Name: Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Poznaj systematyczną analizę walcowania komórek in vitro przy użyciu mikroprzepływowego systemu wielodołkowego. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów homingu komórek w kontrolowanym przepływie ścinającym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Komórki CHO-P były miłym prezentem od dr Barbary Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Praca ta była wspierana przez grant Narodowego Instytutu Zdrowia HL095722 dla J.M.K. Praca ta została również częściowo wsparta nagrodą Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award dla J.M.K.

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Ludzkie komórki białaczki promielocytowej (HL-60)
	<ol>
		<li>Hodowla komórek HL-60 w 75 cm2 kolbach z 15 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), uzupełnionego 20% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% (v/v) L-glutaminy i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę co 3 dni, odsysając połowę objętości zawiesiny ogniw i zastępując ją kompletnymi pożywkami IMDM.</li>
		<li>Do barwienia dioctanem karboksyfluoresceiny, estrem sukcynimidylu (CFSE) odwirować zawiesinę komórek HL-60 (400 x g, 5 min), zawiesić w 1 μM roztworze CFSE (przygotowanym we wstępnie podgrzanym PBS) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Następnie odwirować komórki, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżym, podgrzanym podłożu przez 30 minut. Umyj komórki w PBS, a następnie użyj do eksperymentów walcowania (patrz rysunek 1B dla reprezentatywnego obrazu komórek HL-60 barwionych CFSE na powierzchni pokrytej P-sel).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: barwienie CFSE jest opcjonalne i jest tutaj przedstawione w celu zademonstrowania zjawiska toczenia w kanale mikroprzepływowym. Analizę parametrów walcowania przedstawionych w tym artykule przeprowadzono na niebarwionych komórkach przy użyciu standardowego obrazowania w jasnym polu.
<ol start="2">
	<li>Komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc (LMVEC)
	<ol>
		<li>Pokryć szalki Petriego o średnicy 100 mm 0,1% roztworem żelatyny (v/v w PBS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
		<li>Hodowla LMVEC na pokrytych żelatyną 100 mm szalkach Petriego w kompletnym podłożu do wzrostu śródbłonka (śródbłonkowe podłoże podstawowe-2 (EBM-2)), uzupełnione specjalnym zestawem suplementów wzrostu, patrz ODCZYNNIKI). Zmieniaj pożywkę co drugi dzień i komórki subkultury po osiągnięciu 80-90% konfluencji.</li>
		<li>W przypadku subhodowli przemyć komórki PBS, a następnie odłączyć komórki 4 ml 1x Trypsin-EDTA na 3 minuty w temperaturze 37 °C i zneutralizować w równej objętości kompletnej pożywki EBM-2. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować (400 x g, 5 min). Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża śródbłonkowego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Nie należy nadmiernie pasżować komórek, ponieważ wpływa to na ich morfologię i funkcję - do wszystkich eksperymentów należy używać tylko komórek w pasażu 7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="3">
	<li>Komórki selektyny P jajnika chomika chińskiego (CHO-P)
	<ol>
		<li>Komórki CHO-P, które są komórkami CHO stabilnie transfekowanymi w celu ekspresji ludzkiego P-sel, zostały dostarczone przez współpracowników (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School)11,12.</li>
		<li>Hodowla komórek CHO-P w kolbach T175 cm2 w 25 ml pożywki F-12.</li>
		<li>W celu pasażowania przemyć komórki 10 ml PBS przez 4-5 sekund, a następnie trypsynizować w 10 ml 1x Trypsin-EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C, a następnie zneutralizować w pełnym pożywce.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową (400 x g, 5 min), ostrożnie odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pełnej pożywki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Działanie zintegrowanego systemu mikroprzepływowego z płytką wielodołkową
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszystkie urządzenia są prawidłowo podłączone i włącz różne moduły: komputer, kontroler, odwrócony mikroskop i kamerę CCD.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania i upewnij się, że moduł płytki wielodołkowej i moduł obrazowania są prawidłowo wyświetlane na ekranie.</li>
	<li>Podłącz rurki do odwadniacza oparów (podłączonego do sterownika), a także podłącz je do interfejsu ciśnieniowego.</li>
	<li>Umieść płytkę wielodołkową w grzałce/adapterze płytkowym. Dodaj odczynniki do studzienek (opisanych poniżej) i przymocuj interfejs na górze płytki. Umieść płytkę do obrazowania na zautomatyzowanym stoliku.</li>
	<li>Interfejs mocuje się do górnej części płyty i wywiera ciśnienie pneumatyczne ze sterownika na górę studzienek, kierując płyn przez kanały mikroprzepływowe z określonym natężeniem przepływu, łatwo kontrolowanym za pomocą ekranu modułu płyty wielodołkowej w trybie ręcznym.</li>
	<li>Odczynniki w kanale przepływają przez obszar obserwacyjny, znajdujący się między studzienkami. Wymiary kanału mikroprzepływowego to 350 μm szerokości x 70 μm wysokości. Długość kanału liniowego wynosi 1 mm, a dolna część kanałów składa się ze szkła nakrywkowego o grubości 180 μm, które jest kompatybilne z mikroskopią jasnego pola, fazową, fluorescencyjną i konfokalną.</li>
	<li>Nagrywaj filmy za pomocą kamery CCD (akwizycja strumienia, 11 klatek/s) i analizuj je za pomocą kompatybilnego oprogramowania.</li>
</ol>
3. Powlekanie kanałów mikroprzepływowych substratem białkowym lub monowarstwą komórkową
<ol>
	<li>Powlekanie kanału mikroprzepływowego fibronektyną lub selektyną P/E
	<ol>
		<li>Przygotować 1 ml roztworu fibronektyny o stężeniu 20 μg/ml w PBS. Zmieniaj objętość w zależności od liczby kanałów, które mają być pokryte (użyj 25-50 μl fibronektyny na kanał).</li>
		<li>Dodaj 25-50 μl roztworu fibronektyny do każdego dołka wlotowego. Zastosuj siłę tnącą 2 dyn/cm2 przez 5 minut, aby perfować kanał. Proszę zwrócić uwagę na kroplę płynu pojawiającą się w studzience wylotowej. Inkubować przez 30-45 minut w R.T.</li>
		<li>Zassać roztwór ze studzienek (nie zasysać bezpośrednio ze środkowego okręgu zasilającego kanał)1,13. Dodać 200-500 μl PBS do studzienki wylotowej i przepłukać kanał PBS, stosując przepływ ścinający 2 dyn/cm2 przez 5 minut. Kanał jest teraz odpowiednio pokryty fibronektyną i gotowy do użycia.</li>
		<li>W celu pokrycia P- lub E-sel należy przygotować roztwór o stężeniu 5 μg/ml pożądanego ludzkiego rekombinowanego białka w PBS i pokryć kanały zgodnie z powyższym opisem, z 1-godzinną inkubacją w temperaturze 37 °C, aby umożliwić pokrycie powierzchni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie monowarstwy CHO-P lub LMVEC wewnątrz kanału mikroprzepływowego
	<ol>
		<li>Delikatnie trypsynizować komórki z szalek hodowlanych przez 3 minuty, schłodzić przy użyciu 2-krotnej objętości pełnej pożywki i odwirować (5 min przy 400 x g). Zawiesić komórki w 10 ml pełnej pożywki i ponownie odwirować (5 minut przy 400 x g).</li>
		<li>Policz komórki, aby określić stężenie komórek w zawiesinie. Aby zapewnić utworzenie zlewającej się monowarstwy LMVEC wewnątrz kanału, należy doprowadzić stężenie komórek do 15-20 milionów komórek/ml. W przypadku zlewającej się monowarstwy komórek CHO-P użyj 50-60 milionów komórek/ml. Użyj 25-50 μl zawiesiny komórkowej dla każdego kanału - określ odpowiednio początkową liczbę komórek użytych w eksperymencie.</li>
		<li>Dodać 25-50 μl zawiesiny komórek w odpowiednim stężeniu do studzienki wlotowej. Umieścić płytkę na stoliku mikroskopu i wprowadzić komórki do kanału (2 dyn/cm2), aż na ekranie zostaną zaobserwowane komórki wypełniające całe kanały, a następnie zatrzymaj przepływ.</li>
		<li>Napełnij zarówno wylot, jak i wlot 200 μl pełnego podłoża LMVEC lub CHO. Pozwól komórkom osiąść i przylegać przez 3 godziny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
		<li>Po 3-godzinnej inkubacji przemyj kanał pełną pożywką (2 dyn/cm2, 10-15 min) w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek. Komórki powinny teraz wydawać się całkowicie zlewające, a kanał jest teraz gotowy do użycia. W zależności od początkowej gęstości wysiewu komórek, może być wymagane dodatkowe 2-3 godziny czasu osiadania, aby zapewnić całkowite pokrycie powierzchni komórkami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Aktywacja prozapalna LMVEC i blokowanie przeciwciał selektyny P/E-.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór TNF-α (10 ng/ml) w podłożu podstawowym LMVEC.</li>
	<li>Aby wywołać zapalną aktywację LMVEC w kanałach, dodaj 100 μl roztworu TNF-α do studzienki wlotowej i wprowadź roztwór do kanału, stosując przepływ ścinający 2 dyn/cm2 przez 5 minut. W przypadku kanałów kontrolnych (nieaktywowane EC) dodać 100 μl podłoża podstawowego LMVEC do studzienki wlotowej i wprowadzić do kanału (2 dyn/cm2 przez 5 min). Kanał jest teraz gotowy do testu kroczącego.</li>
	<li>Aby zablokować P-sel i E-sel na komórkach LMVEC i CHO-P, należy wprowadzić do kanału przeciwciała neutralizujące P-sel (klon AK4, 5 μg/ml w pożywce podstawowej) lub E-sel (klon P2H3, 5 μg/ml w pożywce podstawowej) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie przemyć kanały pożywką podstawową (2 dyn/cm2 przez 5 min). Kanały są teraz gotowe do testu kroczącego.</li>
</ol>
5. Test walcowania HL-60 na kanałach mikroprzepływowych pokrytych monowarstwą substratu/komórki
<ol>
	<li>Dokładnie zbadaj kanały pod mikroskopem, aby upewnić się, że kanały są prawidłowo pokryte (w przypadku powlekania komórkami należy obserwować w pełni zlewającą się monowarstwę komórek).</li>
	<li>Aby przygotować zawiesinę komórek HL-60 do eksperymentów walcowych, odwirować zawiesinę komórek HL-60 (5 min przy 400 x g) i przemyć raz pożywką podstawową. Policz komórki i ponownie zawieś w IMDM (pożywka podstawowa, zawierająca Ca2+ i Mg2 +), aby utworzyć zawiesinę komórek HL-60 o stężeniu 5 milionów komórek/ml. Użyj 25-50 μl zawiesiny komórek dla każdego kanału, aby przeprowadzić test walcowania.</li>
	<li>Dodać 25-50 μl zawiesiny komórek do studzienki wylotowej, umieścić płytkę w uchwycie płytki o kontrolowanej temperaturze (37 °C) i umieścić na stoliku mikroskopu. Następnie wprowadź komórki do kanału, przykładając siłę ścinającą 2 dyn/cm2 (komórki powinny być obserwowane w ciągu 10-15 sekund przepływając od wylotu do wlotu).</li>
	<li>Aby zbadać reakcję toczenia w funkcji naprężenia ścinającego, zmniejsz ścinanie do 0,25 dyn/cm2 i uzyskaj 20-30 sekund filmów (za pomocą funkcji "akwizycji strumieniowej") dla każdego żądanego ścinania (stopniowo zwiększaj ścinanie od 0,25 do 5 dyn/cm2. Możliwe jest również użycie wyższych nożyc).</li>
	<li>Nagrywaj filmy za pomocą kamery CCD (akwizycja strumienia, 11 klatek/s) i analizuj ścieżki toczenia i prędkości toczenia za pomocą kompatybilnego oprogramowania.</li>
</ol>
6. Cytometria przepływowa do wykrywania ekspresji cząsteczek powierzchniowych
<ol>
	<li>Po trypsynizacji należy przygotować zawiesinę komórkową (używając 1-2 x 105 komórek/próbkę) o pożądanym typie komórek (HL-60, CHO-P lub LMVECs) w PBS (-/-), uzupełnioną 2% FBS. Umyć komórki dwukrotnie i doprowadzić objętość próbki do 50 μl (przy użyciu tego samego buforu).</li>
	<li>Inkubować każdą próbkę z pożądanym sprzężonym z fluoroforem Ab (szczegółowe informacje znajdują się w załączonej tabeli) w temperaturze 4 °C przez 20 minut (przykryć folią aluminiową).</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie (ten sam bufor) i doprowadzić końcową objętość wybarwionej zawiesiny komórek do 200 μl. Analizować próbki za pomocą cytometru przepływowego w celu wykrycia ekspresji cząsteczek powierzchniowych.</li>
</ol>

<ol><li>Conant, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well+plate+microfluidic+system+for+investigation+of+dynamic+platelet+behavior+under+variable+shear+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).</li>
<li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well+plate-coupled+microfluidic+devices+designed+for+facile+image-based+cell+adhesion+and+transmigration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).</li>
<li>Ankrum, J., Karp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapy%3A+Two+steps+forward%2C+one+step+back%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back.</a> Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).</li>
<li>Karp, J. M., Leng Teo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+homing%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details.</a> Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li>
<li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+selectins+in+inflammation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The role of selectins in inflammation and disease.</a> Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).</li>
<li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9(2001).</li>
<li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte%2Fendothelial+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li>
<li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+adhesion+and+aggregation+under+flow+using+microfluidic+flow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells.</a> J. Vis. Exp. (10), e1644(2009).</li>
<li>Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+platelet+P-selectin+and+microparticle+PSGL-1+in+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation.</a> Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).</li>
<li>Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+macrophages+express+both+P-selectin+and+PSGL-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1.</a> J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).</li>
<li>Conant, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+well-plate+microfluidic+devices+to+conduct+shear-based+thrombosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays.</a> J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).</li>
<li>Larsen, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+and+E-selectin.+Distinct+but+overlapping+leukocyte+ligand+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities.</a> J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectin+ligands%3A+will+the+real+ones+please+stand+up%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Selectin ligands: will the real ones please stand up.</a> J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).</li>
<li>Bohnsack, J. F., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+beta+1+integrin+fibronectin+receptors+on+HL60+cells+after+granulocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation.</a> Blood. 83, 543-552 (1994).</li>
<li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+%28CD62L%2CP%2CE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).</li>
<li>Moore, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+glycoprotein+ligand-1+mediates+rolling+of+human+neutrophils+on+P-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin.</a> J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).</li>
<li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+roll+on+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils roll on E-selectin.</a> J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+inducible+expression+of+P-selectin+and+E-selectin+in+mice+and+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates.</a> Blood. 94, 3820-3828 (1999).</li>
<li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoengineering+of+HCELL%2C+the+human+bone+marrow+homing+receptor%3A+sweetly+programming+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. , e1009(2009).</li>
<li>Muller, W. A., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+transendothelial+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assays of transendothelial migration in vitro.</a> Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).</li>
<li>Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).</li>
<li>Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+device+for+high-throughput+viability+screening+of+flow+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New device for high-throughput viability screening of flow biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Selectin ligands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).</li>
<li>Ramos, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+demonstration+of+P-selectin-+and+VCAM-1-dependent+mononuclear+cell+rolling+in+early+atherosclerotic+lesions+of+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+1-derived+O-glycans+are+essential+E-selectin+ligands+on+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-selectin+engages+PSGL-1+and+CD44+through+a+common+signaling+pathway+to+induce+integrin+alphaLbeta2-mediated+slow+leukocyte+rolling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling.</a> Blood. 116, 485-494 (2010).</li>
<li>Simone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rolling+and+adhesion+on+surfaces+in+shear+flow.+A+model+for+an+antibody-based+microfluidic+screening+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectronic+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system.</a> Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).</li>
<li>Perozziello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+modulate+tumor+cell+line+susceptibility+to+NK+cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition.</a> Small. 8, 2886-2894 (2012).</li>
<li>Perozziello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+biofunctionalisation+protocols+to+form+multivalent+interactions+for+cell+rolling+and+phenotype+modification+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations.</a> Electrophoresis. , (2013).</li>
<li>Simone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+in+situ+microfluidic+method+for+creating+multivalent+surfaces%3A+toward+functional+glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics.</a> Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).</li>
<li>Sarkar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+cell+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered cell homing.</a> Blood. 118, e184-e191 (2011).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Migration+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Modified+With+CXCR4+Gene+to+Infarcted+Myocardium+Improves+Cardiac+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance.</a> Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).</li>
<li>Enoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+mesenchymal+cell+engraftment+by+IGF-1+improves+left+ventricular+function+in+rats+undergoing+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction.</a> Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Jednym z głównych wyzwań w skutecznej translacji terapii opartej na komórkach egzogennych jest niezdolność do skutecznego dostarczania komórek do miejsc urazów i stanów zapalnych z wysoką skutecznością wszczepienia3. Walcowanie komórek stanowi krytyczny krok w procesie naprowadzania komórek, ułatwiając spowalnianie komórek na ścianach naczyń krwionośnych, ostatecznie prowadząc do ich mocnego przylegania i transmigracji przez śródbłonek do tkanki5. Lepsze zrozumienie procesu walcowania dla typów komó...

Jednym z głównych wyzwań w udanym klinicznym translacji terapii komórkowej jest nieefektywne dostarczanie lub kierowanie komórek podawanych systemowo do pożądanych miejsc3,4. W związku z tym nieustannie poszukuje się podejść do poprawy naprowadzania komórek, a w szczególności rolowania komórek, jako strategii poprawy terapii komórkowej. Zwijanie się komórek na naczyniach krwionośnych jest kluczowym krokiem w kaskadzie naprowadzania komórek, klasycznie zdefiniowanej dla leukocytów, które są rekrutowane do miejsc chorobowych5. Etap ten jest regulowany przez specyficzne oddziaływania między selektorynami śródbłonka, tj. selektyną P i E (P- i E-sel) a ich przeciwligandami na powierzchni leukocytów5,6. Lepsze zrozumienie i poprawa skuteczności naprowadzania komórek, a w szczególności etapu kroczącego, mają ogromne znaczenie w poszukiwaniu nowych platform do ulepszania terapii opartej na komórkach. Do tej pory osiągano to poprzez stosowanie równoległych płytowych komór przepływowych (PPFC), składających się z dwóch płaskich płyt z uszczelką między nimi, z portem dolotowym i odpływowym umieszczonym na górnej płycie, przez który zawiesina komórek jest perfektywna za pomocą pompy strzykawkowej7,8,9. Powierzchnia dolnej płyty może być pokryta odpowiednią monowarstwą/substratami komórkowymi, a następnie badana jest interakcja między perfundowanymi komórkami a powierzchnią pod wpływem przepływu ścinającego7. Jednak PPFC jest metodą o niskiej przepustowości, zużywającą odczynniki i dość żmudną, z tworzeniem się pęcherzyków, wyciekiem i słabo kontrolowanym przepływem, co stanowi poważne wady.
Alternatywną techniką dla tradycyjnego PPFC jest wielodołkowy system mikroprzepływowy, pozwalający na wyższą przepustowość testów komórkowych (do 10 razy wyższą niż PPFC) przy dokładnym, sterowanym komputerowo przepływie ścinającym, przy niskim zużyciu odczynników1,10. Eksperymenty z walcowaniem komórek są przeprowadzane wewnątrz kanałów mikroprzepływowych, które mogą być pokryte monowarstwami komórek lub zmodyfikowanymi podłożami i obrazowane za pomocą mikroskopu, a właściwości walcowania można łatwo przeanalizować za pomocą odpowiedniego oprogramowania. W tym badaniu demonstrujemy możliwości tego wielodołkowego systemu mikroprzepływowego z płytką, badając właściwości toczenia komórek ludzkiej białaczki promielocytowej (HL-60) na różnych powierzchniach. Przeanalizowano toczenie HL-60 na podłożach takich jak P-i E-sel, a także na monowarstwach komórkowych wyrażających różne receptory toczenia. Ponadto zastosowano blokowanie przeciwciał (Ab) w celu wykazania bezpośredniego udziału określonych selektyn w pośredniczeniu w ruchu toczenia HL-60 na tych powierzchniach. Eksperymenty walcowania przeprowadzono ze zwiększoną przepustowością, przy stabilnym przepływie ścinającym, przy minimalnym zużyciu odczynników/komórek, co pozwoliło na efektywną analizę kluczowych parametrów walcowania, takich jak prędkość walcowania, liczba komórek walcowania i właściwości ścieżki walcowania.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka płuc</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>Komórki jajnika chomika chińskiego z ekspresją selektyny P (CHO-P)</td><td>Uprzejmy prezent od dr Barbary Furie11,12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HL-60 Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture Reagents</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Śródbłonkowe suplementy podłoża podstawowego</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV SingleQuots</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>IMDM - Zmodyfikowany Dulbecco's Medium firmy Iscove 1x</td><td>Gibco</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>F-12 (1x) Mieszanka składników odżywczych (szynka)</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna (P / S)</td> <td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (L / G) 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td> <td>Atlanta Biologicals</td><td>Sa550</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>BD Falcon</td><td>BD-353003</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie do hodowli komórkowych, polistyren</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>poddany kulturze tkankowejProbówki wirówkowe (15 ml polipropylenowe probówki stożkowe)</td><td>Kolby MedSupply Partners</td><td>TC1500</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny (2%)</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>dPBS (bez chlorku wapnia i chlorku magnezu)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA (10x)</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciała</td></tr><tr><td>Anti-hE-Selectin/CD62E</td><td>R& D Systems</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>FITC Sprzężona mysz IgG1</td><td>R& D Systems</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>Anty-hP-Selectin</td><td>R& D Systems</td><td>BBA34</td><td></td></tr><tr><td>FITC Sprzężona mysz IgG1</td><td>R& D Systems</td><td>BBA34</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz IgG&shy; 1 &kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Bioscience</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SLeX / CD15s Ab, klon: 5F18</td><td>Santa Cruz</td><td>SC70545</td><td></td></tr><tr><td>FITC Sprzężony</td><td>Santa Cruz</td><td>SC70545</td><td></td></tr><tr><td>Normalna kontrola izotypu myszy IgM-FITC</td> Santa <td>Cruz</td><td>SC2859</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz Anti-Human CD162, klon: KPL-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>556055</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse IgG1 k Kontrola izotypu</td><td>BD Pharmingen</td><td>550617</td><td></td></tr><tr><td>Anti-P-Selectin Ab (AK4)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC19996</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-Selectin Ab, klon P2H3</td><td>Millipore</td><td>MAB2150</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Isotype Control</td><td>Santa Cruz</td><td>SC3877</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inne odczynniki</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TNF-alfa</td><td>PeproTech</td><td>300-01A</td> Zestaw do proliferacji komórek śladowych <td></td></tr><tr><td>CFSE - do cytometrii przepływowej</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane P-selectin-FC</td><td>R& D Systems</td><td>137-PS-050</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane E-selektyna-FC</td><td>R& D Systems</td><td>724-ES-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Human, Plasma</td><td>Invitrogen</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Bioflux 1000</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>Bioflux Montage było oprogramowaniem używanym do przeprowadzania eksperymentów i analizy danych</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux 48-dołkowe płytki</td><td>Fluxion Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Flow Cytometr</td><td>BD Bioscience</td><td>CFlow Plus był oprogramowaniem używanym do przeprowadzania eksperymentów i analizy danych</td><td></td></tr> Aparat CCD <tr><td>Nikon Eclipse Ti-S</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2</td><td>Fotometria</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Głównym wyzwaniem dla terapii opartej na komórkach jest niemożność systemowego ukierunkowania dużej ilości żywotnych komórek z wysoką skutecznością do tkanek będących przedmiotem zainteresowania po infuzji dożylnej lub dotętniczej. W związku z tym zwiększenie naprowadzania komórek jest obecnie badane jako strategia poprawy terapii komórkowej. Zwijanie się komórek po śródbłonku naczyń krwionośnych jest ważnym krokiem w procesie naprowadzania komórek i może być badane in vitro przy użyciu komory z przepływem równoległym (PPFC). Jest to jednak niezwykle żmudny, niskoprzepustowy test, ze słabo kontrolowanymi warunkami przepływu. Zamiast tego zastosowaliśmy wielodołkowy system mikroprzepływowy płytkowy, który umożliwia badanie właściwości walcowania komórkowego przy wyższej przepustowości przy precyzyjnie kontrolowanym, fizjologicznie istotnym przepływie ścinającym1,2. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób można łatwo zbadać właściwości toczenia komórek HL-60 (ludzka białaczka promielocytowa) na powierzchniach pokrytych selektyną P i E, a także na powierzchniach pokrytych jednowarstwą komórek. Aby lepiej symulować stany zapalne, powierzchnię kanału mikroprzepływowego pokryto komórkami śródbłonka (EC), które następnie aktywowano czynnikiem martwicy nowotworu-α (TNF-α), znacznie zwiększając interakcje z komórkami HL-60 w warunkach dynamicznych. Zwiększona przepustowość i zintegrowana wieloparametrowa platforma analizy oprogramowania, która umożliwia szybką analizę parametrów, takich jak prędkość toczenia i ścieżka walcowania, są ważnymi zaletami w ocenie właściwości walcowania komórek in vitro. Umożliwiając szybką i dokładną analizę podejść inżynieryjnych zaprojektowanych w celu wpływu na zwijanie i naprowadzanie komórek, platforma ta może pomóc w rozwoju terapii opartej na komórkach egzogennych.

Komórki HL-60 toczą się po powierzchniach P- i E-selektyny, ale nie po fibronektynie
Komórki HL-60 są uważane za złote standardowe "rolki", ponieważ wyrażają różne samonaprowadzające się ligandy, w tym toczące się ligandy glikoproteiny P-sel ligand-1 (PSGL-1) i Sialyl-Lewis X (SLeX)5,14 (Rysunek 1A). Białko powierzchniowe PSGL-1 działa jak rusztowanie dla tetrasacharydu SLeX, pośrednicząc w specyficznej interakcji z P- i E-sel, które są regulowane w górę na śródbłonku ...

To badanie wykorzystało wielodołkowy system mikroprzepływowy, znacznie zwiększając przepustowość badań toczenia komórek pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym. Biorąc pod uwagę znaczenie zwijania komórek w wieloetapowej kaskadzie naprowadzania komórek oraz znaczenie naprowadzania komórek po ogólnoustrojowym dostarczeniu egzogennych populacji komórek u pacjentów, system ten oferuje potencjał jako platforma przesiewowa w celu ulepszenia terapii opartej na komórkach.

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie badań walcowania komórek ze zwiększoną przepustowością w ściśle kontrolowanym, fizjologicznie istotnym przepływie ścinającym. Osiąga się to za pomocą wielodołkowego systemu mikroprzepływowego, w którym sąsiednie studzienki w specjalistycznej płycie są połączone kanałem mikroprzepływowym. Interfejs systemu łączy pompę elektropneumatyczną z górną częścią płyty wielodołkowej i stosuje ciśnienie pneumatyczne, które kieruje płyn z wnętrza studni przez kanały mikroprzepływowe z określonym natężeniem przepływu.Gdy kanał mikroprzepływowy zostanie pokryty pożądanym substratem lub monowarstwą komórkową, interesujące komórki są wprowadzane do kanału mikroprzepływowego w celu zbadania ich specyficznych interakcji tocznych z powlekaną powierzchnią, właściwości toczenia komórek podczas interakcji z podłożem lub powierzchnią pokrytą monowarstwą w różnych warunkach eksperymentalnych można następnie przeanalizować za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak równoległa komora przepływowa z płytką, jest to, że technika ta umożliwia badanie właściwości walcowania srebra przy znacznie wyższej przepustowości przy precyzyjnie kontrolowanym, fizjologicznie istotnym przepływie w probówce, przy jednoczesnej minimalizacji zużycia odczynników i komórek. Platforma ta może pomóc w rozwoju egzogennych terapii komórkowych, umożliwiając szybką i dokładną analizę podejść inżynieryjnych zaprojektowanych w celu wpływu na zwijanie i naprowadzanie komórek.Aby pokryć kanał mikroprzepływowy substratem białkowym, najpierw dodaj 25 do 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu białkowego do wlotu. Cóż, następnie zastosuj samą siłę dwóch posiłków na centymetr kwadratowy przez pięć minut, aby przeniknąć roztwór do kanału. Gdy na wylocie pojawi się kropla cieczy, dobrze zatrzymaj przepływ, inkubuj płytkę przez odpowiedni czas z interesującym białkiem, a następnie odessaj roztwór z każdego z nich. Studnia.Następnie dodaj od 200 do 500 mikrolitrów PBS do studzienki wylotowej, a następnie zastosuj czysty przepływ dwóch dines na centymetr kwadratowy przez pięć minut, aby umyć kanał i utworzyć monowarstwę komórkową wewnątrz kanału mikroprzepływowego. Rozpocznij od delikatnego trypsynowania komórek będących przedmiotem zainteresowania z szalki hodowlanej przez trzy minuty, zatrzymaj reakcję z podwójną objętością pełnej pożywki, a następnie odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 400 G i rt. Następnie umyj granulkę w 10 mililitrach pełnego podłoża.Następnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżej pełnej pożywki i policzyć je, dostosować roztwór komórek do odpowiedniego stężenia, a następnie umieścić 25 do 50 mikrolitrów zawiesiny komórek w każdym wlocie. Cóż, teraz umieść płytkę na stoliku mikroskopu i zastosuj czysty przepływ dwóch dines na centymetr kwadratowy, aby przepłynąć komórki do kanału, aż zaobserwujesz, że komórki wypełniają cały kanał. Po zatrzymaniu przepływu napełnij zarówno studnię wylotową, jak i śródlądową 200 mikrolitrami odpowiedniego podłoża komórkowego, a następnie pozwól komórkom osiąść i przylegać w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2.Po trzech godzinach umyj kanał pełnym nośnikiem, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Komórki powinny być teraz całkowicie zlewające się i gotowe do użycia w celu wywołania zapalnej aktywacji komórek śródbłonka w kanałach. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu TNF alfa do studzienki wlotowej, a następnie wprowadź roztwór do kanału, stosując czysty przepływ dwóch dines na centymetr kwadratowy przez pięć minut.W przypadku kontrolnych nieaktywowanych kanałów komórek śródbłonka dodaj 100 mikrolitrów pożywki podstawowej komórek śródbłonka do wlotu. Dobrze, aby zablokować selektynę P lub E na powierzchni komórki śródbłonka, wprowadź pięć mikrogramów na mililitr odpowiedniego przeciwciała neutralizującego do kanału i inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj kanały pożywką podstawową przed rozpoczęciem testu walcowania.Dokładnie zbadaj kanały pod mikroskopem, aby upewnić się, że kanały są odpowiednio pokryte. Następnie przemyć zawiesinę komórek HL 60 pożywką podstawową dwa razy po drugim przemyciu, a następnie ponownie zawiesić komórki w IMDM w stężeniu pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Po dodaniu od 25 do 50 mikrolitrów zawiesiny ogniw do wylotu, dobrze umieść płytkę w uchwycie płytki o kontrolowanej temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieść uchwyt płytki na stoliku mikroskopu.Wprowadź komórki do kanału mikroprzepływowego. Powinny być obserwowane w ciągu 10 do 15 sekund płynących od wylotu do wlotu. Tutaj można zaobserwować fluorescencyjnie znakowane komórki HL 60, wchodzące w interakcję z powierzchnią zakodowaną w P select, wyświetlającą reakcję toczenia w celu zbadania reakcji toczenia w funkcji naprężenia ścinającego, zmniejszenia ścinania do 0,25 dinów na centymetr kwadratowy i uzyskania od 20 do 32nd filmów za pomocą funkcji akwizycji strumienia w każdym pożądanym ścinaniu, oraz poprzez stopniowe zwiększanie ścinania od 0,25 do pięciu dines na centymetr kwadratowy.Na koniec użyj kamery CCD, aby uzyskać wideo z testu z akwizycją strumienia 11 klatek na sekundę. Na przykład tutaj pokazano komórkę HL 60 toczącą się na monowarstwie komórek chope. Analizuj ścieżki toczenia i prędkości za pomocą odpowiedniego kompatybilnego oprogramowania.Komórki HL 60 są uważane za złote standardowe rolki, ponieważ wyrażają różne ligandy naprowadzające, w tym ligandy toczne, P select i glikoproteinowy ligand jeden oraz CI Lewis X.To przetestować możliwości wielodołkowego systemu mikroprzepływowego, liczne kanały mikroprzepływowe zostały pokryte jednocześnie różnymi substratami i interakcjami walcowania komórek HL 60. Po przeanalizowaniu tych substratów komórki wykazywały solidne zachowanie toczenia na zakodowanej powierzchni P select, przy czym komórki najpierw zostały przechwycone z przepływu, a następnie nastąpił wyraźny ruch toczenia. Jak pokazano na tym wykresie i jest to zgodne z literaturą, ogniwa HL 60 wykazują podobne zachowanie toczenia na powierzchniach selektorów e i p, ale nie na podłożach pokrytych FiberInc.Prędkość komórki, analizowana za pomocą kompatybilnego oprogramowania, została wykreślona w stosunku do czystego naprężenia, wykazując solidną reakcję toczenia komórek na selektorze p i e ze średnią prędkością od jednego do 12 mikronów na sekundę. Aby ocenić wykonalność tego systemu mikroprzepływowego w skutecznym testowaniu interakcji między komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania a monowarstwą komórkową pokrywającą powierzchnię CHO, zastosowano komórki P, które zostały transfekowane w celu stabilnej ekspresji P, ale nie selektyny e, jak pokazano tutaj. Komórki HL 60 wykazują znaczącą odpowiedź toczenia na monowarstwie komórek CHO P w celu sprawdzenia, czy ruch toczenia HL 60 jest rzeczywiście pośredniczony przez pektynę.Monowarstwa była wstępnie inkubowana z przeciwciałami blokującymi selektynę P lub E przed wprowadzeniem komórek HL 60 do kanału. Jak pokazano na tym wykresie, zablokowanie monowarstwy CHO p za pomocą przeciwciała selektyny P spowodowało znaczny spadek liczby komórek HL 60 toczących się po powierzchni, co pokazuje, że P wybiera i rzeczywiście pośredniczy w toczeniu HL 60. Jak opisano wcześniej, wielodołkowa płytka mikroprzepływowa składa się z wielu oddzielnych kanałów mikroprzepływowych, co pozwala na przeprowadzanie testów z większą przepustowością w wielu różnych warunkach.Ten korzystny projekt został wykorzystany do umieszczenia komórek śródbłonka w kanałach mikroprzepływowych w celu szybkiej analizy interakcji między komórkami HL 60 a komórkami śródbłonka w różnych warunkach eksperymentalnych w celu symulacji stanów zapalnych, komórki śródbłonka zostały wstępnie potraktowane cytokiną prozapalną TNF alfa, co spowodowało regulację w górę E, ale nie selektyny P na powierzchni komórki śródbłonka. Co ciekawe, komórki HL 60 nie wchodziły w interakcje z inaktywowanymi komórkami śródbłonka i nie zaobserwowano, aby komórki toczyły się po tej powierzchni. Wręcz przeciwnie, komórki HL 60 wykazywały silne zachowanie toczenia na komórkach śródbłonka aktywowanych TNF alfa ze średnią prędkością od pięciu do 15 mikronów na sekundę, aby zbadać udział selektyny p lub E w interakcjach tocznych między komórkami HL 60 a aktywowanymi komórkami śródbłonka.Komórki śródbłonka aktywowane TNF alfa były wstępnie inkubowane z selektywnym P lub E w przeciwciałach blokujących, a zwijanie komórek HL 60 analizowano, jak pokazano na wykresie Blokowanie wybrane na komórkach śródbłonka TNF alfa spowodowało znaczny spadek liczby komórek toczących się na aktywowanej monowarstwie śródbłonka. Natomiast zastosowanie kontroli izotopowej lub przeciwciała przeciwko pektynie, która nie ulega ekspresji na aktywowanych komórkach śródbłonka, nie miało znaczącego wpływu na toczenie się HL 60 po aktywowanej warstwie śródbłonka. Dane te wskazują na bezpośredni udział selektyny S w HL 60 toczącym się po komórkach śródbłonka aktywowanych TNF alfa, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami.Oprogramowanie analityczne umożliwia śledzenie ścieżek poszczególnych komórek podczas ich interakcji z powierzchnią. W ten sposób ścieżki poszczególnych komórek podczas interakcji z komórkami śródbłonka aktywowanymi TNF alfa z lub bez e wyboru i blokowania przeciwciał były specjalnie śledzone. Jak pokazano na tym rysunku, liczba toczących się komórek na niezablokowanych aktywowanych komórkach śródbłonka była znacznie wyższa niż na wybranych i zablokowanych aktywowanych komórkach śródbłonka. Co więcej, okazało się, że ruch toczenia komórek HL 60 na niezablokowanych komórkach śródbłonka był ciągły i solidny, podczas gdy ścieżki toczenia komórek na wybranych i zablokowanych komórkach śródbłonka były fragmentowane.Zgodnie z tym odkryciem, prędkość toczenia komórek HL 60 na niezablokowanych komórkach śródbłonka aktywowanych TNF alfa była znacznie niższa niż prędkość toczenia na wybranych i zablokowanych komórkach śródbłonka. Badanie to demonstruje zastosowanie wieloprzepływowego systemu mikroprzepływowego do wydajnego przeprowadzania eksperymentów walcowania komórek ze zwiększoną przepustowością do 10 gazów walcowych na godzinę przy ściśle kontrolowanym przepływie w rurze. Ogólnie rzecz biorąc, ten system mikroprzepływowy jawi się jako potężna technika badania zwijania komórek, kluczowego aspektu holizywania komórek.Na przykład nasze laboratorium wykorzystuje obecnie ten system do badań przesiewowych w poszukiwaniu warunków zwiększających naprowadzanie mezenchymalnych komórek macierzystych jako strategii poprawy ich wpływu terapeutycznego.

systematic-analysis-vitro-cell-rolling-using-multi-well-plate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy raport przedstawia wizualizację analizy w komorze przepływowej z równoległymi płytkami, służącej do badania oddziaływań leukocytów z śródbłonkiem w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w badaniu roli selektyny E (E-selectin) oraz ligandów selektyny E na leukocytach, które inicjują toczenie się leukocytów po powierzchniach komórek śródbłonka.

Analiza fizjologicznego toczkowania leukocytów zapśredniczonego przez E-selektynę na śródbłonku mikrokrążenia

Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznym wzorem receptorów. Uzyskane dane są przydatne przy projektowaniu podłoży z wzorem receptorów do bezznakowej separacji i analizy komórek.

Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Migracja komórek jest niezbędna do rozwoju, utrzymania i naprawy tkanek oraz nowotworzenia, a także jest regulowana przez czynniki wzrostu, chemokiny i cytokiny. Protokół ten opisuje test punktowy, dwuwymiarowy, nieograniczony test migracji w celu oceny fenotypu migracyjnego dołączonych, spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe.

Wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek

Tutaj opisujemy użycie wysokoprzepustowego bioreaktora mikroprzepływowego połączonego z mikroskopem fluorescencyjnym do analizy wpływu naprężeń ścinających na biofilmy Pseudomonas aeruginosa wyrażające białka zielonej fluorescencji, w tym ustawienie instrumentu, określenie pokrycia biofilmu, tempa wzrostu i właściwości morfologicznych.

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Ten protokół opisuje metodę powlekania w celu ograniczenia wzrostu komórek śródbłonka do określonego obszaru 6-dołkowej płytki w celu przyłożenia naprężeń ścinających przy użyciu modelu wytrząsarki orbitalnej.

Segmentacja wzrostu komórek śródbłonka w 6-dołkowych płytkach na wytrząsarce orbitalnej do badań mechanobiologicznych

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

Poznaj systematyczną analizę walcowania komórek in vitro przy użyciu mikroprzepływowego systemu wielodołkowego. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów homingu komórek w kontrolowanym przepływie ścinającym.

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

Przeglądaj więcej filmów