Metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych w Caenorhabditis elegans
4 lutego 2014
Przedstawiono podejścia do testowania działania leków przeciwpsychotycznych (APD) w Caenorhabditis elegans. Opisano testy do testowania wpływu leku na rozwój i żywotność oraz na szybkość pompowania gardła. Metody te mają również zastosowanie w eksperymentach farmakogenetycznych z klasami leków innymi niż APD.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu leków przeciwpsychotycznych na rozwój i pompowanie gardła przez Sea Elgana. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie populacji dorosłych nicieni i wygenerowanie z nich zsynchronizowanej populacji zwierząt. Następnym krokiem jest przeniesienie zsynchronizowanych jaj lub dorosłych osobników na płytki testowe z lekami.
Ostatnim krokiem jest obserwacja i ocena wpływu leków na robaki. Ostatecznie wyniki mogą wykazać, że leki przeciwpsychotyczne opóźniają rozwój i hamują pompowanie pokarmu gardłowego u zwierząt narażonych na działanie leków. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mechanizmy działania leków przeciwpsychotycznych, może być również stosowana do badania innych małych cząsteczek, a nawet dużych cząsteczek, takich jak lipidy Przygotuj interesujący Cię lek o znanym stężeniu roboczym.
Zacznij od załadowania 12-dołkowej płytki dwoma mililitrami NGM, pożywką na dołek. Odłóż talerz na bok, aby stwardniał w temperaturze pokojowej. Następnie wybierz kolonię bakterii OP 50 i przenieś ją do 50-mililitrowej butelki kultury LB.
Bakterie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min następnego dnia do każdego dołka przygotowanej płytki. Przy 20 mikrolitrach kultury bakteryjnej ustaw płytkę do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia. Załaduj każdą dobrze siedzącą osobę 80 mikrolitrami interesującego Cię leku o stężeniu roboczym.
W tym przypadku lekiem jest C Klozapina. Pamiętaj, aby zwirować roztwór przed przyjęciem porcji. Zamieszaj roztwór, aby równomiernie rozprowadzić go w studzience i pozwól mu wchłonąć się w temperaturze pokojowej przy zdjętej pokrywie płytki.
Następnie kontynuuj test lub przechowuj płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc i rozpocznij test następnego dnia. Zacznij od zebrania jaj z genotypu, który Cię interesuje. Zacznij od populacji robaków z wieloma dorosłymi GR.
Zmyj robaki w 3,5-centymetrowej płytce za pomocą bufora M nine. Następnie wiruj je w 15-mililitrowej tubie z prędkością 2000 obr./min przez jedną minutę. Usunąć supernatant przez aspirację i zastąpić go pięcioma mililitrami wybielacza.
Następnie delikatnie przekłóć dorosłe osobniki, odwracając rurkę i poczekaj, aż zwierzęta zaczną się rozpuszczać w sposób ciągły. Obserwuj rozpuszczające się robaki pod lunetą. Gdy około połowa robaków się rozpuści
.Po około pięciu minutach odkręć probówkę, aby zebrać jaja, odessać supernatant i szybko zastąp go buforem M nine. Następnie ponownie odkręć rurkę w dół, jak poprzednio, i usuń wszystko, z wyjątkiem około 100 mikrolitrów supernatantu M nine. Aby zawiesić jaja, przekręć rurkę wirowo.
Następnie przenieś dwa mikrolitry zawiesiny na płytkę NGM i policz liczbę przeniesionych jaj. Następnie załaduj na płytkę potraktowaną lekiem od 30 do 35 jaj na dołek i inkubuj płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po 24 godzinach oceń liczbę wyklutych jaj.
Jeśli w którymkolwiek z nich znajduje się więcej niż 25 robaków, dobrze usuń nadmiar robaków. Zwróć robaki na płytce do inkubatora w celu późniejszej obserwacji w odstępach 24-godzinnych każdego dnia, oceń etap rozwoju robaków w studzienkach na podstawie wielkości robaków i kształtu ich sromów. Silne efekty są zwykle widoczne w trzecim i czwartym dniu.
Eksperyment powinien trwać około tygodnia. Do tego protokołu przygotuj płytki do testów narkotykowych, jak opisano wcześniej, dzień wcześniej, rozpoczynając test. Wybierz 50 litrów zwierząt czteroetapowych dla każdego genotypu w eksperymencie.
Przenieś je na płytki NGM i inkubuj płytki przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia, co 15 do 20 minut, załaduj studzienkę testową 10 zwierzętami po tym, jak grupa była wystawiona na działanie leku przez pół godziny. Zacznij obserwować pompowanie ich gardła pod mikroskopem preparacyjnym.
Najpierw znajdź robaka, a następnie policz jego pompy gardłowe przez 20 sekund. Po zdobyciu punktów podnieś robaka z talerza. Naciąć wszystkie robaki w studni w ten sam sposób.
Oczekiwane wyniki przeprowadzenia opóźnienia eksperymentalnego. Test śmiertelności z kontrolami typu dzikiego powinien wykazać, że w przeciwieństwie do typowego tempa wzrostu do stadium dorosłego, zwierzęta narażone na działanie klozapiny c są nadal w młodych stadiach larwalnych lub są martwe, testowanie mutantów na różnych stężeniach klozapiny ujawniło mutanty supresorowe, takie jak mutanty nieme jeden i mutanty wzmacniające, takie jak MU dwa. Ogólnie rzecz biorąc, śmiertelność niemego pierwszego był niższy niż dzikiego, a śmiertelność MU dwa była wyższa zgodnie z oczekiwaniami w porównaniu z grupą kontrolną, u której przeżyły nieme zwierzęta, które są bardziej zdolne do rozwoju, podczas gdy nieme dwa zwierzęta, które przeżyły, są bardziej opóźnione.
Dalsze badania wykazały, że ekspozycja na klozapinę zmniejszała szybkość pompowania gardła w sposób zależny od stężenia. Jednak zmniejszony wskaźnik niemego pierwszego był mniejszy niż w przypadku typu dzikiego, podczas gdy zmniejszony wskaźnik niemego drugiego był większy niż w przypadku typu dzikiego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test leków przeciwpsychotycznych na małą skalę.
Wiadomość może być również skalowana w celu przeprowadzenia badań genetycznych na dużą skalę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł prezentuje podejścia do badania efektów działania leków przeciwpsychotycznych (APD) u Caenorhabditis elegans. Metody obejmują testy służące do oceny wpływu leków na rozwój, żywotność oraz częstotliwość pompowania gardzielowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- farmakologia
- biologia rozwojowa
Wstęp
- Caenorhabditis elegans jest organizmem modelowym wykorzystywanym do badania działania leków.
- Leki przeciwpsychotyczne mogą wpływać na procesy rozwojowe.
- Pompowanie gardzielowe jest kluczowym zachowaniem służącym do oceny wpływu leku.
- Za pomocą tych metod można przeprowadzać eksperymenty farmakogenetyczne.
Cel badania
- Zbadanie wpływu leków przeciwpsychotycznych na rozwój nicieni.
- Ocena wpływu tych leków na częstotliwość pompowania gardzieli.
- Przedstawienie informacji na temat mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych (APD).
Zastosowane metody
- Wyhodować populację dorosłych osobników Caenorhabditis elegans.
- Uzyskać zsynchronizowaną populację z dorosłych nicieni.
- Przenieść zsynchronizowane jaja lub osobniki dorosłe na płytki testowe z dodatkiem leku.
- Obserwować i oceniać wpływ leków na rozwój oraz zachowanie.
Główne wyniki
- Leki przeciwpsychotyczne opóźniają rozwój u eksponowanych nicieni.
- Pompowanie gardzieli jest hamowane u zwierząt traktowanych lekami.
- Wyniki mogą pomóc w zrozumieniu mechanizmów działania leków.
- Metody te mają zastosowanie do innych małych i dużych cząsteczek.
Wnioski
- Badanie dostarcza ram do testowania działania leków w modelu C. elegans.
- Uzyskane wnioski mogą znaleźć zastosowanie w różnych badaniach farmakologicznych.
- Metody te mogą zostać dostosowane do szerszych zastosowań poza zakresem APD.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Badania nad mechanizmem działania leków przeciwpsychotycznych w modelu C. elegans umożliwiają wczesną minimalizację ryzyka związanego z celem terapeutycznym poprzez powiązanie wyników fenotypowych ze szlakami neuromolekularnymi. Testy rozwojowe oraz testy pompowania gardzielowego zapewniają ilościowe, skalowalne odczyty służące do badania mechanizmu działania w biologii odkrywczej. Wspiera to pewność prognostyczną w walidacji celu i selekcji portfolio dla wskazań neuropsychiatrycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie ekspozycji na leki przeciwpsychotyczne z fenotypami opóźnienia rozwojowego i inhibicji gardzielowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie funkcjonalnej walidacji celów poprzez genetyczne przesiewy supresorów i enhancerów w celu identyfikacji modyfikatorów odpowiedzi na lek.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie mechanistycznej redukcji ryzyka poprzez ujawnienie efektów zależnych od stężenia w odniesieniu do konserwowanych wyników nerwowo-mięśniowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszych analiz przesiewowych za pomocą zsynchronizowanych procesów przygotowania embrionów oraz dorosłych osobników na różnych etapach rozwoju.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji analizy poprzez codzienne ocenianie etapów rozwoju oraz stosowanie protokołów 20-sekundowego liczenia skurczów pompy gardzielowej.
- Wartość skalowalności: Wykazanie gotowości do badań przesiewowych oraz możliwości ponownego wykorzystania platformy do testowania małych i dużych cząsteczek poza zakresem leków przeciwpsychotycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Omówienie znaczenia dla choroby poprzez zachowane geny syntezy neurotransmiterów i funkcji synaptycznych w genomie C. elegans.
- Ciągłość przedkliniczna: Opis przejścia od etapu odkrycia do walidacji fenotypowej w systemie całego organizmu istotnym dla przebiegu choroby.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Omówienie decyzji go/no-go opartych na mechanizmie, z wykorzystaniem śmiertelności rozwojowej i supresji tempa pompowania jako biomarkerów skuteczności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta sytuuje badania nad mechanizmami działania leków przeciwpsychotycznych na etapie od wczesnego odkrywania do identyfikacji wiodących związków, wspierając weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków w neurofarmakologii.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnienie, w jaki sposób metoda wspomaga testowanie hipotez poprzez określanie stadiów rozwojowych oraz kwantyfikację pompowania gardzielowego.
- Przesiewanie: Opis gotowości testu poprzez zsynchronizowany transfer jaj na płytki zawierające leki oraz codzienną ocenę fenotypową.
- Analityka: Przedstawienie wyników ilościowych, w tym oceny stadiów rozwojowych oraz liczby ruchów pompowania gardzieli na jednostkę czasu w celu porównania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Powiązanie metody z ciągłością przedkliniczną poprzez zachowane fenotypy nerwowo-mięśniowe, które pozwalają przewidzieć mechanizm działania leku.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawienie metody jako powtarzalnego narzędzia do badań nad mechanizmem działania w różnych obszarach terapeutycznych z wykorzystaniem przesiewania genetycznego i chemicznego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność w walidacji celu poprzez powiązanie fenotypowe efektów przeciwpsychotycznych z funkcją nerwowo-mięśniową.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zsynchronizowanym populacjom oraz określonym przedziałom punktacji rozwoju i zachowania.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki ograniczeniu niejednoznaczności mechanistycznej we wczesnym przesiewie leków przeciwpsychotycznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja dostosowana do ryzyka z wykorzystaniem opóźnienia rozwojowego i hamowania gardłowego jako translacyjnych punktów końcowych biomarkerów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli nicieni, synchronizacji oraz oceny fenotypowej pod mikroskopem stereoskopowym.
- Konieczne instrumentarium obejmuje inkubatory, mikroskopy oraz systemy do dozowania leków w testach na płytkach 12-dołkowych.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga wspólnych protokołów przygotowania jaj, nakładania leków oraz kryteriów określania stadium rozwojowego.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych obejmują zachowanie celów neurotransmiterowych oraz skalowanie testów do formatów o wyższej przepustowości.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czas trwania testu wynoszący około jednego tygodnia oraz wrażliwość na jakość lawns bakterii, która wpływa na kondycję nicieni.
