Name: Metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metody badania wpływu leków przeciwpsychotycznych na rozwój i pompowanie gardzieli u Caenorhabditis elegans. Techniki te pozwalają ocenić mechanizm działania substancji farmakologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta przez nagrodę NIH Clinical Scientist Development K08NS002083, grant Instytutu Badawczego Shervert Frazier oraz nagrodę NARSAD Young Investigator Award dla Edgara A. Buttnera.

1. Test opóźnienia rozwoju/śmiertelności: Szczepy typu dzikiego (N2) i dwa zmutowane (Mut1 i Mut2) są testowane w trzech stężeniach klozapiny na płytce 12-dołkowej
<ol>
	<li>W dniu 1 wlej 2 ml pożywki NGM10 do każdego dołka 12-dołkowej płytki (każda studzienka ma średnicę 2 cm) i pozostaw na noc do stwardnienia na stole w temperaturze pokojowej (RT). Tego samego dnia należy pobrać kolonię bakterii Escherichia coli OP50, zainfekować butelkę z 50 ml roztworu LB i wyhodować ją w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przy obrotach 220 obr./min przez noc.</li>
	<li>W dniu 2 przenieś 20 μl kultury bakteryjnej OP50 na środek każdej studzienki NGM. Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub pozostawić je na noc w temperaturze pokojowej, aby trawnik bakteryjny stał się grubszy.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy klozapiny o stężeniu 80 mM przez rozpuszczenie klozapiny w rozpuszczalniku DMSO (dimetylosulfotlenku). Następnie przygotować roztwór roboczy o stężeniu 80 μl z roztworem podstawowym rozcieńczonym w 1,7 mM kwasu octowego na podstawie tabeli 1. 
	Uwaga: Roztwór roboczy dla danego narkotyku będącego przedmiotem zainteresowania musi zostać określony poprzez wykonanie serii wstępnych testów stężenia w celu znalezienia najbardziej odpowiedniego stężenia dla odróżnienia typu dzikiego od mutantów.</li>
	<li>Przenieść 80 μl roztworu roboczego klozapiny na dobrze wysianą płytkę NGM i zakręcić płytką, aby roztwór mógł równomiernie rozprowadzić się na powierzchni. Poczekaj, aż talerz wyschnie. Płytkę należy użyć do oznaczenia tego samego dnia lub umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 20 °C, aby użyć jej następnego dnia. 
	Uwaga: Roztwór roboczy jest zawiesiną leku ze względu na niską rozpuszczalność klozapiny, zwłaszcza w wyższym stężeniu. Dlatego przed przeniesieniem roztworu na płytkę leku należy przetrząsnąć probówkę, aby zagwarantować, że stężenie leku jest dokładne.</li>
	<li>Zmyj robaki z 3,5 cm płytki zawierającej wiele ciężarnych dorosłych osobników z buforem M9, a następnie odwiruj je w probówce o pojemności 15 ml z prędkością 2 000 obr./min przez 1 minutę.</li>
	<li>Odessać supernatant. Dodać 5 ml roztworu wybielacza (NaOH:podchloryn:ddH2O w stosunku 4:1:5) i rozbić nicienie, delikatnie odwracając probówki.</li>
	<li>Obserwuj zwierzęta, aż połowa z nich się rozpuści po około 5 minutach. Obracaj jajka z prędkością 2,000 obr./min przez 1 minutę.</li>
	<li>Odessać supernatant i szybko dodać 14 ml buforu M9.</li>
	<li>Odwirowywać jaja z prędkością 2 000 obr./min przez 1 minutę i odessać supernatant, pozostawiając około 100 μl roztworu. Wiruj, aby zawiesić jaja.</li>
	<li>Przenieś 2 μl jaj zawieszonych w M9 na zwykłą płytkę NGM, aby sprawdzić, ile jaj zostało przeniesionych. Dostosuj objętość zawieszonych jaj, aby upewnić się, że w każdym transferze jest około 30-35 jaj. Przenieść 30-35 jaj do każdego dołka na płytce testowej, a następnie inkubować w inkubatorze o temperaturze 20 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>W pierwszym dniu testu należy ocenić liczbę wyklutych jaj. Dostosuj całkowitą liczbę wyklutych zwierząt do 25 dołków, usuwając dodatkowe robaki, jeśli to konieczne.</li>
	<li>W kolejnych dniach obserwuj zwierzęta i oceniaj je co 24 godziny. Etap rozwojowy jest oceniany na podstawie wielkości zwierzęcia i kształtu sromu11. Eksperyment trwa 5-6 dni, a najsilniejszy efekt obserwuje się zwykle trzeciego lub czwartego dnia.</li>
	<li>Wprowadź dane do pliku Excel i oblicz procent zwierząt na każdym etapie rozwoju dla każdego dnia eksperymentu. Generuj wykresy za pomocą funkcji "100% skumulowana kolumna" w menu "Kolumna 2-W".</li>
</ol>
2. Test pompowania gardła: młode dorosłe zwierzęta dla szczepów typu dzikiego i zmutowanego są oceniane na płytkach testowych z klozapiną
<ol>
	<li>Płytka testowa jest wykonywana zgodnie z tym samym protokołem, który jest używany do testu opóźnienia rozwoju/śmiertelności.</li>
	<li>Wybrać 50 zwierząt L4 dla każdego szczepu na wysiane płytki NGM na 24 godziny przed testem i inkubować robaki w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Wybierz 10 zwierząt do dołka na płytce testowej. Następnie co 15-20 minut wybieraj 10 zwierząt do następnej studni.</li>
	<li>Po tym, jak zwierzęta w pierwszej studzience były wystawione na działanie leku przez 30 minut, rozpocznij test, obserwując pompowanie gardła pod mikroskopem preparacyjnym i oceniaj pompy przez 20 sekund9. Po nacięciu pompowania gardła podnieś robaka z talerza.</li>
</ol>

<ol><li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+%28PI3K%29%2Finsulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li>
<li>Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).</li>
<li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+Caenorhabditis+elegans+genetics+for+understanding+human+psychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Harv.+Rev.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease.</a> Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).</li>
<li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Res%22%5BJournal%5D)">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li>
<li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+effects+of+clozapine%3A+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li>
<li>Saur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans+Identifies+the+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Subunit+ACR-7+as+an+Antipsychotic+Drug+Target%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target.</a> PLoS Genet. 9, (2013).</li>
<li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvery%2C+L+%22C.+elegans+feeding.+WormBook%2C+ed.+The+C.+elegans+Research+Community%2C+doi%3A10.1895%2Fwormbook.1.150.1%22">C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1</a>. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2012).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. 47, (2011).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).</li>
<li>Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).</li>
<li>Kage-Nakadai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+very+long+chain+fatty+acid+acyl-CoA+synthetase+genes%2C+acs-20+and+acs-22%2C+have+roles+in+the+cuticle+surface+barrier+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie ma tu do czynienia z konfliktem interesów.

W tym miejscu opisujemy metody testowania wpływu APD na rozwój i zachowanie C. elegans. DMSO lub etanol służy do rozpuszczania klozapiny, ponieważ lek jest stosunkowo nierozpuszczalny w wodzie. Ponieważ donoszono, że rozpuszczalniki wpływają na biologię C. elegans 12, niezbędne są grupy kontrolne z samym DMSO lub samym etanolem. Najwyższe stężenie DMSO stosowane w naszych testach wynosi do 3%, co nie ma oczywistego wpływu na rozwój C. elegans . DMSO może być stosowany do wielu małych...

Caenorhabditis elegans to prosty organizm genetyczny, który można poddać zakrojonym na szeroką skalę przesiewom genetycznym do przodu i do tyłu oraz chemicznym badaniom genetycznym. C. elegans jest wrażliwy na szerokie spektrum związków bioaktywnych i dlatego jest z powodzeniem stosowany do określania mechanizmów działania różnych takich związków. Na przykład związki bioaktywne badane za pomocą farmakogenetyki robaków obejmują agonistów receptora acetylocholiny (np. lewamizol, nikotynę, morintel i pyrantel), środki znieczulające (np. halotan), kofeinę, inhibitory cholinoesterazy (np. aldikarb, lannian i trichlorfon), fluor, związki pokrewne GABA (np. GABA i muscymol), iwermektynę, parakwat, estry forbolu i leki związane z serotoniną (np. serotoninę i imiprymina)3. Co więcej, C. elegans został wykorzystany do badań przesiewowych małych cząsteczek na dużą skalę, umożliwiając odkrycie nowych związków bioaktywnych i identyfikację nowych celów genetycznych4.
Genom C. elegans zawiera potencjalne cele leków przeciwpsychotycznych (APD) zachowane u ludzi, w tym geny kodujące białka niezbędne do syntezy neuroprzekaźników oraz struktury i funkcji synaptycznej5. W ten sposób neurogenetyka i neurobiologia C. elegans oferują metody odkrywania nowych molekularnych mechanizmów działania APD. U nicieni narażenie na APD we wczesnym okresie rozwoju powoduje opóźnienie rozwoju, a przy wyższych stężeniach śmiertelność2,6. Ekspozycja na APD w wieku dorosłym powoduje fenotypy behawioralne. Na przykład ekspozycja na klozapinę hamuje poruszanie się i pompowanie gardła oraz zwiększa składanie jaj1,2,7.
Opóźnienie rozwoju i śmiertelność wywołane przez APD są potężnymi fenotypami dla dużych chemicznych badań genetycznych. Te fenotypy są złożone o tyle, że prawdopodobnie mają więcej niż jedną podstawę komórkową i genetyczną. W związku z tym oczekuje się, że takie genetyczne badania przesiewowe dostarczą różnych pośrednich celów leków. Jednak nasze laboratorium przeprowadziło badania przesiewowe genów kandydujących i badanie przesiewowe RNAi całego genomu pod kątem supresorów opóźnienia rozwoju i śmiertelności wywołanej przez APD i z powodzeniem odzyskało geny, które prawdopodobnie kodują bezpośrednie cele, w tym receptory dopaminy, insuliny i nikotynowych receptorów acetylocholiny2,8. Genetyczne badania przesiewowe oparte na zachowaniach wywołanych przez APD u dorosłych doprowadziły również do identyfikacji nowych celów APD, a obecnie walidujemy cele zarówno z rozwojowych, jak i behawioralnych badań przesiewowych u ssaków7. W związku z tym chemiczne podejście genetyczne bezkręgowców w celu odkrycia nowych molekularnych mechanizmów działania APD wydaje się być wykonalne5,8.
Gardło C. elegans to narząd, który składa się z 20 neuronów, 20 komórek mięśniowych i 20 komórek dodatkowych, owiniętych błoną podstawną. Podobnie jak serce ssaków, gardło jest autonomiczne i stale pompuje pokarm ze środowiska zewnętrznego9. Zahamowanie tempa pompowania przez gardło upośledza wchłanianie pokarmu, a zatem mutacje lub leki, które hamują pompowanie przez gardło, powodują opóźnienie lub zatrzymanie rozwoju9. APD hamują tempo pompowania gardła, co częściowo odpowiada za ich wpływ na rozwój i żywotność1,2. Tutaj używamy nietypowej klozapiny APD jako przykładu, aby zademonstrować testy leków na rozwój nicieni i pompowanie gardła.

<table><tbody><tr><td>Clozapine</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy (HAC)</td><td>Fisher</td><td>BP2401</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>EMD</td><td>SX0590-13</td><td></td></tr><tr>Wirówka <td>425044</td><td></td><td>podchlorynu</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>5810</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1246-0006</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator niskotemperaturowy 815</td><td>Precision Scientific</td><td>J1790-1B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 35 x 10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9434271</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa Płytka do hodowli tkankowych</td><td>BD Falcon</td><td>REF 353043</td><td></td></tr></tbody></table>

metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych w caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans to prosty organizm genetyczny, który można poddać zakrojonym na szeroką skalę przesiewom genetycznym do przodu i do tyłu oraz chemicznym badaniom genetycznym. W ramach projektu C. Genom Elegans obejmuje potencjalne cele leków przeciwpsychotycznych (APD) zachowane u ludzi, w tym geny kodujące białka niezbędne do syntezy neuroprzekaźników oraz do struktury i funkcji synaptycznej. Narażenie na APD powoduje opóźnienie rozwoju i/lub śmiertelność nicieni w sposób zależny od stężenia. Te fenotypy są częściowo spowodowane indukowanym przez APD hamowaniem pompowania gardła1,2. Tak więc fenotyp rozwojowy ma podłoże nerwowo-mięśniowe, co czyni go przydatnym w badaniach farmakogenetycznych neuroleptyków. Tutaj przedstawiamy szczegółowe procedury testowania wpływu APD na rozwój nicieni i pompowanie gardła. W teście rozwojowym zsynchronizowane zarodki umieszcza się na płytkach z pożywką wzrostową nicieni (NGM) zawierającą APD, a następnie codziennie ocenia się etapy rozwoju zwierząt. W teście szybkości pompowania gardła młode dorosłe zwierzęta w stadium są testowane na płytkach NGM zawierających APD. Rejestrowana jest liczba pomp gardłowych w jednostce czasu i obliczana jest szybkość pompowania. Testy te mogą być wykorzystywane do badania wielu innych typów małych cząsteczek, a nawet dużych cząsteczek.

1. Wynik testu opóźnienia rozwojowego/letalności
Typowy wynik testu opóźnienia rozwojowego/letalności przedstawiono na rycinach 1a i 1b. Podczas gdy zwierzęta typu dzikiego w grupie kontrolnej osiągnęły stadię dorosłych osobników ciężarnych (rycina 1a), zwierzęta typu dzikiego narażone na klozapinę znajdują się nadal w młodych stadiach larwalnych lub są martwe (rycina 1b). Rycina 1c przedstawia reprezentatywny wy...

Przedstawiono podejścia do testowania działania leków przeciwpsychotycznych (APD) w Caenorhabditis elegans. Opisano testy do testowania wpływu leku na rozwój i żywotność oraz na szybkość pompowania gardła. Metody te mają również zastosowanie w eksperymentach farmakogenetycznych z klasami leków innymi niż APD.

Metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych w Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu leków przeciwpsychotycznych na rozwój i pompowanie gardła przez Sea Elgana. Osiąga się to poprzez najpierw wyhodowanie populacji dorosłych nicieni i wygenerowanie z nich zsynchronizowanej populacji zwierząt. Następnym krokiem jest przeniesienie zsynchronizowanych jaj lub dorosłych osobników na płytki testowe z lekami.Ostatnim krokiem jest obserwacja i ocena wpływu leków na robaki. Ostatecznie wyniki mogą wykazać, że leki przeciwpsychotyczne opóźniają rozwój i hamują pompowanie pokarmu gardłowego u zwierząt narażonych na działanie leków. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mechanizmy działania leków przeciwpsychotycznych, może być również stosowana do badania innych małych cząsteczek, a nawet dużych cząsteczek, takich jak lipidy Przygotuj interesujący Cię lek o znanym stężeniu roboczym.Zacznij od załadowania 12-dołkowej płytki dwoma mililitrami NGM, pożywką na dołek. Odłóż talerz na bok, aby stwardniał w temperaturze pokojowej. Następnie wybierz kolonię bakterii OP 50 i przenieś ją do 50-mililitrowej butelki kultury LB.Bakterie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min następnego dnia do każdego dołka przygotowanej płytki. Przy 20 mikrolitrach kultury bakteryjnej ustaw płytkę do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia. Załaduj każdą dobrze siedzącą osobę 80 mikrolitrami interesującego Cię leku o stężeniu roboczym.W tym przypadku lekiem jest C Klozapina. Pamiętaj, aby zwirować roztwór przed przyjęciem porcji. Zamieszaj roztwór, aby równomiernie rozprowadzić go w studzience i pozwól mu wchłonąć się w temperaturze pokojowej przy zdjętej pokrywie płytki.Następnie kontynuuj test lub przechowuj płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc i rozpocznij test następnego dnia. Zacznij od zebrania jaj z genotypu, który Cię interesuje. Zacznij od populacji robaków z wieloma dorosłymi GR.Zmyj robaki w 3,5-centymetrowej płytce za pomocą bufora M nine. Następnie wiruj je w 15-mililitrowej tubie z prędkością 2000 obr./min przez jedną minutę. Usunąć supernatant przez aspirację i zastąpić go pięcioma mililitrami wybielacza.Następnie delikatnie przekłóć dorosłe osobniki, odwracając rurkę i poczekaj, aż zwierzęta zaczną się rozpuszczać w sposób ciągły. Obserwuj rozpuszczające się robaki pod lunetą. Gdy około połowa robaków się rozpuści.Po około pięciu minutach odkręć probówkę, aby zebrać jaja, odessać supernatant i szybko zastąp go buforem M nine. Następnie ponownie odkręć rurkę w dół, jak poprzednio, i usuń wszystko, z wyjątkiem około 100 mikrolitrów supernatantu M nine. Aby zawiesić jaja, przekręć rurkę wirowo.Następnie przenieś dwa mikrolitry zawiesiny na płytkę NGM i policz liczbę przeniesionych jaj. Następnie załaduj na płytkę potraktowaną lekiem od 30 do 35 jaj na dołek i inkubuj płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po 24 godzinach oceń liczbę wyklutych jaj.Jeśli w którymkolwiek z nich znajduje się więcej niż 25 robaków, dobrze usuń nadmiar robaków. Zwróć robaki na płytce do inkubatora w celu późniejszej obserwacji w odstępach 24-godzinnych każdego dnia, oceń etap rozwoju robaków w studzienkach na podstawie wielkości robaków i kształtu ich sromów. Silne efekty są zwykle widoczne w trzecim i czwartym dniu.Eksperyment powinien trwać około tygodnia. Do tego protokołu przygotuj płytki do testów narkotykowych, jak opisano wcześniej, dzień wcześniej, rozpoczynając test. Wybierz 50 litrów zwierząt czteroetapowych dla każdego genotypu w eksperymencie.Przenieś je na płytki NGM i inkubuj płytki przez 24 godziny w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia, co 15 do 20 minut, załaduj studzienkę testową 10 zwierzętami po tym, jak grupa była wystawiona na działanie leku przez pół godziny. Zacznij obserwować pompowanie ich gardła pod mikroskopem preparacyjnym.Najpierw znajdź robaka, a następnie policz jego pompy gardłowe przez 20 sekund. Po zdobyciu punktów podnieś robaka z talerza. Naciąć wszystkie robaki w studni w ten sam sposób.Oczekiwane wyniki przeprowadzenia opóźnienia eksperymentalnego. Test śmiertelności z kontrolami typu dzikiego powinien wykazać, że w przeciwieństwie do typowego tempa wzrostu do stadium dorosłego, zwierzęta narażone na działanie klozapiny c są nadal w młodych stadiach larwalnych lub są martwe, testowanie mutantów na różnych stężeniach klozapiny ujawniło mutanty supresorowe, takie jak mutanty nieme jeden i mutanty wzmacniające, takie jak MU dwa. Ogólnie rzecz biorąc, śmiertelność niemego pierwszego był niższy niż dzikiego, a śmiertelność MU dwa była wyższa zgodnie z oczekiwaniami w porównaniu z grupą kontrolną, u której przeżyły nieme zwierzęta, które są bardziej zdolne do rozwoju, podczas gdy nieme dwa zwierzęta, które przeżyły, są bardziej opóźnione.Dalsze badania wykazały, że ekspozycja na klozapinę zmniejszała szybkość pompowania gardła w sposób zależny od stężenia. Jednak zmniejszony wskaźnik niemego pierwszego był mniejszy niż w przypadku typu dzikiego, podczas gdy zmniejszony wskaźnik niemego drugiego był większy niż w przypadku typu dzikiego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test leków przeciwpsychotycznych na małą skalę.Wiadomość może być również skalowana w celu przeprowadzenia badań genetycznych na dużą skalę.

methods-for-studying-mechanisms-action-antipsychotic-drugs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych u Caenorhabditis elegans

Niniejszy film demonstruje, w jaki sposób wykorzystać dwa stymulanty neuronalne, aldikarb i pentylenotetrazol (PTZ), w sposób komplementarny do badania funkcji synaptycznych u nicienia C. elegans. To komplementarne podejście może być również wykorzystane do wyjaśnienia ewolucyjnie konserwatywnych mechanizmów modulujących synchronizację neuronalną i ma znaczenie w badaniach nad epilepsją oraz napadami drgawkowymi.

Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej u C. elegans

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

Przedstawiamy tu specyficzny dla Caenorhabditis elegans test zaprojektowany w celu oceny zmian w zachowaniu unikania miedzi i zdolności do zlokalizowania wspólnego źródła pożywienia, w miarę jak organizm przechodzi ze stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.

A Caenorhabditis elegans test oparty na unikaniu miedzi w oparciu o status żywienia

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Ten artykuł opisuje prostą, tanią metodę rejestrowania zachowania Caenorhabditis elegans polegającego na unikaniu trawnika, przy użyciu łatwo dostępnych przedmiotów, takich jak smartfon i kaseton świetlny z diodą elektroluminescencyjną (LED). Udostępniamy również skrypt w języku Python do przetwarzania pliku wideo do formatu bardziej podatnego na zliczanie.

Metoda obrazowania oparta na smartfonach do oznaczania unikania trawników C. elegans

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Poznaj metody badania wpływu leków przeciwpsychotycznych na rozwój i pompowanie gardzieli u Caenorhabditis elegans. Techniki te pozwalają ocenić mechanizm działania substancji farmakologicznych.

Metody badania mechanizmów działania leków przeciwpsychotycznych w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów