Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie badań walcowania komórek ze zwiększoną przepustowością w ściśle kontrolowanym, fizjologicznie istotnym przepływie ścinającym. Osiąga się to za pomocą wielodołkowego systemu mikroprzepływowego, w którym sąsiednie studzienki w specjalistycznej płycie są połączone kanałem mikroprzepływowym. Interfejs systemu łączy pompę elektropneumatyczną z górną częścią płyty wielodołkowej i stosuje ciśnienie pneumatyczne, które kieruje płyn z wnętrza studni przez kanały mikroprzepływowe z określonym natężeniem przepływu.

Gdy kanał mikroprzepływowy zostanie pokryty pożądanym substratem lub monowarstwą komórkową, interesujące komórki są wprowadzane do kanału mikroprzepływowego w celu zbadania ich specyficznych interakcji tocznych z powlekaną powierzchnią, właściwości toczenia komórek podczas interakcji z podłożem lub powierzchnią pokrytą monowarstwą w różnych warunkach eksperymentalnych można następnie przeanalizować za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak równoległa komora przepływowa z płytką, jest to, że technika ta umożliwia badanie właściwości walcowania srebra przy znacznie wyższej przepustowości przy precyzyjnie kontrolowanym, fizjologicznie istotnym przepływie w probówce, przy jednoczesnej minimalizacji zużycia odczynników i komórek. Platforma ta może pomóc w rozwoju egzogennych terapii komórkowych, umożliwiając szybką i dokładną analizę podejść inżynieryjnych zaprojektowanych w celu wpływu na zwijanie i naprowadzanie komórek.

Aby pokryć kanał mikroprzepływowy substratem białkowym, najpierw dodaj 25 do 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu białkowego do wlotu. Cóż, następnie zastosuj samą siłę dwóch posiłków na centymetr kwadratowy przez pięć minut, aby przeniknąć roztwór do kanału. Gdy na wylocie pojawi się kropla cieczy, dobrze zatrzymaj przepływ, inkubuj płytkę przez odpowiedni czas z interesującym białkiem, a następnie odessaj roztwór z każdego z nich. Studnia.

Następnie dodaj od 200 do 500 mikrolitrów PBS do studzienki wylotowej, a następnie zastosuj czysty przepływ dwóch dines na centymetr kwadratowy przez pięć minut, aby umyć kanał i utworzyć monowarstwę komórkową wewnątrz kanału mikroprzepływowego. Rozpocznij od delikatnego trypsynowania komórek będących przedmiotem zainteresowania z szalki hodowlanej przez trzy minuty, zatrzymaj reakcję z podwójną objętością pełnej pożywki, a następnie odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 400 G i rt. Następnie umyj granulkę w 10 mililitrach pełnego podłoża.

Następnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżej pełnej pożywki i policzyć je, dostosować roztwór komórek do odpowiedniego stężenia, a następnie umieścić 25 do 50 mikrolitrów zawiesiny komórek w każdym wlocie. Cóż, teraz umieść płytkę na stoliku mikroskopu i zastosuj czysty przepływ dwóch dines na centymetr kwadratowy, aby przepłynąć komórki do kanału, aż zaobserwujesz, że komórki wypełniają cały kanał. Po zatrzymaniu przepływu napełnij zarówno studnię wylotową, jak i śródlądową 200 mikrolitrami odpowiedniego podłoża komórkowego, a następnie pozwól komórkom osiąść i przylegać w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2.

Po trzech godzinach umyj kanał pełnym nośnikiem, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Komórki powinny być teraz całkowicie zlewające się i gotowe do użycia w celu wywołania zapalnej aktywacji komórek śródbłonka w kanałach. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu TNF alfa do studzienki wlotowej, a następnie wprowadź roztwór do kanału, stosując czysty przepływ dwóch dines na centymetr kwadratowy przez pięć minut.

W przypadku kontrolnych nieaktywowanych kanałów komórek śródbłonka dodaj 100 mikrolitrów pożywki podstawowej komórek śródbłonka do wlotu. Dobrze, aby zablokować selektynę P lub E na powierzchni komórki śródbłonka, wprowadź pięć mikrogramów na mililitr odpowiedniego przeciwciała neutralizującego do kanału i inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj kanały pożywką podstawową przed rozpoczęciem testu walcowania.

Dokładnie zbadaj kanały pod mikroskopem, aby upewnić się, że kanały są odpowiednio pokryte. Następnie przemyć zawiesinę komórek HL 60 pożywką podstawową dwa razy po drugim przemyciu, a następnie ponownie zawiesić komórki w IMDM w stężeniu pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Po dodaniu od 25 do 50 mikrolitrów zawiesiny ogniw do wylotu, dobrze umieść płytkę w uchwycie płytki o kontrolowanej temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieść uchwyt płytki na stoliku mikroskopu.

Wprowadź komórki do kanału mikroprzepływowego. Powinny być obserwowane w ciągu 10 do 15 sekund płynących od wylotu do wlotu. Tutaj można zaobserwować fluorescencyjnie znakowane komórki HL 60, wchodzące w interakcję z powierzchnią zakodowaną w P select, wyświetlającą reakcję toczenia w celu zbadania reakcji toczenia w funkcji naprężenia ścinającego, zmniejszenia ścinania do 0,25 dinów na centymetr kwadratowy i uzyskania od 20 do 32nd filmów za pomocą funkcji akwizycji strumienia w każdym pożądanym ścinaniu, oraz poprzez stopniowe zwiększanie ścinania od 0,25 do pięciu dines na centymetr kwadratowy.

Na koniec użyj kamery CCD, aby uzyskać wideo z testu z akwizycją strumienia 11 klatek na sekundę. Na przykład tutaj pokazano komórkę HL 60 toczącą się na monowarstwie komórek chope. Analizuj ścieżki toczenia i prędkości za pomocą odpowiedniego kompatybilnego oprogramowania.

Komórki HL 60 są uważane za złote standardowe rolki, ponieważ wyrażają różne ligandy naprowadzające, w tym ligandy toczne, P select i glikoproteinowy ligand jeden oraz CI Lewis X.To przetestować możliwości wielodołkowego systemu mikroprzepływowego, liczne kanały mikroprzepływowe zostały pokryte jednocześnie różnymi substratami i interakcjami walcowania komórek HL 60. Po przeanalizowaniu tych substratów komórki wykazywały solidne zachowanie toczenia na zakodowanej powierzchni P select, przy czym komórki najpierw zostały przechwycone z przepływu, a następnie nastąpił wyraźny ruch toczenia. Jak pokazano na tym wykresie i jest to zgodne z literaturą, ogniwa HL 60 wykazują podobne zachowanie toczenia na powierzchniach selektorów e i p, ale nie na podłożach pokrytych FiberInc.

Prędkość komórki, analizowana za pomocą kompatybilnego oprogramowania, została wykreślona w stosunku do czystego naprężenia, wykazując solidną reakcję toczenia komórek na selektorze p i e ze średnią prędkością od jednego do 12 mikronów na sekundę. Aby ocenić wykonalność tego systemu mikroprzepływowego w skutecznym testowaniu interakcji między komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania a monowarstwą komórkową pokrywającą powierzchnię CHO, zastosowano komórki P, które zostały transfekowane w celu stabilnej ekspresji P, ale nie selektyny e, jak pokazano tutaj. Komórki HL 60 wykazują znaczącą odpowiedź toczenia na monowarstwie komórek CHO P w celu sprawdzenia, czy ruch toczenia HL 60 jest rzeczywiście pośredniczony przez pektynę.

Monowarstwa była wstępnie inkubowana z przeciwciałami blokującymi selektynę P lub E przed wprowadzeniem komórek HL 60 do kanału. Jak pokazano na tym wykresie, zablokowanie monowarstwy CHO p za pomocą przeciwciała selektyny P spowodowało znaczny spadek liczby komórek HL 60 toczących się po powierzchni, co pokazuje, że P wybiera i rzeczywiście pośredniczy w toczeniu HL 60. Jak opisano wcześniej, wielodołkowa płytka mikroprzepływowa składa się z wielu oddzielnych kanałów mikroprzepływowych, co pozwala na przeprowadzanie testów z większą przepustowością w wielu różnych warunkach.

Ten korzystny projekt został wykorzystany do umieszczenia komórek śródbłonka w kanałach mikroprzepływowych w celu szybkiej analizy interakcji między komórkami HL 60 a komórkami śródbłonka w różnych warunkach eksperymentalnych w celu symulacji stanów zapalnych, komórki śródbłonka zostały wstępnie potraktowane cytokiną prozapalną TNF alfa, co spowodowało regulację w górę E, ale nie selektyny P na powierzchni komórki śródbłonka. Co ciekawe, komórki HL 60 nie wchodziły w interakcje z inaktywowanymi komórkami śródbłonka i nie zaobserwowano, aby komórki toczyły się po tej powierzchni. Wręcz przeciwnie, komórki HL 60 wykazywały silne zachowanie toczenia na komórkach śródbłonka aktywowanych TNF alfa ze średnią prędkością od pięciu do 15 mikronów na sekundę, aby zbadać udział selektyny p lub E w interakcjach tocznych między komórkami HL 60 a aktywowanymi komórkami śródbłonka.

Komórki śródbłonka aktywowane TNF alfa były wstępnie inkubowane z selektywnym P lub E w przeciwciałach blokujących, a zwijanie komórek HL 60 analizowano, jak pokazano na wykresie Blokowanie wybrane na komórkach śródbłonka TNF alfa spowodowało znaczny spadek liczby komórek toczących się na aktywowanej monowarstwie śródbłonka. Natomiast zastosowanie kontroli izotopowej lub przeciwciała przeciwko pektynie, która nie ulega ekspresji na aktywowanych komórkach śródbłonka, nie miało znaczącego wpływu na toczenie się HL 60 po aktywowanej warstwie śródbłonka. Dane te wskazują na bezpośredni udział selektyny S w HL 60 toczącym się po komórkach śródbłonka aktywowanych TNF alfa, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami.

Oprogramowanie analityczne umożliwia śledzenie ścieżek poszczególnych komórek podczas ich interakcji z powierzchnią. W ten sposób ścieżki poszczególnych komórek podczas interakcji z komórkami śródbłonka aktywowanymi TNF alfa z lub bez e wyboru i blokowania przeciwciał były specjalnie śledzone. Jak pokazano na tym rysunku, liczba toczących się komórek na niezablokowanych aktywowanych komórkach śródbłonka była znacznie wyższa niż na wybranych i zablokowanych aktywowanych komórkach śródbłonka. Co więcej, okazało się, że ruch toczenia komórek HL 60 na niezablokowanych komórkach śródbłonka był ciągły i solidny, podczas gdy ścieżki toczenia komórek na wybranych i zablokowanych komórkach śródbłonka były fragmentowane.

Zgodnie z tym odkryciem, prędkość toczenia komórek HL 60 na niezablokowanych komórkach śródbłonka aktywowanych TNF alfa była znacznie niższa niż prędkość toczenia na wybranych i zablokowanych komórkach śródbłonka. Badanie to demonstruje zastosowanie wieloprzepływowego systemu mikroprzepływowego do wydajnego przeprowadzania eksperymentów walcowania komórek ze zwiększoną przepustowością do 10 gazów walcowych na godzinę przy ściśle kontrolowanym przepływie w rurze. Ogólnie rzecz biorąc, ten system mikroprzepływowy jawi się jako potężna technika badania zwijania komórek, kluczowego aspektu holizywania komórek.

Na przykład nasze laboratorium wykorzystuje obecnie ten system do badań przesiewowych w poszukiwaniu warunków zwiększających naprowadzanie mezenchymalnych komórek macierzystych jako strategii poprawy ich wpływu terapeutycznego.