta bezpośrednio porównuje odporność na plankton i biofilm szczepu bakteryjnego, który może tworzyć biofilm. Najpierw utwórz biofilm, uzupełnij pożywkę i zastosuj seryjne rozcieńczanie wybranego środka przeciwdrobnoustrojowego. Następnie pozwól komórkom zregenerować się na świeżym, pożywce.
Teraz oznacz żywotność komórek przez posiew na ślimaku LB. Ostatecznie określa się minimalne stężenie bakteriobójcze komórek planktonu i biofilmu, aby wykazać wzrost odporności wynikający ze wzrostu biofilmu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ zanieczyszczają sąsiednie studnie lub nie pozwalają zębom wielozębnego urządzenia ostygnąć na tyle, aby nie zabiły bakterii.
Hodowla, dziki typ i zmutowany szczep bakterii przez 16 godzin w bogatej pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozcieńczyć nasycone kultury przez noc do świeżej pożywki, takiej jak M 63, minimalnej pożywki, uzupełnionej magnezem, siarczanem i argininą. Potem Eloqua. 100 mikrolitrów na studzienkę.
Przydzielając 24 dołki dla każdego szczepu, inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotować 10 x roztwory podstawowe serii rozcieńczeń antybiotyku dla siedmiu studzienek i przechowywać na lodzie. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń zużyty supernatant zawierający komórki planktonowe.
Następnie dodaj 90 mikrolitrów M 63 do wszystkich studzienek i dodaj 10 mikrolitrów odpowiedniego roztworu podstawowego antybiotyku do kontroli bez antybiotyku. Cóż, do każdej repliki i szczepu dodaj 10 mikrolitrów wody. Inkubować mikropłytkę mianeczkową przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Za pomocą pipety wielokanałowej usuń zużyty supernatant zawierający komórki planktonowe. Dodaj 115 mikrolitrów M 63 do wszystkich studzienek i kontynuuj wzrost kultur przez 24 godziny. W 37 stopniach Celsjusza.
Oznacz jedną płytę ślimaka funta na połowę 96. Dobrze płytka do mikromiareczkowania do sterylizacji wielozębnego urządzenia, zanurz je w 100% etanolu i przełóż zęby przez otwarty płomień palnika Bunsena. Niech zęby lekko ostygną.
Za pomocą końcówek zębów. Przenieść kulturę planktonu z każdego dołka płytki do mikromiareczkowania na powierzchnię płytki ślimakowej LB. Umieść płytki ślimaka LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 16 godzin.
Następnie wizualnie określ granicę wzrostu bakterii jako minimalne stężenie bakteriobójcze kultury antybiotyków, dzikiego typu i zmutowanego szczepu bakterii przez 16 godzin w bogatej pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozcieńcz nasycone kultury nocne od jednego do 100 na świeżej pożywce w celu oznaczeń oporności na antybiotyki do każdej studzienki 96-dołkowej płytki mikromianowej. Dodać 90 mikrolitrów rozcieńczenia bakteryjnego. Teraz należy wystawić komórki planktonu na działanie gradientu stężeń antybiotyku.
Zacznij od 10 x roztwory podstawowe serii rozcieńczeń antybiotyku, takiego jak tobramycyna mycyna. Dodaj 10 mikrolitrów łodyg antybiotyku zgodnie z projektem eksperymentalnym. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wody do studzienek kontrolnych bez antybiotyków dla każdej kontrpróby i szczepu.
Inkubować płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu oznaczenia żywych komórek. Zacznij od oznaczenia jednej płytki ślimakowej LB na każdą połówkę 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Wysterylizuj wielozębne urządzenie przez płomienie ze 100% etanolem.
Powtórz raz. Następnie za pomocą urządzenia wielobolcowego przenieś około trzech mikrolitrów kultury planktonowej z każdej studzienki płytki mikromiareczkowej na powierzchnię płytki ślimakowej LB. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin.
Następnie określ minimalne stężenie bakteriobójcze antybiotyku, identyfikując na oko punkt odcięcia dla rozwoju bakterii. W tym eksperymencie wykorzystano dwa różne testy minimalnego stężenia bakteriobójczego w celu porównania wrażliwości dzikiego typu PA 14 ze zmutowanym szczepem, który nie ma oporności na antybiotyki. Gen NDVB.
W tym przypadku zmierzono minimalne stężenia bakteriobójcze antybiotyku tobramycyny dla biofilmu. MBCB dla PA 14 wynosi 100 mikrogramów na mililitr w porównaniu do 12,5 mikrogramów na mililitr dla mutanta. W przeciwieństwie do tego, minimalne bakteriobójcze stężenia tobramycyny dla komórek planktonowych wynosiły osiem mikrogramów na mililitr zarówno dla PA 14 typu dzikiego, jak i zmutowanego.
Po opanowaniu NBCB można to zrobić w około godzinę, podzieloną na pięć dni.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia bezpośrednie porównanie oporności form planktonicznych i biofilmu dla szczepu bakteryjnego zdolnego do tworzenia biofilmu in vitro z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytracyjnej. Żywotność bakterii planktonicznych lub biofilmu ocenia się po narażeniu na rozcieńczenia seryjne środka przeciwdrobnoustrojowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe
- Badania nad biofilmem
Wstęp
- Biofilmy są społecznościami bakterii wykazującymi zwiększoną oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe.
- Zrozumienie różnic w oporności między stanem planktonicznym a biofilmem jest kluczowe dla opracowania skutecznych strategii leczenia.
- W niniejszym badaniu wykorzystano płytkę mikrotiterową z 96 dołkami w celu zapewnienia efektywnego porównania.
- Kontaminacja oraz błędy proceduralne stanowią częste wyzwania dla badaczy rozpoczynających pracę w tej dziedzinie.
Cel badania
- Porównanie odporności bakterii planktonicznych i biofilmu na środki przeciwdrobnoustrojowe.
- Wyznaczenie minimalnego stężenia bakteriobójczego dla obu stanów.
- Wykazanie zwiększonej odporności wynikającej z rozwoju biofilmu.
Zastosowane metody
- Utworzenie biofilmu w 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej.
- Zastosowanie rozcieńczeń seryjnych środka przeciwdrobnoustrojowego.
- Odzyskiwanie komórek w świeżej pożywce po zakończeniu obróbki.
- Ocena żywotności poprzez wysiew na agar LB.
Główne wyniki
- Wykazano różnice w poziomach oporności między bakteriami planktonicznymi a bakteriami w biofilmie.
- Określono minimalne stężenie bakteriobójcze dla obu stanów bakterii.
- Przedstawiono informacje na temat mechanizmów oporności związanej z biofilmem.
Wnioski
- Wzrost biofilmu znacząco zwiększa oporność bakterii na środki przeciwdrobnoustrojowe.
- Zrozumienie tych różnic jest niezbędne do opracowania skutecznych strategii leczenia.
- Przyszłe badania powinny skupić się na przezwyciężeniu oporności związanej z biofilmem.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednie oznaczanie minimalnych stężeń bakteriobójczych dla bakterii w stanie planktonicznym oraz w formie biofilmu umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w procesie poszukiwania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Podejście to wyjaśnia profile oporności w krytycznym punkcie zwrotnym, zwiększając pewność prognostyczną w portfelach przeciwzakaźnych na wczesnym etapie badań. Porównawcze dane MBC-P i MBC-B służą do walidacji celu oraz pomagają w ustalaniu priorytetów dla związków ukierunkowanych na infekcje związane z biofilmem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę skuteczności przeciwdrobnoustrojowej przeciwko odmiennym fenotypom bakteryjnym.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe określanie zmian w oporności między stanem planktonicznym a biofilmem.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dla kandydatów na leki przeciwbiofilmowe.
- Dostarcza przydatnych danych do selekcji portfolio w oparciu o progi oporności.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane, powtarzalne testy w mikropłytkach dla form planktonicznych i biofilmu.
- Dostarcza ilościowe wyniki MBC odpowiednie dla przepływów pracy w badaniach wysokoprzepustowych.
- Umożliwia standaryzację testów przeciwdrobnoustrojowych dla bibliotek związków.
- Wspiera wiarygodną ocenę aktywności związków w modelach bakteryjnych istotnych dla przebiegu chorób.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane o oporności in vitro z modelami translacyjnymi infekcji związanych z biofilmem.
- Zapewnia ciągłość od wczesnego etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej czynników przeciwbiofilmowych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju związków ukierunkowanych na uporczywe infekcje w oparciu o analizę ryzyka.
- Zwiększa wartość prognostyczną w kontekście translacji klinicznej w chorobach związanych z biofilmem.
Integracja potoków przetwarzania i przepływów pracy
Metoda ta integruje etapy wczesnego odkrywania i identyfikacji wiodących związków, łącząc walidację celu opartą na hipotezach z ilościowymi wynikami przesiewowymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów oporności oraz ochrony pośredniej przez biofilm.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych MBC dla obu stanów bakteryjnych, umożliwiając rzetelne rankingowanie związków.
- Analityka: Zapewnia przejrzyste wyniki do statystycznego porównania skuteczności przeciwmikrobowej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy profile oporności in vitro z przedklinicznymi modelami uporczywych infekcji.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje zestandaryzowaną, skalowalną platformę assay dla prowadzących programów B+R w obszarze środków przeciwinfekcyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i ogranicza niejednoznaczność mechanistyczną w opracowywaniu środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów w ramach zespołów badawczych.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz alokację kapitału dla kandydatów na środki przeciwbiofilmowe.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój związków o zróżnicowanych profilach oporności.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie technik sterylnych oraz analiz opartych na płytkach mikrotitrajnych.
- Wymaga dostępu do standardowej aparatury mikrobiologicznej i infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja wewnątrz zespołów w celu zminimalizowania kontaminacji i błędów proceduralnych.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych szczepów bakteryjnych zdolnych do tworzenia biofilmu in vitro.
- Wymaga ostrożnego obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej między studzienkami i zapewnić wiarygodność analizy.
