Zdalne uruchamianie magnetyczne sond mikrometrycznych do mapowania 3D in situ właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie w C dwóch pomiarów lokalnych właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego w skali mikrometrycznej. W tym celu do rosnącego biofilmu wprowadza się cząstki magnetyczne, które służą jako sondy umożliwiające zdalne sterowanie bez zaburzania właściwości strukturalnych biofilmu. Następnie wykorzystuje się dedykowane pęsety magnetyczne, aby przyłożyć określoną siłę do każdej cząstki.

W przypadku cząsteczek osadzonych w biofilmie, przemieszczenie cząstek indukowane przyciąganiem magnetycznym jest monitorowane za pomocą mikroskopii wideo w celu wyznaczenia lokalnych parametrów wiskoelastycznych oraz uzyskania trójwymiarowego rozkładu przestrzennego właściwości mechanicznych biofilmu. Uzyskane wyniki wykazują heterogeniczność mechaniczną biofilmu z bakterii E. coli i dostarczają informacji o tym, które komponenty biofilmu odpowiadają za jego właściwości fizyczne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, reologia czy analiza całego biofilmu, jest możliwość określenia przestrzennego rozkładu właściwości mechanicznych in situ, bez naruszania oryginalnej struktury materiału.

Aby przygotować cząstki magnetyczne do tego protokołu, wymieszaj w wirówce typu vortex fiolkę z zapasem cząstek o rozmiarze 2,8 µm w celu ich resuspensji. Następnie przenieś 10 µL do probówki do mikrocentryfugi. Aby wypłukać cząstki, dodaj 190 µL medium minimalnego i zakręć probówką, umieść ją na magnetycznym statywie do próbek, odczekaj do utworzenia osadu i odessij nadsącz.

Powtórz ten krok płukania jeszcze dwa razy, a następnie zawiesić ponownie kuleczki w 190 µL minimalnego podłoża. Następnie dodaj 950 µL pożywki M 63 B 1 z 0,4% glukozy do 50 µL roztworu wypłukanych kuleczek, aby dostosować stężenie cząsteczek do około 5 milionów kuleczek na mililitr. Aby przygotować kanał, użyj diamentowego przecinaka do szkła, aby odciąć dwie kwadratowe kapilary ze szkła borokrzemianowego o długości 10 cm, uzyskując dwa fragmenty o długości 8 cm.

Za pomocą przecinaka do szkła przetnij szkiełko przedmiotowe na pół. Następnie, używając szybko utwardzającego kleju cyjanoakrylowego lub superglue, przymocuj dwa fragmenty kapilar do dwóch kawałków szkiełka przedmiotowego, zgodnie z przedstawionym na schemacie rysunkiem. Zachowując odstęp 2 cm i 1 cm występu na każdym z końców, poddaj autoklawowaniu cały zestaw wraz z wymaganym okablowaniem rurek.

W celu dalszego połączenia kanałów, przygotuj następujące sterylne materiały pod laminarnym przepływem powietrza: zamontowane rurki i złącza kanałów, dwa filtry pęcherzykowe lub pułapki dla pediatrii, dwa zaciski, strzykawki o pojemności 30 ml wypełnione M 63 B, 1,4% glucose oraz butelkę na odpady.

Połącz obie kapilary w ten sam sposób, używając jednej z rurek. Podłącz butelkę na odpady do jednego końca kapilary.

Następnie, używając złączy Luer-lock jako połączeń, podłącz drugi koniec kapilary do wykonanej samodzielnie pułapki na pęcherzyki powietrza lub połącz pułapkę pierwszą z pułapką drugą. Następnie podłącz strzykawkę 30 ml z medium M 63 B1 do pułapki drugiej. Następnie napełnij układ sterylnym medium M 63 B1 z 0,4% glucose.

Zamontuj strzykawkę w pompie strzykawkowej i uruchom pompę z prędkością o około pięć mililitrów na godzinę wyższą niż prędkości eksperymentalne. Uważnie monitoruj i w razie potrzeby usuwaj wszystkie pęcherzyki powietrza z układu. W trakcie wykonywania tej procedury rozłącz i ponownie połącz układ.

Należy upewnić się, że przed i podczas wprowadzania mieszaniny cząstek komórkowych do rurek usunięto wszelkie pęcherzyki powietrza; pomocne jest umieszczenie zbiornika z odpadami powyżej kapilar, co sprzyja ciągłemu wzrostowi biofilmu. Pozostawić pożywkę do przepływu przez system przez 10 do 15 minut. W międzyczasie, w probówce do mikrocentryfugi, zmieszać 1 ml zawiesiny bakteryjnej o gęstości optycznej 0,5 z 1 ml wcześniej przygotowanego roztworu przemytych kulek.

Wyłącz przepływ, podłącz ponownie rurki, a następnie zamknij zaciski. Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml mieszaniną kulek z bakteriami i wprowadź ją do kapilary. Po przejściu przez domowej roboty pułapkę na pęcherzyki powietrza, przenieś aparat pod mikroskop.

Zainstaluj kapilarę na stoliku mikroskopu i umieść pojemnik na odpady na nieco wyższym poziomie. Postaw pompę strzykawkową na blacie obok mikroskopu. Pozostaw aparat na 15 do 20 minut, aby bakterie mogły osiąść i przytwierdzić się do powierzchni kapilary.

Po przyczepieniu się bakterii do kapilary, należy otworzyć zaciski, ustawić prędkość przepływu na pompie strzykawkowej i rozpocząć przepływ. W ciągu 24 do 48 godzin na powierzchni kapilary rozwinie się biofilm; należy ustawić ostrość na dolnej płaszczyźnie kapilary i rozpocząć rejestrację obrazów próbki w trybie poklatkowym. Zazwyczaj częstotliwość akwizycji wynosząca dwa obrazy na minutę będzie wystarczająca do udokumentowania wzrostu biofilmu.

Film ten przedstawia początkowy etap tworzenia biofilmu tuż po wstrzyknięciu mieszaniny komórek i cząsteczek. Podczas akwizycji w kapilarze częstotliwość wynosi jeden obraz na sekundę, a film jest odtwarzany w tempie 10 klatek na sekundę. Po czterech godzinach wzrostu cząsteczki stopniowo odrywały się od powierzchni, rozprzestrzeniając się w objętości biofilmu.

Niebieskie strzałki oznaczają zdarzenia odrywania. Częstotliwość akwizycji wynosi tutaj dwa obrazy na minutę, a film jest odtwarzany w tempie 15 klatek na sekundę. Po 20 godzinach wzrostu w płaszczyźnie ogniskowania można monitorować kilkanaście równomiernie rozmieszczonych cząstek.

Nagranie wykonano w płaszczyźnie środkowej, 20 µm nad dnem kapilary. Przechwytywano dwa obrazy na minutę. Film jest odtwarzany z prędkością 15 klatek na sekundę.

Gdy biofilm zaszczepiony cząstkami magnetycznymi zacznie rosnąć w sposób manualny, przykręć pęsetę magnetyczną do stolika mikroskopu. Aby zapewnić wytworzenie odpowiednich gradientów pola magnetycznego w strefie obserwacji, upewnij się, że pęseta jest umieszczona zgodnie z tym schematem, na którym zaznaczony na czerwono obszar pomiarowy znajduje się 300 micrometers od krawędzi lewego i prawego bieguna pęsety wzdłuż osi Y. Dno kapilary powinno znajdować się 200 micrometers poniżej dolnej krawędzi pęsety.

Aby wykonać ten krok, należy użyć sterowania ruchem XY stolika mikroskopu, aby zbliżyć krawędź lewego bieguna magnetycznego do lewej krawędzi kapilary. W tym samym polu widzenia należy ustawić położenie bieguna w odległości 300 mikrometrów od krawędzi kapilary, korzystając z pokrętła osi x lewego mikromanipulatora pincety. Tę samą operację należy przeprowadzić po prawej stronie.

Następnie należy dostosować pozycję pęsety wzdłuż osi Z względem dna kapilary. Najpierw wyrównaj dno biegunów z dnem kapilary, a następnie przesuń bieguny o 200 micrometers w górę.

Używając pokrętła Z mikromanipulatora, ustaw parametry generatora funkcji na 20 s sygnału zerowego i 16 s czterech amperów. Prąd stały z wyzwalaczem. Wyślij do migawki światła w jasnym polu po 20 s.

W celu synchronizacji sygnału należy podłączyć pęsetę do generatora funkcji za pomocą wzmacniacza mocy. Należy zwrócić uwagę na prawidłowe szeregowe połączenie biegunów, aby uzyskać przestrzennie rozproszone krzywe pełzania. Należy wyznaczyć początek układu współrzędnych, przyjmując początek osi Z w wewnętrznej części dna kapilary.

Zanotuj pozycję kontrolną osi Z mikroskopu. Następnie zlokalizuj przecięcie osi X i Y, które są zdefiniowane odpowiednio przez krawędź kapilary oraz krawędź bieguna. Jest to punkt początkowy analizy.

Zanotuj współrzędne. Wszystkie kolejne współrzędne będą określane w odniesieniu do tego punktu początkowego. Po wzroście biofilmu, używając pokrętła mikrometrycznego, dostosuj pionową pozycję kapilary tak, aby pierwsza płaszczyzna znajdowała się od czterech do siedmiu mikrometrów nad dnem kapilary.

Ten przekrój odpowiada przekrojowi biofilmu, w którym początek układu odniesienia przestrzennego znajduje się w lewym górnym rogu. Następnie włącz generator prądu i ręcznie uruchom sekwencję akwizycji obrazów. Aby zainicjować 42. sekwencję zdarzeń, strumień obrazów pozyskany w tym miejscu musi odpowiadać danej płaszczyźnie oraz polu XY.

Po zarejestrowaniu sekwencji przesuń kapilarę, aby nagrać wideo nowego pola. Powtarzaj ten proces, aż uzyskasz wszystkie niezbędne filmy do analizy danych. Otwórz obrazy w programie ImageJ lub równoważnym oprogramowaniu do śledzenia cząstek dla wszystkich stosów obrazów uzyskanych dla wszystkich cząstek.

Przekształć obrazy w pliki tekstowe poprzez śledzenie przemieszczenia cząstek. Następnie, korzystając z oprogramowania do analizy danych, wykreśl krzywe przemieszczenia i przekształć je w krzywe podatności, w których całkowita podatność materiału JFT jest obliczana jako funkcja czasu zgodnie z przedstawionym tutaj wzorem na podatność. Wzór ten opisuje zależność między przyłożonym naprężeniem a odkształceniem materiału dla historycznej cząstki kulek, osadzonej w ośrodku lepkosprężystym i nieściśliwym, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami autora i jego współpracowników. Na podstawie dopasowania krzywej podatności pełzania do ogólnego modelu Burgersa dla materiałów lepkosprężystych wyznacz parametry lepkosprężyste J zero J one at the zero at the one prime, aby uzyskać rozkład przestrzenny właściwości lepkosprężystych biofilmu. Krzywe pełzania zbierano na różnych głębokościach w mikroobjętości biofilmu o wymiarach około 200 na 200 na 40 mikrometrów sześciennych. Typowe wyniki przedstawiono tutaj.

Wartości J zero, czyli podatności sprężystej, przedstawiono jako funkcję osi Z wzdłuż głębokości oraz osi y wzdłuż wymiaru bocznego biofilmu. Każdy punkt odpowiada koralikowi, dla którego analiza krzywej pełzania pozwoliła wyznaczyć wartość J zero. Dane wykazują, że lokalna podatność zmienia się wzdłuż głębokości biofilmu w zakresie prawie trzech rzędów wielkości.

Odnotowano również silną heterogeniczność boczną na wszystkich wysokościach biofilmu. Dane dostarczają także informacji o rozkładzie wartości podatności, który wykazuje rozległy i asymetryczny kształt. Porównanie tych wyników z wynikami uzyskanymi wcześniej dla innych polimerów biologicznych sugeruje, że właściwości mechaniczne biofilmu są zapewnione przez silnie sieciowane żele polimerowe.

W części C wykonano również dwa pomiary lokalnych właściwości biofilmu w różnych warunkach środowiskowych, takich jak niższa prędkość przepływu, co widać tutaj. Wartości podatności biofilmu hodowanego przy 0,1 mililitra na godzinę nadal wykazują silnie heterogeniczny profil mechaniczny. Jednak wyraźna zależność sztywności biofilmu od głębokości Z, zaobserwowana w biofilmie hodowanym przy jednym mililitrze na godzinę, zanikła.

Wyniki te wykazują znaczący wpływ warunków zewnętrznych na organizację biofilmu. Po obejrzeniu filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat mapowania właściwości lepko sprężystych biofilmu w kontrolowanych warunkach wzrostu.