Name: Zdalne uruchamianie magnetyczne sond mikrometrycznych do mapowania 3D in situ właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Poznaj metodę zdalnego uruchamiania magnetycznych sond do mapowania właściwości fizycznych biofilmu E. coli in situ. Technika ta umożliwia nieinwazyjne pomiary lepkości sprężystości w skali mikrometrycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Agence Nationale pour la Recherche, programu PIRIbio Dynabiofilm oraz z programu CNRS Interdisciplinary Risk. Dziękujemy Philippe'owi Thomenowi za krytyczną lekturę manuskryptu i Christophe'owi Beloinowi za dostarczenie szczepu E. coli użytego w tej pracy.

1. Hodowla bakterii i przygotowanie zawiesiny
<ol>
	<li>Wybrać świeżo wyhodowaną kolonię z płytki z agarem LB (Lysogeny Broth), zaszczepić ją w 5 ml płynnej pożywki LB zawierającej 100 µg/ml ampicyliny i 7,5 µg/ml tetracykliny, a następnie inkubować przez 5 do 6 h w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsowej.</li>
	<li>Następnie dodać 100 µl kultury bakteryjnej do 5 ml pożywki minimalnej (M63B1) uzupełnionej o 0,4% glukozy i te same stężenia antybiotyków. Tę świeżo rozcieńczoną kulturę inkubować przez noc w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsowej.</li>
	<li>Po 16 h inkubacji dodać 100 μl kultury nocnej do 5 ml pożywki M63B1 z 0,4% glukozy. Przechowywać probówkę w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsowej do momentu osiągnięcia wartości OD równej 0,5. Zawiesina jest następnie gotowa do wstrzyknięcia do kanału eksperymentalnego w celu formowania biofilmu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie cząsteczek magnetycznych
<ol>
	<li>Pobrać 10 μl cząstek magnetycznych — o średnicy 2,8 µm — z roztworu zapasowego i przemyć je 3x w 190 μl medium minimalnego przy użyciu magnetycznego statywu do próbek.</li>
	<li>Dostosować stężenie cząstek do 5 x 106 kulek/ml. Zazwyczaj 50 μl przemytego roztworu kulek miesza się z dodatkowymi 950 µl M63B1 z 0,4% glukozy.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kanałów i wzrost biofilmu
<ol>
	<li>Montaż kanału
	<ol>
		<li>Odetnij dwa kwadratowe kapilary z borokrzemianowego szkła (o długości boku 800 µm) o długości 10 cm, aby uzyskać dwa odcinki o długości 8 cm.</li>
		<li>Przyklej dwa odcinki kapilar do dwóch szkiełek przedmiotowych — wcześniej przeciętych na pół — w odległości 2 cm od siebie, z 1 cm wystawaniem na obu końcach, jak pokazano na Rysunku 1, używając szybko utwardzalnego kleju cyjanoakrylowego (tzw. super-glue).</li>
		<li>Zautoklawuj cały zestaw oraz niezbędne rurki wymagane do dalszego połączenia kanałów.</li>
		<li>Przygotuj wszystkie sterylne materiały pod laminarnym przepływem powietrza: i) zamontowany kanał i pułapkę 1, ii) rurki i złączki, iii) dwie pułapki na pęcherzyki powietrza — filtr pęcherzykowy powszechnie stosowany do zabezpieczania kroplówek dziecięcych (pułapka 1) oraz domowej roboty pułapkę na pęcherzyki w postaci rurki o większej średnicy i długości 4 cm (pułapka 2), iv) zaciski, v) strzykawki 30 ml wypełnione pożywką M63B1 z 0,4% glukozy oraz vi) butelkę na odpady.</li>
		<li>Połącz cały układ za pomocą złączek Luer Lock lub połączeń w następującej kolejności: strzykawka 50 ml z M63B1 sterowana pompą strzykawkową, pediatryczny filtr pęcherzykowy, domowej roboty pułapka na pęcherzyki, kapilara (Rysunek 1, panel B) oraz rurka do butelki na odpady. Następnie wypełnij układ sterylną pożywką M63B1 z 0,4% glukozy, włączając pompę strzykawkową z prędkością około 10 ml/godz, czyli wyższą niż prędkości eksperymentalne. Uważnie śledź i usuwaj wszystkie pęcherzyki powietrza w obwodzie.</li>
		<li>Przepływaj pożywkę przez system przez 10-15 min; równocześnie wymieszaj 1 ml zawiesiny bakterii o OD 0,5 z Sekcji 1.3 z 1 ml roztworu przemytych kulek przygotowanego w Sekcji 2.2.</li>
		<li>Zamocuj (ale nie zamykaj) zaciski na rurkach w dwóch miejscach: przed i za kapilarami. Wyłącz przepływ.</li>
		<li>Wprowadź mieszaninę bakterii i kulek do kapilary za domową pułapką na pęcherzyki za pomocą strzykawki 1 ml, dbając o uniesienie końcówek rurek, aby zapobiec dostaniu się powietrza. Ponownie podłącz rurki, a następnie zamknij zaciski.</li>
		<li>Powtórz tę samą procedurę dla drugiej kapilary i sprawdź wszystkie rurki pod kątem obecności pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Przenieś aparat pod mikroskop i pozostaw go na 15-20 min, aby umożliwić bakteriom osiadanie i przyleganie do powierzchni kapilary. Zamontuj kapilarę na stoliku mikroskopu, umieszczając pojemnik na odpady nieco wyżej. Postaw pompę strzykawkową na blacie obok mikroskopu. Unieś pułapkę na pęcherzyki przed kapilarą nieco powyżej płaszczyzny kapilary, aby wychwytywać pęcherzyki powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzrost biofilmu
	<ol>
		<li>Ustaw prędkość przepływu na pompie strzykawkowej i uruchom przepływ; biofilm będzie teraz rozwijać się na powierzchni kapilary przez wymagany czas — zazwyczaj 24 lub 48 h w tych eksperymentach.</li>
		<li>Ustaw ostrość na dolnej płaszczyźnie kapilary i rozpocznij rejestrację obrazów próbki w trybie time-lapse — zazwyczaj częstotliwość akwizycji 2 obrazów/min będzie wystarczająca do monitorowania wzrostu biofilmu. To wideo monitoruje wzrost biofilmu po kontroli (zobacz fragmenty w Filmach 1, 2 i 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Instalacja pęsety magnetycznej
<ol>
	<li>Przykręć pęsetę magnetyczną do mikromanipulatorów X-Y-Z sterowanych ręcznie, a następnie przykręć mikromanipulatory do stolika mikroskopu, aby dostosować położenie pęsety względem kapilary. Umieść pęsetę zgodnie z Rysunkiem 2, aby zapewnić wytworzenie odpowiedniego gradientu pola magnetycznego w strefie obserwacji.</li>
	<li>Podłącz pęsetę do generatora funkcji za pomocą wzmacniacza mocy, aby wygenerować cykl o czasie trwania 40 s, składający się z 24 s sygnału zerowego i 16 s prądu stałego o natężeniu 4 A, z wyzwalaczem wysyłanym do migawki oświetlenia w jasnym polu po 20 s w celu synchronizacji sygnałów, zapewniając sekwencję zdarzeń przedstawioną na Rysunku 3. 
	Uwaga: Te dwie operacje można przeprowadzić w dowolnym momencie między instalacją kapilary a rozpoczęciem pomiaru. Patrz schemat przebiegu eksperymentu na Rysunku 4.</li>
</ol>
5. Pozyskiwanie krzywej pełzania
<ol>
	<li>Za pomocą sterowania ruchem xy stolika mikroskopu ustaw krawędź lewego bieguna magnetycznego oraz lewą krawędź kapilary w tym samym polu widzenia. Przyjmij początek układu odniesienia do analizy w punkcie przecięcia osi x i y, zdefiniowanych odpowiednio przez krawędź kapilary i krawędź bieguna (patrz Rycina 2).</li>
	<li>Dostosuj pozycję pionową kapilary za pomocą pokrętła mikrometrycznego ostrości mikroskopu. Zazwyczaj pierwsza analizowana płaszczyzna znajduje się od 4 do 7 µm powyżej dna kapilary. Wideo 1 odpowiada polu xy, którego górny lewy róg znajduje się w początku układu odniesienia przestrzennego.</li>
	<li>Uruchom 40-sekundową sekwencję zdarzeń opisaną w sekcji 4.2 i na Rycynie 3 poprzez włączenie generatora prądu, a jednocześnie ręcznie uruchom sekwencję akwizycji obrazów dla Wideo 1.</li>
	<li>Przesuń kapilarę do sąsiedniego pola po prawej stronie, przesuwając stolik mikroskopu o 250 µm w lewo, a następnie postępuj zgodnie z sekcją 5.3, aby wygenerować Wideo 2 dla przekroju 2 i tak dalej, aż do uzyskania wymaganych nagrań. Zazwyczaj wzdłuż osi x zbiera się od 3 do 4 pól o wymiarach 250 x 250 µm2 przed zmianą płaszczyzny i powtórzeniem tych samych czynności dla nowej płaszczyzny.</li>
</ol>
6. Kalibracja siły
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór glicerolu, mieszając 39,8 g glicerolu z 190 µl wody dwukrotnie destylowanej oraz 10 μl cząstek magnetycznych o stężeniu 2 x 109 cząstek/ml; wypełnij tym roztworem kanał eksperymentalny i umieść go na stoliku mikroskopu zgodnie z opisem dla próbki biofilmu.</li>
	<li>Po zainstalowaniu pęsety magnetycznej zgodnie z instrukcjami w sekcji 4, przyłóż siłę magnetyczną zgodnie z sekcją 5.4 i wykonaj zdjęcia w odstępach czasowych (time-lapse), aby wyznaczyć prędkość (v) każdej pojedynczej cząstki oraz jej pozycję w kapilarze w celu opracowania pliku kalibracyjnego. Plik ten powinien zawierać przyłożoną siłę jako funkcję jej pozycji w strefie analizy kapilary zgodnie z prawem Stokesa: F = 6πRηv (R: promień cząstki).</li>
</ol>
7. Analiza
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania do śledzenia cząstek („particle tracker”), aby uzyskać pliki tekstowe z pozycjami cząstek w każdej klatce dla wszystkich stosów obrazów pozyskanych zgodnie z opisem w sekcji 5. Wykorzystując częstotliwość akwizycji stosu obrazów, oblicz przemieszczenie cząstek jako funkcję czasu (np. Rysunek 5 i Wideo 4).</li>
	<li>Korzystając z pliku kalibracji siły, przekształć krzywe przemieszczenia w krzywe podatności (całkowita podatność materiału — J(t)— jako funkcję czasu) zgodnie z wzorem na podatność: 
	<img alt="Równanie przedstawiające J(t)=d(t)(6πR/F); pomiar dynamiczny; wzór fizyczny." fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq1.jpg" width="106" data-altupdatedat="1787630408000"> 
	który określa zależność między odkształceniem materiału a przyłożonym naprężeniem dla cząstki sondy o promieniu R zanurzonej w nieściśliwym, jednorodnym medium wiskoelastycznym, zgodnie z ustaleniami Schnurra i współpracowników19.</li>
	<li>Dopasuj krzywe podatności pełzania do ogólnego modelu Burgersa dla materiałów wiskoelastycznych i wyznacz parametry wiskoelastyczne J0, J1, η0, η1 dla każdej cząstki (Rysunek 6) zgodnie z wzorem Burgersa: 
	<img alt="Równanie wiskoelastyczności, wzór J(t), modelowanie odpowiedzi materiału zależnej od czasu." fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq2.jpg" width="169" data-altupdatedat="1787630408000"> 
	Uwaga: Ta analiza fenomenologiczna była wcześniej stosowana dla szerokiego zakresu materiałów, w tym materiałów biologicznych takich jak biofilmy, w celu interpretacji makroskopowych danych reologicznych20-22.</li>
</ol>

<ol><li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Battling+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+American%22%5BJournal%5D)">Battling biofilms.</a> Scientific American. 285, 74-81 (2001).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear%3A+an+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).</li>
<li>Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+fluid+description+of+bacterial+biofilm+material+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties.</a> Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).</li>
<li>Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniaxial+compression+measurement+device+for+investigation+of+the+mechanical+stability+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological%22%5BJournal%5D)">Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms.</a> Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).</li>
<li>Cense, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+failure+of+Streptococcus+mutans+biofilms%2C+studied+using+a+microindentation+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological+methods%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device.</a> Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).</li>
<li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Physical Review Letters. 93, (2004).</li>
<li>Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+a+mixed+culture+biofilm+from+rheometer+creep+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis.</a> Biofouling. 19, 279-285 (2003).</li>
<li>Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitation+of+bacterial+biofilm+adhesion+and+viscoelasticity+by+microbead+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).</li>
<li>Poppele, E. H., Hozalski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-cantilever+method+for+measuring+the+tensile+strength+of+biofilms+and+microbial+flocs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological+methods%22%5BJournal%5D)">Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs.</a> Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).</li>
<li>Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+testing+of+a+novel+microcantilever+technique+for+measuring+the+cohesive+strength+of+intact+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms.</a> Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).</li>
<li>Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGu%C3%A9lon%2C+T+%22Series+on+Biofilms+%28eds+Hans-Curt+Flemming%2C+Jost+Wingender%2C+%26+Ulrich+Szewzyk%29%22">Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk)</a>. 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Galy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Bacterial+Biofilm+Local+Mechanics+by+Magnetic+Microparticle+Actuation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation.</a> Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).</li>
<li>Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Microscopic+Viscoelasticity+in+Flexible+and+Semiflexible+Polymer+Networks+from+Thermal+Fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations.</a> Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).</li>
<li>Aggarwal, S., Hozalski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Strain+Rate+on+the+Mechanical+Properties+of+Staphylococcus+epidermidis+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms.</a> Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).</li>
<li>Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+fluid-biofilm+interaction+using+a+Burger+material+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).</li>
<li>Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+antimicrobial+treatments+change+the+viscoelastic+properties+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms.</a> Biofouling. 27, 207-215 (2011).</li>
<li>Apgar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-particle+tracking+measurements+of+heterogeneities+in+solutions+of+actin+filaments+and+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles.</a> Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Ten eksperyment z zasiewaniem i ciągnięciem cząstek magnetycznych umożliwił mapowanie in situ 3D parametrów lepkosprężystych rosnącego biofilmu w jego pierwotnym stanie. Podejście to ujawniło mechaniczną niejednorodność wyhodowanego tu biofilmu E. coli i dało wskazówki do wskazania składników biofilmu wspierających właściwości fizyczne biofilmu, silnie sugerując fundamentalne implikacje macierzy zewnątrzkomórkowej, a dokładniej jej stopień usieciowania.
Rozpoznanie wzorców wł...

Biofilmy bakteryjne to społeczności bakterii związane z powierzchniami biologicznymi lub sztucznymi1-3. Tworzą się one w wyniku mechanizmu adhezyjno-wzrostowego połączonego z wytwarzaniem bogatej w polisacharydy macierzy zewnątrzkomórkowej, która chroni i stabilizuje gmach4,5. Te biofilmy nie są po prostu pasywnymi zbiorowiskami komórek przyklejonych do powierzchni, ale zorganizowanymi i dynamicznymi złożonymi systemami biologicznymi. Kiedy bakterie przechodzą ze stylu życia z planktonu na biofilm, obserwuje się zmiany w ekspresji genów i fizjologii komórki, a także zwiększoną oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe i obronę immunologiczną gospodarza, które są przyczyną wielu uporczywych i przewlekłych infekcji6. Jednak kontrolowany rozwój tych żywych struktur stwarza również możliwości zastosowań przemysłowych i środowiskowych, takich jak bioremediacja składowisk odpadów niebezpiecznych, biofiltracja wody przemysłowej lub tworzenie barier biologicznych w celu ochrony gleby i wód gruntowych przed zanieczyszczeniem.
Podczas gdy cechy molekularne charakterystyczne dla sposobu życia biofilmu są coraz częściej opisywane, mechanizmy napędzające rozwój i przetrwanie społeczności pozostają niejasne. Korzystając z najnowszych osiągnięć pomiarów w mikroskali za pomocą skaningowej mikroskopii elektrochemicznej lub fluorescencyjnej, wykazano, że te żywe organizacje wykazują znaczną niejednorodność strukturalną, chemiczną i biologiczną7. Jednak do tej pory mechanika biofilmu była badana głównie makroskopowo. Na przykład obserwacja deformacji serpentyn biofilmu spowodowanych zmianami natężenia przepływu płynu8,9, jednoosiowe ściskanie fragmentów biofilmu podniesionych z podłoża agarowego lub wyhodowanych na szkiełkach nakrywkowych10,11, ścinanie biofilmu pobranego z otoczenia, a następnie przeniesionego do reometru z równoległą płytką12,13, spektroskopia sił atomowych przy użyciu szklanego kulki i pokryta biofilmem bakteryjnym przymocowanym do wspornika AFM14 lub dedykowaną metodę mikrokantylową do pomiaru wytrzymałości na rozciąganie oderwanych fragmentów biofilmu15,16 zostały wdrożone w ciągu ostatnich dziesięciu lat, dostarczając użytecznych informacji na temat lepkosprężystego charakteru materiału17. Wydaje się jednak prawdopodobne, że informacje na temat właściwości mechanicznych biofilmu in situ są tracone po usunięciu materiału z jego rodzimego środowiska, co często miało miejsce w przypadku tych podejść. Co więcej, traktowanie biofilmu jako materiału jednorodnego pomija informacje na temat możliwej niejednorodności właściwości fizycznych w obrębie społeczności. W związku z tym trudno jest rozpoznać dokładne implikacje mechaniki struktury w tworzeniu biofilmu i cech biologicznych, takich jak wzorzec ekspresji genów lub gradienty chemiczne. Aby osiągnąć postęp w kierunku opisu właściwości fizycznych biofilmu w mikroskali, potrzebne są nowe, dedykowane narzędzia.
Ten artykuł opisuje oryginalne podejście opracowane w celu osiągnięcia pomiaru lokalnych parametrów mechanicznych in situ, bez naruszania biofilmu i umożliwienia narysowania przestrzennego rozkładu właściwości materiału w mikroskali, a następnie mechanicznej niejednorodności. Zasada eksperymentu opiera się na domieszkowaniu rosnącego biofilmu mikrocząstkami magnetycznymi, a następnie ich zdalnym ładowaniu za pomocą pęsety magnetycznej do dojrzałego biofilmu. Przemieszczenie cząstek pod kontrolowanym przyłożeniem siły magnetycznej zobrazowane pod mikroskopem umożliwia lokalne wyprowadzenie parametrów lepkosprężystości, przy czym każda cząstka zgłasza swoje własne lokalne środowisko. Na podstawie tych danych można narysować trójwymiarowy profil mechaniczny biofilmu, ujawniając zależności od warunków przestrzennych i środowiskowych. Cały eksperyment zostanie pokazany na biofilmie E. coli wytworzonego przez genetycznie zmodyfikowany szczep przenoszący stłumiony plazmid podobny do F. Wyniki wyszczególnione w niedawno opublikowanym artykule18 dostarczają unikalnej wizji wnętrza nienaruszonej mechaniki biofilmu.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 1: Odczynniki i komórki Cząstki</td></tr><tr><td>magnetyczne Technologie</td><td>życiowe</td><td>14307D</td><td>Mikrometryczna cząstka magnetyczna, 2,8 i mikro; średnica m</td></tr><tr><td>Ampicylina (antybiotyk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina (antybiotyk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Szczep bakteryjny MG1655gfpF</td><td>UGB, Instytut Pasteura, Francja</td><td></td><td>Wytwarza na swojej powierzchni F pilus, odporny na ampicylinę i tetracyklinę.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2: Kapilary i rurki</td></tr><tr><td>Filtry do perfuzji pediatrycznej</td><td>Prodimed-plastimed</td><td>6932002</td><td></td></tr><tr><td>Puste kwadratowe kapilary</td><td>Kompozyt Metal Scientific</td><td>8280-100</td><td>Wyprodukowane ze szkła borokrzemianowego. Kwadrat 0,8 mm x 0,8 mm</td></tr><tr><td>Rurka peroksyd silikonowy</td><td>VWR international</td><td>228-0512</td><td>Średnica 1 mm</td></tr><tr><td>Rurka nadtlenkowa silikonowa</td><td>VWR international</td><td>228-0700</td><td>Średnica 3 mm</td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>Tabela 3:</mocny> Wzrost biofilmu</td></tr><tr><td>Roztwór bulionu lizogenicznego (LB)</td><td>Amresco-VWR</td><td>J106-10PK</td><td>Standardowe podłoże używane do hodowli bakterii.</td></tr><tr><td>Roztwór M63B1</td><td>Domowe</td><td></td><td>standardowe minimalne podłoże używane do hodowli bakterii.</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Służy do wytwarzania pożywki M63B1 z 0,4% glukozy.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 4: Elektronika</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD&nbsp; &nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-02</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik grzałki</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>300354</td><td></td></tr><tr><td>Generator funkcyjny</td><td>Agilent technologies</td><td>33210A</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz mocy</td> domowej <td>roboty</td><td></td><td>Daje sygnał prądowy o amplitudzie do 4 A.</td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe</td><td>Kd Scientific</td><td>KDS-220</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz T132</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta magnetyczna</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>Dwa bieguny elektromagnetyczne, każdy wykonany z cewki miedzianej z 2,120 zwojami drutu miedzianego o średnicy 0,56 mm i rdzeniami ze stopu miękkiego magnetycznego (Supra50-Arcelor Mittal, Francja) w kształcie kwadratu zgodnie z planem pokazanym na Rysunek 10. Dwa rdzenie są zamontowane na biegunie północnym skierowanym w stronę bieguna południowego, w celu wytworzenia siły magnetycznej w jednym kierunku wzdłuż długości kapilary. Zobacz szczegóły okablowania cewki na Rysunek 11.</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 5: Optyka</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TE-300</td><td></td></tr><tr><td>S Fluor x40 Obiektyw (NA 0.9, WD0.3)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Jest to obiektyw o dużej długości roboczej, umożliwiający obserwację biofilmu w głębi.</td></tr><tr><td>Filtry epifluorescencyjne: 1) dla zielonej fluorescencji: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20&nbsp; 2) dla czerwonej fluorescencji: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55</td><td>Chroma</td><td>1)#49020 2)#31002</td><td>Przemieszczenie cząstek po przyłożeniu siły jest rejestrowane za pomocą czerwonego bloku filtra fluorescencyjnego.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 6: Analiza obrazu</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH - wtyczka</td><td></td><td></td> do śledzenia cząstek</tr></tbody></table>

zdalne uruchamianie magnetyczne sond mikrometrycznych do mapowania 3d in situ właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Przyleganie bakterii i wzrost na granicy faz prowadzą do powstawania trójwymiarowych, heterogenicznych struktur, tzw. biofilmów. Komórki żyjące w tych strukturach są utrzymywane razem przez oddziaływania fizyczne, w których pośredniczy sieć zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych. Biofilmy bakteryjne mają wpływ na wiele rodzajów działalności człowieka, a zrozumienie ich właściwości ma kluczowe znaczenie dla lepszej kontroli ich rozwoju – utrzymania lub eliminacji – w zależności od ich niekorzystnych lub korzystnych skutków. W artykule opisano nowatorską metodologię mającą na celu pomiar in situ lokalnych właściwości fizycznych biofilmu, która do tej pory była badana jedynie z perspektywy makroskopowego i jednorodnego materiału. Opisany tutaj eksperyment polega na wprowadzeniu cząstek magnetycznych do rosnącego biofilmu w celu wysiewu lokalnych sond, które mogą być zdalnie uruchamiane bez naruszania właściwości strukturalnych biofilmu. Opracowano dedykowane pęsety magnetyczne, które wywierają określoną siłę na każdą cząstkę osadzoną w biofilmie. Zestaw jest zamontowany na stoliku mikroskopu, aby umożliwić rejestrację obrazów poklatkowych z okresu przyciągania cząstek. Trajektorie cząstek są następnie wyodrębniane z sekwencji ciągnącej, a lokalne parametry lepkosprężyste są wyprowadzane z każdej krzywej przemieszczenia cząstek, zapewniając w ten sposób przestrzenny rozkład parametrów 3D. Uzyskanie wglądu w profil mechaniczny biofilmu jest niezbędne z punktu widzenia inżyniera do celów kontroli biofilmu, ale także z fundamentalnej perspektywy, aby wyjaśnić związek między właściwościami architektonicznymi a specyficzną biologią tych struktur.

Typowa analiza pozwala na określenie rozkładu przestrzennego parametrów wiskoelastycznych w skali mikronowej w obrębie żywego biofilmu, bez naruszania jego pierwotnej struktury. Typowe wyniki przedstawiono na Rysunku 7, gdzie wartości J0 — podatności sprężystej — podano jako funkcję osi z wzdłuż głębokości oraz osi y wzdłuż wymiaru poprzecznego biofilmu. Każdy punkt odpowiada kuleczce, dla której analiza krzywej pełzania dostarczyła wartości J0. Dane wykazały, że lokalna podatność z...

Ten artykuł pokazuje oryginalną metodologię opartą na zdalnym uruchamianiu cząstek magnetycznych osadzonych w biofilmie bakteryjnym oraz rozwoju dedykowanych pęset magnetycznych do pomiaru in situ lokalnych właściwości mechanicznych złożonego żywego materiału zbudowanego przez mikroorganizmy na granicy faz.

Zdalne uruchamianie magnetyczne sond mikrometrycznych do mapowania 3D in situ właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie w C dwóch pomiarów lokalnych właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego w skali mikrometrycznej. W tym celu do rosnącego biofilmu wprowadza się cząstki magnetyczne, które służą jako sondy umożliwiające zdalne sterowanie bez zaburzania właściwości strukturalnych biofilmu. Następnie wykorzystuje się dedykowane pęsety magnetyczne, aby przyłożyć określoną siłę do każdej cząstki.W przypadku cząsteczek osadzonych w biofilmie, przemieszczenie cząstek indukowane przyciąganiem magnetycznym jest monitorowane za pomocą mikroskopii wideo w celu wyznaczenia lokalnych parametrów wiskoelastycznych oraz uzyskania trójwymiarowego rozkładu przestrzennego właściwości mechanicznych biofilmu. Uzyskane wyniki wykazują heterogeniczność mechaniczną biofilmu z bakterii E. coli i dostarczają informacji o tym, które komponenty biofilmu odpowiadają za jego właściwości fizyczne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, reologia czy analiza całego biofilmu, jest możliwość określenia przestrzennego rozkładu właściwości mechanicznych in situ, bez naruszania oryginalnej struktury materiału.Aby przygotować c

remote-magnetic-actuation-micrometric-probes-for-situ-3d-mapping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zdalne magnetyczne sterowanie sondami mikrometrycznymi do in situ 3D mapowania fizycznych właściwości biofilmów bakteryjnych

Tutaj prezentujemy protokół wyjaśniający użycie mikroskopii siły sondy Kelvina jako narzędzia do generowania wysokiej rozdzielczości nanoskalowych map potencjału powierzchniowego. Narzędzie to zastosowano do oceny wpływu potencjału powierzchniowego na zdolność wiązania mikroorganizmów z powierzchniami podłoża.

Pomiar potencjału powierzchniowego bakterii za pomocą mikroskopii sił sondy Kelvina

Mikroreologia śledząca cząstki bada lepkosprężystość materiałów. W tym przypadku technika ta jest wykorzystywana do określania lepkosprężystości, podatności pełzania i efektywnych ról sieciowania różnych składników matrycy biofilmu bakteryjnego. Matryca składa się z substancji polimerowych wydzielanych przez bakterie, a jej składniki decydują o budowie biofilmu i właściwościach mechanicznych.

In Situ Mapowanie właściwości mechanicznych biofilmów za pomocą mikroreologii śledzącej cząstki

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

To badanie przedstawia nowy protokół bezpośredniego przykładania siły mechanicznej do jądra komórkowego za pomocą mikrokulek magnetycznych dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.

Połączenie siłownika siły magnetycznej 3D i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra

Mikroskopia siły magnetycznej (MFM) wykorzystuje pionowo namagnesowaną sondę mikroskopową sił atomowych do pomiaru topografii próbki i lokalnego natężenia pola magnetycznego z rozdzielczością nanoskali. Optymalizacja rozdzielczości przestrzennej i czułości MFM wymaga zrównoważenia zmniejszającej się wysokości podnoszenia ze zwiększającą się amplitudą napędu (oscylacji) i korzyści płynących z pracy w komorze rękawicowej w atmosferze obojętnej.

Optymalizacja rozdzielczości i czułości mikroskopii sił magnetycznych w celu wizualizacji domen magnetycznych w nanoskali

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Ten artykuł przedstawia obszerny protokół dla PmbExM, techniki mikroskopii ekspansyjnej zaprojektowanej specjalnie dla biofilmów Proteus mirabilis. PmbExM wykorzystuje stopniową obróbkę enzymatyczną próbek biofilmu w celu uzyskania izotropowej, 4,3-krotnej ekspansji, umożliwiającej analizę w superrozdzielczości organizacji przestrzennej struktur komórkowych i subkomórkowych w tych siedzących zbiorowiskach drobnoustrojów.

Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Przedstawiono metodę nałożenia topografii powierzchniowej pochłaniającej światło materiałów kompozytowych polimerowych, szczególnie magnetoaktywnych elastomerów (MAE), za pomocą mikroobróbki laserowej. Ta metoda umożliwia dużą elastyczność w projektowaniu topograficznym i szybkim prototypowaniu. Przedstawiono przykład strukturyzacji powierzchni MAE, charakteryzacji oraz ich reakcji na zewnętrzne pole magnetyczne.

Mikroobróbka laserowa do projektowania topografii powierzchni polimerów

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Poznaj metodę zdalnego uruchamiania magnetycznych sond do mapowania właściwości fizycznych biofilmu E. coli in situ. Technika ta umożliwia nieinwazyjne pomiary lepkości sprężystości w skali mikrometrycznej.

Zdalne uruchamianie magnetyczne sond mikrometrycznych do mapowania 3D in situ właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego

Przeglądaj więcej filmów