Identyfikacja jakościowa kwasów karboksylowych, kwasów boronowych i amin przy użyciu fluoroforów krzyżowych

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie drobnocząsteczkowych czwórek flory w oparciu o tzw. geometrię krzyżową do analizy i jakościowego rozróżnienia analitów z kilku klas związków. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie roztworów tych czujników krzyżowych w kilku różnych rozpuszczalnikach, wykorzystując w ten sposób ich emisję w wysokim stopniu zależną od rozpuszczalnika. Drugim krokiem jest wystawienie tych roztworów na działanie interesujących analitów, w tym kwasów karboksylowych, kwasów onowych lub amin organicznych, które można dodawać w postaci stałej lub w roztworze.

Następnie połączone roztwory analitów czujników są naświetlane światłem ultrafioletowym o długości 365 nanometrów, co powoduje, że emitują światło w obszarze widzialnym. Te kolory emisji są fotografowane przy użyciu standardowej konfiguracji fotografii cyfrowej. Ostatnim krokiem jest wygenerowanie kolorowych paneli emisyjnych, które służą do wykrywania jakościowych różnic w emisji różnych roztworów analitów.

Docelowo ta metoda fluorescencyjna będzie przydatna do szybkiej identyfikacji popularnych analitów w przemyśle farmaceutycznym i spożywczym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak chromatografia, jest to, że może ona bezpośrednio analizować wysoce polarne anality bez konieczności podejmowania decyzji o pochodnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w rutynowej dziedzinie kontroli jakości, gdzie może być wykorzystana do szybkiego określenia, czy dobrze zdefiniowana kompozycja jest autentyczna, czy też została naruszona.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ sama metoda wykorzystuje detekcję optyczną, a ze względu na jej ostateczne zastosowanie angażuje niewyspecjalizowanych operatorów. Procedurę zademonstrują Abel z Buns Laboratory w Heidelbergu i Rio Color Lire z mojego laboratorium na Uniwersytecie w Houston. Obaj absolwenci najpierw przygotowują świeże roztwory podstawowe roślin krzyżowych od pierwszego do trzeciego o stężeniu 50 miligramów na 10 mililitrów, di chlorometanu i odstawiają na bok.

Odważyć 500 miligramów analitu kwasu karboksylowego w sześciu 16-mililitrowych fiolkach DR i dodać 16 mililitrów octanu etylu dichlorometanu, acetonitrylu nn, dimetyloformamidu, alkoholu izopropylowego lub metanolu. Następnie dodać 20 mikrolitrów roztworu podstawowego w kształcie krzyża do każdej fiolki i wstrząsnąć fiolką, jeśli jest niejednorodna, pozwól, aby odpowiedni roztwór osiadł. Umieść niezakorkowane fiolki na szklanej płytce pod lampą UV w odległości 60 centymetrów między obiektywem aparatu a fiolkami z próbkami.

Włącz lampę UV i wyłącz światło w pomieszczeniu. Rób zdjęcia, zmieniając czasy naświetlania od 0,25 do 15 sekund dla każdego roztworu, aby uzyskać obrazy odzwierciedlające kolor remisji. Następnie przygotować 1,0 razy 10 do ujemnego czwartego roztworu molowego w kształcie krzyża czwartego w di Chlorometan i odstawić.

Następnie przygotuj pięć oddzielnych roztworów dla każdego analitu kwasu onowego, rozpuszczając 50 miligramów analitu w trzech mililitrach acetonitrylu każdy. 1, 2, 4, trichlorobenzyna di chlorometan, cykloheina i chlorobenzyna. Przenieś 1,8 mililitra każdego z roztworów analitu do pięciu oddzielnych kuwet kwarcowych o wymiarach 10 na 10 milimetrów.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu w kształcie krzyża do każdej z pięciu kuwet i wymieszaj oba roztwory do homogenizacji. Jeśli zaobserwuje się jakiekolwiek opady, poczekaj, aż odpowiedni roztwór opadnie. Umieść wszystkich pięciu weterynarzy Q na szklanej płytce i naświetlaj ich od góry.

Używając ręcznej lampy UV 365 n, upewnij się, że pomieszczenie jest ciemne i natychmiast zrób cyfrowe zdjęcie kolorów emisji roztworów z odległością między obiektywem aparatu a kuwetami 45 centymetrów i czasem otwarcia migawki 0,5 sekundy. Następnie przygotuj co najmniej 80 mililitrów każdy 1,0 razy 10 do ujemnych sześciu roztworów molowych krzyża cztery w acetonitrylu 1 2 4, trichlorobenzen-cykloheksan di chlorometan i chloroform rozpuść 152,6 miligramów dwóch sześciu kwasów dwuchlorowych DI chlorofilu w 40 mililitrach każdego z roztworów w kształcie krzyża. Oddzielnie rozpuść 97,6 miligrama kwasu fenyloonowego w 40 mililitrach każdego z roztworów w kształcie krzyża.

Następnie rozpuść 40 miligramów pożądanego analitu aminowego w dwóch mililitrach każdego roztworu w kształcie krzyża kwasu onowego. Dla każdego analitu Amina przygotuj pięć roztworów z dwoma sześcioma kwasami di chlorofilowo-onowymi i pięcioma roztworami z kwasem fenyloonowym jako dodatkami. Przenieś podwielokrotności 10 przygotowanych roztworów do 10 oddzielnych kuwet kwarcowych.

Umieść dwa zestawy pięciu zestawów vete na szklanej płytce, naświetlaj na 365 nanometrów za pomocą ręcznego UV i natychmiast sfotografuj przy użyciu opisanych wcześniej ustawień za pomocą programu do przetwarzania obrazu. Wytnij reprezentatywny kwadratowy segment ze zdjęć cyfrowych kolorów emisji każdej sfotografowanej fiolki. Następnie uporządkuj te wycinanki w panele podobne do tych pokazanych tutaj.

Jeśli pożądane jest ilościowe określenie różnic w kolorze emisji, należy wyodrębnić wartości koloru czerwonego, zielonego, niebieskiego z paneli, a następnie poddać je statystycznej obróbce, aby uzyskać względne odchylenia standardowe kolorów emisji jednego analitu względem drugiego. Użyj poniższego równania. Na koniec użyj równania do identyfikacji nieznanych analitów kwasu karboksylowego i określenia odchylenia między nieznanym analitem a wszystkimi substancjami z zestawu danych kalibracyjnych przy użyciu fluoru krzyżowego od jednego do trzech w sześciu różnych rozpuszczalnikach, stwierdzono, że odpowiedzi fluorescencyjne są zależne od stężenia i tożsamości strukturalnej przedstawionego na zdjęciu kwasu karboksylowego.

Oto cyfrowo zarejestrowana barwa emisyjna wszystkich kombinacji kwasu karboksylowego z czterema rozpuszczalnikami flory. Ta tablica wykazuje 18 charakterystycznych kolorów emisji na analit, które można wykorzystać do jednoznacznego scharakteryzowania i analitu przy użyciu czerwonych, zielonych, niebieskich wartości koloru emisji. Wszystkie anality można rozróżnić w stosunku do kwasów karboksylowych, od jednego do 10 i zidentyfikować tak, jak pokazano na wykresie automatycznej korelacji tutaj, przy użyciu całkowicie analogicznej procedury.

Kwasy onowe od B jeden do B 9 można łatwo odróżnić od siebie za pomocą krzyża czwórki, o czym świadczy panel kolorów emisji i pokazany tutaj wykres korelacji. Analizę amin przeprowadza się przy użyciu dwóch utworzonych kompleksów w kształcie krzyża czterech z dużym nadmiarem dodatków kwasu onowego, dwóch sześciu kwasów di chlorofilowych i kwasu fenylonowego. Kompleksy te, których barwy emisyjne różnią się od barw czystego krzyża, mogą reagować na anality aminowe na dwa sposoby.

Środki bardziej zasadowe niż puryny wypierają czwórkę krzyżową z jej kompleksów dodatkami kwasu onowego, regenerując w ten sposób barwy emisyjne czystej niezłożonej czwórki krzyżowej. Z drugiej strony, mniej podstawowe gatunki wydają się wiązać z kompleksem kwasu onowego w kształcie krzyża, nie niszcząc go, a zdarzenie to powoduje modulację emisji fluorescencji kompleksów. Dlatego metodologia detekcji zastępczej charakteryzuje się efektem wyrównywania, w którym anality powyżej pewnego progu nie mogą być już od siebie odróżnione Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować kwasy karboksylowe, kwasy baroni i środki przy użyciu prostej konfiguracji wykorzystującej krzyżową siłę grypy w zestawie kilku różnych rozpuszczalników. Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi i lampami UV może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak korzystanie z dobrze wentylowanych pomieszczeń i okularów.